成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32

CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2）

（1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，

云南昆明650031）

［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞．

［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化

［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04

Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult

Rat s

LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2）

（1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China）

［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies.

［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

第32卷

昆明医学院学报

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海马神经细胞培养逐渐广泛应用在神经细胞和发育生物学研究中．建立海马神经细胞培养模型可为研究海马相关老年性疾病提供实验技术支持．而目前的研究中，大多报道的是新生大鼠或者胎鼠海马神经元培养方法[1-3]．成年海马神经元培养因难度较大，报道不多．而在海马相关性疾病中，海马的变化大多发生在成年或者老年[4-6]．因此，用成年海马神经细胞来研究海马衰老相关疾病有更为重要的科学价值．本实验获取成年小鼠海马，制备细胞悬液，接种于培养板，观察成年海马神经细胞体外生长特性，为研究衰老相关疾病提供体外细胞模型．

1实验方法

1.1所需设备及仪器

（1）实验仪器：超净工作台、培养箱、解剖显微镜、倒置显微镜、离心机；（2）实验器械：显微镊、扁平尖镊、大剪刀、小剪刀、血管钳、弯镊.（3）培养用具：培养皿、数根长玻璃吸管、离心管、橡胶吸头、1mL、200μL、20μL枪头、培养板.（4）培养试剂：消毒三蒸水、D-Hanks 液、多聚赖氨酸、层粘连蛋白、小牛血清、马血清、M EM培养基、谷氨酰氨、碳酸氢钠、葡萄糖．（5）实验动物：年龄在1岁左右的小鼠．1.2溶液的制备

（1）多聚赖氨酸-层粘连蛋白的制备：将多聚赖氨酸用无菌三蒸水配成0.01%的溶液，用无菌MS液配成0.01%的层粘连蛋白，然后按50mL 0.01%的多聚赖氨酸加2mL0.01%的层粘连蛋白溶液．将此液包被24孔培养板于每孔加入200μL，置37℃的温箱内4h或室温下过夜后吸出多余液体，再用无菌三蒸水充分漂洗4～5遍，待干备用；（2）阿糖胞苷的制备：称取0.01g的阿糖胞苷加三蒸水至25mL，过滤在-20℃储存（1.4 mM stock），再取 1.4mM stock加MS溶液（v/v=1/3）配制浓度为100μg/mL的溶液，使用时工作浓度为2.5μg/mL，即24孔培养板中，每孔400μL的培养液浓度为100μg/mL的阿糖胞苷10μL．6孔培养板中每孔3mL培养液加75μL；（3）葡萄糖-碳酸氢钠储存液（GB stock）的制备：称取碳酸氢钠26.66g、葡萄糖44.44g加三蒸水至1L．过滤除菌后分装置4℃冰箱储存；（4）培养基储存液（Media stock）的制备：在无菌条件下取已过滤10x MEM100mL，GB stock90 mL，加无菌三蒸水900mL混匀后，分装置4℃冰箱储存，若近期不用则置-20℃储存；（5）D-Hanks液的制备：称取KCL0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCL18.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4·7H2O0.09g，酚红0.01g，加三蒸水溶解至1L，过滤除菌后分装置4℃冰箱储存.（6）神经元培养基的制备：量取FBS50mL、HS50mL、0.142%的谷氨酰胺10mL，加培养基储存液（M S）至总量为1L，分装置4℃冰箱储存，若近期不用则置-20℃储存．

1.3海马组织的分离，细胞悬液的制备与接种

成年小鼠采用颈椎脱桕处死后，放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒1～2min．剪开头部皮肤向两侧拉开，暴露整个颅骨，用小剪刀打开颅骨，完整取下全脑，置于无菌的D-Hanks液培养皿中．洗净脑表面血液，移入另一盛有D－Hanks液的培养皿中．沿背侧表面正中矢状位，用镊子向外侧小心掀开大脑皮质，即可在正中矢状位见“C”字型海马；用镊子夹住海马，向周边组织分离，即可获得整个海马；解剖显微镜下剥离覆盖在海马表面的其它组织及脉络从，将海马剪成碎组织块，用玻璃管吸入安瓶中，待组织块下沉吸去上层的D-Hanks液，加入培养液吹打40～60次，制成细胞悬液后用网筛过滤．取少量细胞悬液加等量胎盼兰混匀，加在计数板上，在100倍倒置显微镜下计数细胞密度，以2×105个细胞/mL，接种于24孔培养板，置37℃5%CO

2培养箱培养．

1.4形态学观察

分别于培养后1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，描记胞体和突起形态变化．

1.5免疫组织化学染色鉴定

用神经元特异烯醇化酶抗体染色鉴定神经元．取培养细胞按如下程序进行免疫组化染色: 0.05M PBS漂洗5min×3次，3%H2O2室温处理切片30min；5%羊血清（0.3%Triton×100，0.01 M PBS配制）37℃封闭背景30min；用含兔抗神经元特异烯醇化酶多克隆抗体（Santa Cruz，工作浓度1:500）的PBS缓冲液（含0.3%Triton×100，3%羊血清）4℃孵育48h；PBS洗5min×3次；生物素化二抗（1:200，0.05M PBS配）孵