电镜技术-第5次课

第三章超薄切片术

(the Techniques of Ultrathin Section)

超薄切片术是最基本的透射电镜样品制备技术，需要借助超薄切片机制备样品，切片的厚度小100nm(一般30~70nm)，被广泛用于揭示样品的超微结构。超薄切片术也是电镜细胞化学、免疫电镜、电镜放射自显影、X-射线微区元素分析等技术的基础，是研究生物医学样品的超微结构及其功能的有力工具。它分为普通超薄切片术和冷冻超薄切片术两大类。

取材固定脱水浸透包埋聚合切片染色

电镜样品必须满足一些基本的条件才能用于观察

第一为保持电镜工作真空和样品在真空下不损伤，样品必须彻底干燥。

第二电镜所成的图像是黑白图像，要求图像有一定的反差，而生物样品提供的反差低，样品要进行提高反差的处理，如电子染色和金属喷镀等方法。

第三电子的穿透能力是较低的，再加上电镜的高分辨本领，切片太厚，各层清晰结构重叠，都会使图像模糊。所以要求透射电镜样品一定要薄。同时考虑到反差，一般认为在

50~1OOkV加速电压范围内，5OO左右的厚度是切片实际可用的厚度。

第四样品应该能耐受电子束的强烈照射，在电镜观察程中不发生变形和升华等损伤。

制备好的超薄切片，应该满足如下要求

细胞的精细结构保存良好，没有产生明显的物质的凝集、丢失或添加等人工效应

切片厚度应为500Ǻ左右，最多不超过1000Ǻ

切片能耐受电子束的强烈照射

电镜观察过程中，包埋介质不发生变形或升华

切片应具有良好的反差

切片均匀，并且没有皱摺、刀痕及染色剂沉淀等缺陷

超薄切片主要步骤

杀死组织，同时把从细胞间的联系直至细胞器的分子结构的全部组织的精细结构真实地保存下来2.脱水从组织中除去游离水分，并用一种既能和水又能和渗透液相混的惰性液体取代组织中的水。3.块染使组织某些成分结合重金属离子，引起电子散射能力差异，提高超微结构电镜图像的反差。4.渗透和包埋用另一种溶液或混合液取代脱水液。它们很容易硬化成固体，并且有足够的弹性，以切出5OOA的平薄切片。５.聚合渗入组织里的包埋液变硬，以便形成一个能牢固地支持组织的固态基质，而不混乱其空间联系。６.切片将带有组织的固态基质(称为“包埋块”）切成500 Ǻ左右的超薄切片。７.安放把单张或切片带移到样品支持载网上，以便放入电子显微镜中观察８.切片染色使载网上切片和重金属溶液反应，以增加组织成分的电子散射能力９.镜检把有样品切片的载网放人电子显微镜中观察，可得到样品的电子显微镜图像和照片。

锇酸固定醛类固定缓冲液清洗取材缓冲液清洗80%70样品

化学固定脱水90%100%

修块

超薄切片

染色

超薄切片的样品制备流程

一、取材

准备工作取材原则

准备工作取材时需准备各种溶液、玻璃器皿及器件所需溶液主要有缓冲液，戊二醛、锇酸固定液，梯度浓度脱水剂,如30%丙酮，50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，95%丙酮及100%丙酮

分别用于滴加戊二醛、缓冲液、锇酸、脱水剂、包埋剂、废弃溶液的玻璃吸管，小称量瓶，载玻片和封口膜，双面刀片和医用剪刀，普通镊子及游丝尖镊，用于转移组织的牙签。此外，还需准备双目解剖镜为得到超微结构保存良好的样品，从第一步取材就需重视操作中应注意的问题，如选择锋利切割器械、织块大小适中、固定液温度适宜等

取材原则动作迅速组织离体后，应将其快速放人化学固定液内，使组织和细胞尽可能保持原来的生活状态。（动物材料半分钟或最多2分钟内）减小损伤选择锋利切割器械，避免或尽量减少牵拉或挤压组织。组织块小为使组织得到均匀而充分固定，所取材料一般要小于lmm3。低温操作为减少对组织细胞酶活性的破坏，最好在4℃下操作，所用容器、器械及戊二醛固定液均需预冷。在血液供给停止后，防止组织和细胞内各种酶的作用使组织发生自溶，降解组织中蛋白、核酸等主要成分。

二、固定固定的定义和目的固定方法影响固定效果的因素

固定剂常用的固定操作法

1.固定的定义和目的

定义：固定是指用物理或者化学的方法迅速杀死细胞的过程。

目的：防止组织细胞的离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致。在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不致溶解和流失。为样品以后的处理（包括染色和和经受电子束轰击）作准备，使其组织适当地硬化。

2.固定方法

（1）物理固定法用高温、冷冻、微波、干燥等物理手段，使细胞结构固定。

（2）化学固定法采用化学试剂来固定细胞结构。这种方法应用的较广泛。常用的固定剂有甲醛、戊二醛、四氧化锇、高锰酸钾及重铬酸钾等等在化学固定中，固定液和样品作用，使细架间的流动蛋白质凝固，以保存各种细胞器的空间联系。同时，使细胞的所有组成成分，如核酸、蛋白质、核蛋白、糖类和脂类等变为不可溶解的物质。另外，固定剂中常有重金属原子，其和组织成分用，可提高电子反差。

３.影响固定效果的因素固定液的渗透速度固定液浓度固定温度固定时间组织块大小固定液pH 固定液渗透压缓冲液

（1）固定液的渗透速度

理想的固定液应能快速将组织细胞杀死，并使之收缩和膨胀量最小。细胞被杀死的速度主要取决于固定液渗透组织的速率。常用固定液中，甲醛渗透速率>戊二醛>锇酸。 4mm/h >

2mm/h >(0.1～０.5)mm/(1～１.5)h 组织在室温下固定的渗透速率比在冷环境下快得多; 增加固定液浓度及固定时间，可增强渗透速率;灌注固定也是加快渗透速率的有效途径。

致密组织会使固定液渗入缓慢，组织内空气多或表面含蜡，也会阻碍固定液渗入，甚至使组织漂浮在固定液面上。出现这种情况，可在固定前抽气，或用稀释

的去垢剂处理。

（2）固定液浓度

组织细胞中蛋白质之间的交联受固定液浓度影响较大。若固定液浓度过低，则需较长时间固定，这易引起组织中酶的扩散，造成细胞物质的抽提。

过高浓度固定液，尤其氧化固定剂类易损坏酶活性和细胞结构，使细胞过度收缩。因此，对锇酸浓度的限制较为严格。戊二醛固定液浓度控制范围1.5%~4%。当需保存含水样品如胚胎组织，或泡状物较多的肺组织时，可用稍高浓度的固定液。

（3）固定温度戊二醛固定液与组织之间发生的反应随温度增加而强。室温下固定组织，可提高固定液渗透速率，较好保存细胞中的微丝和微管。低温下固定组织，可减小线粒体和细胞质颗粒体积变化，降低酶的活性，减少细胞自溶及胞内物质的抽提。灌注固定取