稀有放线菌的分离及抗菌筛选
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集
实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集1 目的1.1 了解微生物分离和纯化的原理1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法2 原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
3 材料3.1 培养基淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3.2 仪器或其它用具取样铲、塑料袋、记号笔、1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。
一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。
应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。
2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。
如下示意图。
一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。
每个点切取的土块宽度、厚度应基本一致。
装入事先准备好的塑料袋内扎好。
北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。
3．采样方法、数量：1)面积小，地势平坦，肥力均匀的田块，采用对角采样法。
放线菌的选择分离培养
（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中 120℃干热处理1h。
（3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠 的三角瓶中，加入0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟， 静止5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍。同时另取土 样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。
实验一 放线菌的选择分离与计数
一 教学要求
放线菌有多种代谢产物，如抗生素，维生素、氨基酸、 蛋白质、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，很多产物在农业、 医疗、食品及国防等领域产生了巨大的效益。
本实验的目的在于学习从土壤等环境中分离放线菌
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二 实验原理
土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链 霉菌以外的其他放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、 诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但 往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离 方法很难得到。对样品进行风干、干热处理、培养基 添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量；用干热 和苯酚处理减少链霉菌数量的方法，可以分离得到更 多种类的放线菌。
（2）注意在培养基中添加重铬酸钾适量
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六 思考题
请设计一种分离稀有放线菌的实验方案
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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三 材料与器材
菜园土或林地土，自然风干，备用。 0.1％ 重铬酸钾溶液，1％ 苯酚，高氏1号
培养基。 水浴锅等。
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四 操作步骤
取样及预处理
1、来源：土壤中放线菌最丰富，品种齐全。可以筛选新的放线菌。 从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线 菌，从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
分离放线菌实验报告
分离放线菌实验报告分离放线菌实验报告一、引言放线菌是一类广泛存在于土壤和水环境中的细菌，具有丰富的代谢能力和生物活性物质产生能力。
为了研究放线菌的多样性和潜在应用价值，本实验旨在从土壤样品中分离放线菌，并对其进行鉴定和初步评估。
二、材料与方法1. 样品采集：从不同地点的土壤中采集样品，保持样品的新鲜度和原生态。
2. 样品处理：将采集到的土壤样品进行稀释，以获得适合分离放线菌的浓度。
3. 分离放线菌：将样品分别涂布在含有富集放线菌所需营养物质的培养基上，然后进行孵育。
4. 鉴定放线菌：观察培养基上出现的菌落形态和颜色等特征，选取具有代表性的菌落进行进一步鉴定。
5. 鉴定方法：通过显微镜观察菌落形态和细胞形态，对菌株进行初步分类。
使用生化试剂和生理特性测试进一步鉴定放线菌的代谢能力和特性。
三、结果与讨论经过培养和鉴定，我们成功地从土壤样品中分离出多个放线菌菌株。
根据菌落形态和细胞形态的观察，我们初步将这些菌株归类为链霉菌属、链霉菌属和新链霉菌属等。
进一步的鉴定工作表明，这些放线菌菌株具有多样的代谢能力和特性。
其中一些菌株显示出产生抗生素的能力，这对于开发新的抗菌药物具有潜在意义。
另外，一些菌株还表现出对重金属离子的耐受性，这可能与其在环境修复中的应用有关。
通过对放线菌菌株的形态特征和生理特性的研究，我们初步了解了这些菌株的生物学特性。
然而，进一步的分子生物学和基因组学研究将有助于更全面地揭示这些放线菌的潜力和应用价值。
四、结论本实验成功地从土壤样品中分离出多个放线菌菌株，并对其进行了初步鉴定和评估。
这些放线菌菌株具有多样的代谢能力和特性，包括抗生素产生和重金属耐受性等。
这些发现为放线菌的应用研究提供了基础，并为开发新的生物技术和药物提供了潜在的资源。
然而，本实验只是一个初步的探索，还需要进一步的研究来深入了解放线菌的多样性和潜力。
相信通过不断的努力和研究，我们能够更好地利用这些放线菌资源，为人类的健康和环境保护做出更大的贡献。
放线菌的筛选-分子
放线菌的筛选、分离与鉴定姓名：王国兴学号：xs139003放线菌在自然环境中分布广泛，存在于不同生态环境中，种类繁多，代谢途径多样，是一类用途广泛的生物资源。
在已经发现的抗生素中，有80%的抗生素来自于放线菌，因而放线菌愈来愈得到人们的重视和利用。
过去由于技术的制约，用形态特征、理化特性、菌体某些化学成分等方法分类及鉴定菌株，至今任然沿用，但是方法存在局限性。
近些年来，得益于分子生物学的快速发展，使放线菌的应用前景不可限量。
通过分子生物学实验技术，我们可以对放线菌进行细致的分类。
目前分类方面一般采用的做法是除了需要形态观察、培养特征、生理生化实验外，还要进行核酸序列或氨基酸序列的测定，其中相当有效的分类鉴别方法之一是采用PCR扩增16S rDNA进行序列分析。
对16S rDNA进行研究，一般的步骤是：（1）提高基因组DNA;（2）用λ噬菌体制备鸟枪DNA文库;（3）用16S rDNA特异性探针性筛选;（4）从含有16S rDNA的克隆中进行测定；（5）比较、分析序列。
本文将为大家介绍一类放线菌的筛选、分离与鉴定的方法。
1.材料采集样品，用高氏一号培养基（高氏一号培养基：可溶性淀粉2.0%、KNO3 0.1%、K2HPO4 0.05%、MgSO4 0.05%、FeSO4 0.001%、重铬酸钾0.01%，用海水1000mL配制，调节其pH7.2~7.4；医用抗生素药敏纸片、培养皿、载玻片、盖玻片等。
）或燕麦琼脂( ISP－3)（燕麦粉20.0g，微量盐溶液1.0ml，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH7.2）或放线菌发酵培养基（葡萄糖10g，糊精25g，燕麦粉20g，棉籽饼粉10g，鱼粉5g，糖蜜5g，干酵母2g，碳酸钙3g，蒸馏水1.0L）或LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1.0L，pH7.0）或PDA培养基（马铃薯浸提液500ml，葡萄糖10g，琼脂7.5g）进行培养。
红树林土壤稀有放线菌的分离及分类鉴定的开题报告
红树林土壤稀有放线菌的分离及分类鉴定的开题报告一、研究背景红树林是在盐水海岸岩石上生长的一种特殊植被，具有独特的环境条件和生物多样性。
其土壤含有大量的盐分、重金属和有机质，是一种充满挑战性的生态系统。
研究红树林土壤中的微生物群落及其特殊代谢产物，对于理解这种生态系统的生态学和生化学基础，以及寻找具有药用和农业价值的化合物具有重要意义。
而放线菌是一类广泛存在于土壤、水体和植物内的微生物，具有广泛的生物活性和药用潜力，被广泛应用于医学、农业和工业领域。
因此，本研究旨在从红树林土壤中分离稀有放线菌，并进行分类鉴定及生物学特性研究，为发现具有生物活性的化合物提供基础。
二、研究内容1、红树林土壤中稀有放线菌的分离利用不同的分离方法，如平板培养、土砂平板法、稀释平板法和筛选法等，从红树林土壤样品中分离得到不同类别的放线菌，如链霉菌、放线菌、细菌素菌等。
并采取生理生化和基因技术等方法确定其菌株的特征。
2、菌株生产代谢产物利用发酵法对分离得到的稀有放线菌进行培养，并利用液相层析技术等方法分离得到主要的次级代谢产物。
并采用质谱分析技术对代谢产物进行鉴定和结构表征。
3、放线菌群落结构及差异分析通过16S/18S/ITS rDNA的扩增和测序，对红树林土壤中的放线菌菌群落结构及组成进行深入分析，并比较不同生态系统的放线菌群落的差异。
三、研究意义和预期结果本研究可以有效地分离与红树林区域土壤中稀有的放线菌，利用生理生化和基因技术等方法对其种类进行分类鉴定，为进一步进行相关应用提供了基础。
同时，通过对红树林土壤中放线菌的群落结构和代谢物的分离与鉴定，可以更深入地了解红树林土壤的微生物群落结构和生化代谢规律，为生态系统的保护和管理提供科学依据。
预期结果包括分离到稀有的放线菌株，鉴定、筛选出具有生物活性的代谢产物，并对红树林土壤中放线菌的群落结构进行分析和比较。
四、研究方法和技术路线1、样品采集与处理：收集红树林区域的土壤样品，并进行过滤、稀释等处理。
放线菌的分离和鉴定
放线菌的分离和鉴定放线菌的分离和鉴定实验器材：1.⼟壤材料 5 ---10cm 处⼟壤，放于采集袋中带回实验室。
2.培养基淀粉琼脂培养基（⾼⽒Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% ⽢油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% ⼄醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成⾰兰⽒染液3( 1) 结晶紫染⾊液: 甲液结晶紫2g，95% ⼄醇20ml;⼄液草酸铵0. 8g，蒸馏⽔80ml。
甲⼄液先分别溶解，然后混合在⼀起，过滤除去残渣后装⼊滴瓶中备⽤。
( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏⽔100ml 先取少量蒸馏⽔加⼊碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加⼊全部蒸馏⽔，分装于滴瓶中备⽤。
( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%⼄醇100ml，溶解装⼊滴瓶备⽤。
4.仪器和其他⽤品⽆菌纸、带玻璃珠的三⾓烧瓶、1ml⽆菌吸管、⽆菌试管、⽆菌培养⽫⼀.⽬的要求：1. 掌握倒平板的⽅法和常⽤分离纯化微⽣物的基本操作。
2. 初步观察⼟壤中放线菌菌落形态。
3. 初步了解掌握微⽣物分类的基本⽅法。
⼆.实验原理：放线菌在⾃然界中主要⽣存于陆地和淡⽔中，⼟壤为这类微⽣物的主要习居场所，⽆论在种类和数量上都⽐其他地⽅繁多。
在中性或偏碱性的⼟壤和有机质等丰富的⼟壤中较多。
放线菌以孢⼦和菌丝⽚段的形式存在于⼟壤，每克⼟壤内含有数万、数⼗万的孢⼦。
放线菌的⽣活史和形态特征放线菌的孢⼦和孢囊孢⼦在适宜的环境下吸收⽔分，膨胀萌发，⽣出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。
因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体⼀般没有横隔，由于菌丝体长⼊培养基内和培养基表⾯，并纠缠在⼀起形成密集的菌落，所以⽤接种针将整个菌落培养基挑起⽽不破裂。
放线菌分离培养基筛选及杂菌课件
结 果 与 分 析
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参 考 文 献
1. 培养基制备: 分别按A, B, C, D, E, F, G, H 8 种培养基成分称量, 配制好后1 × 105Pa 30min 灭菌, 冷却至50 ℃ ~ 60 ℃ 按不同处理加入抑制剂倒平板备用。 2 .土样中放线菌分离: 稀释平板涂抹法分离, 28 ℃ 培养7d。
培养基种类对放线菌分离计数结果的影响
放线菌是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物。目前从微生物中发现的 8, 000多种微生物活性物质中, 有近70% 是放线菌产生的 。但是, 放线菌仅占土壤中所有放线菌的10% 左右 。开展大规模放线菌资源调查和建立有效 的放线菌分离方法是发现放线菌新种属和新活性物质产生菌的重要途径之一。现有的 放线菌分离培养基多达30 余种 , 放线菌资源调查待分离土样数量很大, 培养基种类 过多将加大分离工作量, 故筛选几种出菌率高、能将土壤中绝大多数种类放线菌分离培养出的代表性培养基,可在保证获得绝大部分放线菌资源信息的情况下, 有效减少工作量。
材 料
1 .土壤样品: 采自青海省不同肥力的农田土壤, 1、2、3 号土样分别代表低、中、高有机质土。土样基本性质见表1。
2.培养基 A 高氏1 号琼脂培养基 B 黄豆粉琼脂培养基 C 秸秆腐解物琼脂培养基 D 泥炭浸汁琼脂培养基 E 土壤浸汁琼脂培养基 F 燕麦片琼脂培养基 G 腐殖酸琼脂培养基 H 小麦粉琼脂培养基
研 究 Байду номын сангаас 的
放线菌最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中，泥土所特有的“泥腥味”就是由放线菌产生的。它们中绝大多数是腐生菌，能将动植物的尸体腐烂、“吃”光，然后转化成有利于植物生长的营养物质，在自然界物质循环中立下了不朽的功勋。还有一类叫弗兰克氏菌的放线菌，生长在许多豆科植物的根瘤里，能固定大气中的氮，成为植物能利用的氮肥。除了生产抗生素外，放线菌在工业上还有许多其他贡献。例如，利用放线菌还可以生产维生素B12、－胡萝卜素等维生素，生产蛋白酶、溶菌酶，以及用于生产高果糖浆的葡萄糖异构酶等酶制剂。另外，放线菌在石油工业和污水处理等方面也可发挥一技之长。 虽然少数寄生性的放线菌会引起人和动植物病害，有些放线菌会使食物变质，或者对棉毛织品和纸张造成破坏，对人类有害，但这些比起放线菌的功绩来，实在是微不足道的。
稀有放线菌分离方法_姜怡
放线菌研究专栏编者按语:放线菌是一类重要的微生物资源。
近年来,用分子生物学方法证明自然界实际存在的绝大部分放线菌仍然难以纯培养。
如何获得这些未知放线菌是资源利用的重要前提。
这就涉及到放线菌分离及分类。
本专栏将本着先进、实用的原则,有选择地介绍这方面的最新进展和研究供参考。
稀有放线菌分离方法*姜 怡1,2 段淑蓉1 唐蜀昆1 陈华红1 李文均1 徐丽华1**(微生物药物国家工程研究中心 云南省微生物研究所 昆明 650091)1(Lei bn i z Ins tit u t f rM eeres w i ssen s ch aft en an der Un i versit t K i e,l D sternb rook erW eg 20,D 24105K i e,l Ger m any)2 *国家973项目(N o 2004CB719601)国家自然科学基金项目(No 30270004,30560001)**通讯作者 Te:l 0871 *******,Fax :0871 *******,E m ai :lli hxu @ynu edu cn 收稿日期:2005 11 15,修回日期:2005 12 26摘要:稀有放线菌是生物活性物质的重要来源。
从样品预处理,抑制剂的选择,噬菌体的使用,碳源的选择及培养基的设计等各个方面介绍了稀有放线菌分离方法及作者的经验。
关键词:稀有放线菌,分离方法中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:0253 2654(2006)01 0181 03稀有放线菌是指除常见的链霉菌以外的其他放线菌,而不是一个具体的分类学单元。
稀有放线菌能产生众多生物活性物质,包括红霉素,利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素,酶类、维生素等。
其中一些抗生素已商业化,产生巨大的社会效益和经济价值。
研究结果表明,环境中只有极少一部分放线菌得到纯培养。
因此,分离那些未知放线菌是利用这类资源的首要前提之一。
2株具抗菌活性的稀有放线菌的筛选和鉴定
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第２６卷第５期 ２００９年１０月
生物学杂志
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（ＰＤＡ）上生长良好，基生茵丝丰富，无气生茵丝。２株菌的最适生长温度为２８屯，最适生长ｐＨ值７．０～７．５。综合２
海洋样品中放线菌菌株的分离及其抗生素生物合成基因簇的挖掘
海洋样品中放线菌菌株的分离及其抗生素生物合成基因簇的挖掘近些年来,由于抗生素的滥用,导致病原微生物对药物产生耐药性的速度要远远快于新型药物发现的速度。
这就要求我们必须采用其他有效的方法来获得新型抗生素。
随着陆生放线菌研究的日益完善,现在从陆生放线菌中发现新型次级代谢产物应用于新药开发的几率越来越小,而海洋中的微生物由于不同于陆生的环境,会产生一些不同的次级代谢产物。
因此,自上世纪八十年代,人们开始重视海洋放线菌资源的开发。
随着测序技术的迅猛发展,自2002年天蓝色链霉菌的基因组序列被测定之后,越来越多的链霉菌基因组测序完成。
分析这些基因组信息,我们发现大多数链霉菌都含有几十个与代谢产物有关的基因簇。
但是目前却只找到了很少量的基因簇相对应的化合物,如果能够使这些沉默的基因簇得到表达,那么将能够产生大量有活性的化合物。
基于上述几点,我们将研究的重点放在了海洋放线菌上,将从海洋泥样中获得的链霉菌在异源表达宿主天蓝色链霉菌M1 152中进行异源表达,期望能够筛选到有活性的化合物。
本实验针对从北极、南极、南海获得的50份泥样进行了放线菌的分离,共获得了七株放线菌。
对已分离获得的放线菌,进行了 16SrDNA测序确定了它们的分类地位,其中三株分离菌为诺卡氏菌,四株为链霉菌。
选取了实验室常用的培养基用来对各菌株进行培养,检测其最适的产孢培养基。
另选用了实验室常见的生测指示菌检测了这几株海洋放线菌的生物活性,从其中挑选出抗菌谱广且抗菌活性高的42#菌株作为研究对象,构建其cosmid文库,得到了插入片段约42kb的文库。
将构建好的cosmid文库通过接合转移的方式转至天蓝色链霉菌M1 152中,对获得的接合转移子进行生物活性的分析,得到了三个阳性接合转移子,经分析发现这三个cosmid为不同的粘粒。
选取其中活性较好的42#-17B4 cosmid进行测序,利用软件Frameplot4.0对42#-17B4cosmid的序列进行ORF的预测分析,发现它大约包含有18个ORF,分析这些ORF的信息,认为这一基因簇所产的化合物应该是一类具有很强极性的NRPS类代谢产物,且通过对M1 152/42#-17B4的活性物质发酵并粗提后利用HPLC及LC-MS对其进行分析,在R3培养基的发酵平板上发现了一个极性较大,分子量—为380.4的化合物,在GYM发酵培养基上发现了一个分子量为549.4的化合物。
植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离及生物活性-厦门大学学报
doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201604056鹭宁两地植物根际土壤中放线菌的多样性分析及抗菌等生物活性评估王霏1，黎丹1，黄耀坚1，邓贤明1，吴莹莹2*（1.厦门大学生命科学学院天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海市农业科学院食用菌研究所，上海2 01406）摘要：为探究不同地区植物根际土壤中可培养放线菌的多样性，筛选具有抗菌及抗肿瘤活性的药源菌株，本研究采用改良聚乳酸-明胶和海藻糖-脯氨酸两种培养基，选择分离采自厦门市翔安区香山风景区、南京中山植物园及南京玄武湖公园的17份植物根际土壤样品中的放线菌，并进行16S rRNA基因鉴定、系统发育分析及抗菌、抗肿瘤生物活性测定. 共分离到178株放线菌，其中链霉菌151株，其余27株为稀有放线菌，占总数的15.2%. 稀有放线菌包含9个属：微杆菌属（Microbacterium）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）、韩国生工菌属（Kribbella）、野野村氏菌属（Nonomuraea）、小单孢菌属（Micromonospora）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium）和栖白蚁菌属（Isoptericola），包含2株新种. 对分离得到的所有放线菌进行液体小量发酵，并测定其发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性. 结果显示，所测定的178株放线菌中，有82株对一种或多种指示菌表现出抗菌活性，占供测菌株的46.1%；有60株对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用，占供测菌株的33.7%. 研究结果表明植物根际土壤中放线菌资源丰富，其中抗菌和抗肿瘤活性显著的菌株可为后续微生物药物研发提供有利资源.关键词：放线菌；选择分离；系统分析；活性测定中图分类号：Q 939 文献标志码：A放线菌是天然药物的重要来源，目前临床及农业上使用的抗生素中，超过60%是放线菌产生的[1]. 自1944年美国放线菌学家Walksman[2]从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中发现链霉素以来，大量新型抗生素被陆续从放线菌中分离得到，其中大部来自链霉菌，约占自然界来源抗生素总数的45%，另有16% 来自非链霉菌属的放线菌[3]. 随着对链霉菌资源的开发，从其中发现结构新颖的活性物质的几率不断下降. 近年来，人们逐渐将探索的目光转向非链霉菌属的放线菌，即稀有放线菌[4]. 稀有放线菌产生的生物活性物质结构类型丰富，包含大环内酯类、氨基糖苷类、肽类、蒽环类、氧杂蒽酮类等[5-6]，其中如抗MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的万古霉素（vancomycin）、替考拉宁（teicoplanin）、道古拉宁（dalbavancin），治疗细菌感染的庆大霉素（gentamicin）、红霉素（erythromycin），抗结核杆菌的利福霉素（rifamycin）、卷曲霉素（capreomycin），以及降糖药阿卡波糖（acarbose）等已经成功应用于临床[7].植物根际土壤是微生物的重要栖息地，它是由植物、土壤和微生物共同构成的一个微环境，三者之间相互作用、相互影响. 研究结果表明，植物根际土壤中的微生物多样性比非植物根际土壤中的丰富[8]. 根际微生物的代谢活动对于整个微环境中的碳循环、磷循环、植物固氮作用、调节植物根际微环境以及土壤中废物和毒素的清除都起到十分重要的作用[9]. 不同微生物在与植物和土壤进行相互作用的过程中，可能导致植物根际土壤的有机质含量、酸碱度等产生细微的差异，并反过来影响微生物的群落组成[10]. 放线菌在植物根际土壤微生物类群当中占有极其重要的地位，如在玉米等农作物的根际土壤中，放线菌属于优势菌，其含量仅次于变形杆菌[9]. 因此，本研究选择采集自两个地区的植物根际土壤样品作为放线菌的分离源，对分离到的放线菌菌株进行分类鉴定和多样性分析，并对其进行抗菌和抗肿瘤活性筛选，旨在了解植物根际土壤中放线菌的多样性，挖掘新的稀有放线菌分类单元，并获得可用以活性物质分离的药源菌株，为后续微生物药物资源的开发奠定良好基础.1 材料与方法1. 1 材料1. 1. 1 样品来源植物根际土壤样品由研究人员分别采集自福建省厦门市（2012年10月）和江苏省南京市（2012年11月）. 其中以X开头的9份样品采自厦门市翔安区香山风景区（N 24°37′45.84″，E 118°17′56.73″），分别为植物飞扬草（Euphorbia hirta L.）、榕树（Ficus microcarpa Linn.f.）、红薯（Ipomoea batatas （L.）Lam.）、鬼针草（Bidens pilosa L.）、马樱丹（Lantana camara L.）、阴香（Cinnamomum burmannii）、紫茉莉（Mirabilis jalapa L.）、红花檵木（Loropetalum chinense var .rubrum）和凤凰木（Delonix regia）的根际土壤；以N开头的8份样品采自南京，分别为中山植物园（N 32°03′10.48″，E 118°49′40.66″）中水杉（Metasequoiaglyptostroboides）、桫椤（Alsophila spinulosa）、鹅掌楸（Liriodendron chinense）和金钱松（Pseudolarix amabilis （Nelson）Rehd.）的根际土壤，以及玄武湖公园（N 32°04′27.36″，E 118°47′19.58″）植物罗汉松（Podocarpus macrophyllus）、枫杨（Pterocarya stenoptera C. DC）、朴树（Celtis sinensis Pers.）和喜树（Camptotheca acuminata.）的根际土壤.1.1.2 主要试剂和仪器提取放线菌基因组DNA所用的溶剂按照《分子克隆实验指南》[11]进行配制. PCR所用的dNTP Mixture、Taq酶及琼脂糖凝胶电泳所用DNA Marker等购于宝生物工程（大连）有限公司公司. Beckman高速冷冻离心机购于美国Beckman公司，Tprofessional型PCR仪购于德国Biometra公司，Tanon GIS-2009型凝胶图像分析系统购于上海天能科技有限公司，DYY-8C型电泳仪购于北京六一仪器厂.1. 2 放线菌的分离方法1. 2. 1 样品预处理参考姜怡等[4]的方法，将采集好的土样分别摊开于通风处自然风干20~30 d（视土样湿度而定），用研钵将其研细，之后用200目的筛子过筛，收集至自封袋，妥存. 称取1 g样品装入盛有9 mL无菌水和小玻璃珠的50 mL无菌离心管中，摇床充分振荡后制成10-1稀释液，再以相同方法制备土壤样品的10-2和10-3梯度稀释液，用于涂布选择分离培养基.1. 2. 2 选择分离分别使用改良聚乳酸-明胶（PLA-G）[12]和海藻糖-脯氨酸（YIM 212）[13] 2种培养基对土样进行放线菌的选择性分离. 均加入重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮至终浓度50 mg/L，加入萘啶酮酸至终浓度为25 mg/L. 涂布平板，倒置于28℃恒温培养箱中培养14~21 d后，挑取单菌落于高氏一号平板进行纯化.1. 3 放线菌的鉴定1. 3. 1 形态分类排重根据在固体培养基上的生长的菌落形状、颜色、是否产孢子、是否产可溶性色素等方面对所分离到的菌株进行形态分组.1. 3. 2 16S rRNA基因扩增及序列分析将纯化后的菌株接种至25 mL 胰蛋白胨大豆肉汤-酵母提取物（TSBY）液体培养基中，于28 ℃，220 r/min摇甁培养3~4 d. 采用吴莹莹等[14]的方法提取各菌株的基因组DNA. 采用通用引物27 F和1492 R扩增菌株的16S rRNA基因，并送至上海英潍捷基公司进行序列测定，用于系统分类研究. 测序结果提交在线分析网站EzTaxon-e （/eztaxon）进行相似性搜索，获得同源性相近的菌种序列. 运用MEGA6.06[15]的Neighbor-Joining 法构建系统进化树[16]，确定放线菌的分类地位. 对于最近似菌株的序列相似度低于98%且分类地位独特者，以TaKaRa公司的高保真酶对16S rRNA 基因再次扩增测序.1. 4生物活性实验1. 4. 1 放线菌发酵粗提物的制备采用酵母-麦芽提取物（ISP 2）[17]液体培养基进行发酵，每株菌发酵200 mL，于28 ℃，220 r/min发酵培养7 d. 乙酸乙酯萃取发酵液2遍，萃取液用旋转蒸发仪45 ℃减压浓缩成膏状物，称重后以甲醇定容至20 mg/mL，作为活性测定的母液.1. 4. 2抗菌活性实验采用滤纸片法[18]对分离得到178株放线菌的小量发酵粗提物进行抗菌活性测定. 指示菌包括金黄色葡萄球菌A TCC 25923（Staphylococcus aureus ATCC 25923，简称S.a）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 9372，简称 B.s）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus CMCC63202，简称B.p）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus ACCC 41016，简称M.l）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，简称M.t）、大肠杆菌（Escherichia coli A TCC 25922，简称E.c）、黑曲霉（Aspergillus niger ACCC 30005，简称A.n）和白色假丝酵母（Candida albicans As 2.538，简称C.a）.1. 4. 3 抗肿瘤活性实验抗肿瘤活性采用噻唑兰(MTT)法[19]检测. 分别选用人胃腺癌细胞BGC-823、人肝癌细胞HepG-2、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549四株肿瘤细胞作为指示细胞株，粗提物样品的测定终浓度为50 μg/mL. 传代培养肿瘤细胞至浓度约为6×104个/mL. 样品孔及阳性、阴性对照孔内各加入80 μL细胞悬液，空白对照孔加入80 μL培养液. 每个样品进行三组平行测定. 置于37 ℃，1.5% CO2培养箱内培养24 h，加入待测样品. 于37 ℃继续培养72 h，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 溶液. 反应3~4 h，加入100 μL MTT终止液. 9~12 h后，用酶标仪测定OD值（波长595 nm），并计算样品对肿瘤细胞的抑制率.2结果和分析2. 1不同培养基的分离效果使用2种选择培养基，经分离纯化共得到178株放线菌. 其中148株分离自PLA-G 培养基，占分离总数的83.1%. 观察发现，PLA-G 分离平板上的放线菌数量和种类都比较丰富，且细菌和真菌等杂菌污染较少. 经16S rRNA 基因鉴定，有26株为稀有放线菌，比例为17.6%. 30株分离自YIM 212培养基，占总数的16.9%，其中仅1株为稀有放线菌，占3.3%. 在相同培养条件下，同一份土样在 YIM 212分离平板上长出的放线菌数量较少且种类单一， 并且出现较大范围的细菌污染，说明该培养基对放线菌的选择性较弱.由此可见，PLA-G 培养基对于放线菌的筛选效果优于YIM 212培养基，稀有放线菌的出菌率也较高.2. 2 放线菌的多样性178株放线菌中，107株分离自厦门香山的土壤样品，占总数的60.1%. 其中22株（20.6%）为稀有放线菌，分布于拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis ）、微杆菌属（Microbacterium ）、韩国生工菌属（Kribbella ）、野野村氏菌属（Nonomuraea ）、小单孢菌属（Micromonospora ）、链孢囊菌属（Streptosporangium ）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium ）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium ）和栖白蚁菌属（Isoptericola ）9个属. 71株分离自南京的土壤样品，占总分离数的39.9%，其中5株（7.0%）为稀有放线菌，分布于微杆菌属（Microbacterium ）、小单孢菌属（Micromonospora ）和链孢囊菌属（Streptosporangium ）3个属（图1）.选取分离所得放线菌各个属的代表菌株及其同属的标准参考菌株，构建16S rRNA 基因系统进化树，结果如图2所示. 进一步采用多相分类的方法对可能属于新分类单元的2株稀有放线菌XMU 506T （原始编号X5-6）和XMU706T （原始编号X7-6）进行新种鉴定，将其分别命名为马樱丹拟孢囊菌（Kibdelosporangium lantanae ）[20]和紫茉莉韩国生工菌（Kribbella mirabilis ）[21].a.304050607080t i n o m y c e t e s / (s t r a i n s )PLA 培养基YIM 212培养基b.注：Mba、Kri、Nom、Amy、Mon、Spo、Kib、Cel、Iso、Str分别表示微杆菌属、韩国生工菌属、野野村氏菌属、拟无枝菌酸菌属、小单孢菌属、链孢囊菌属、拟孢囊菌属、纤维菌属、栖白蚁菌属、链霉菌属.图1 厦门地区(a)和南京地区(b)植物根际土壤放线菌选择分离结果Fig. 1 Selective isolation of actinomycetes from Xiamen (a) and Nanjing (b) rhizosphere soil samples图2 根据16S rRNA 基因序列构建的植物根际土壤放线菌菌株系统进化树Fig. 2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing the diversityof actinobacteria isolated from rhizosphere soil Streptomyces olivaceus NRRL B-3009T (JOFH01000101) N2-4 (KT443806) Streptomyces somaliensis NBRC 12916T (AB184243) N1-24 (KT443800)Streptomyces glauciniger NBRC 100913T (AB249964)N1-1 (KT443793) X4-8 (KT581288) Nonomuraea roseoviolacea subsp roseoviolacea ATCC 27297T (AB039959)Nonomuraea bangladeshensis JCM 13930T (AB274966)Kibdelosporangium phytohabitan KLBMP 1111T (HM153787) Kibdelosporangium philippinens DSM 44226T (AJ512464)Kibdelosporangium lantanae XMU506T (KJ786942)Kibdelosporangium aridum subsp argum DSM44150T (AJ512463)X3-25 (KT581282) Streptosporangium canum HBUM 170018T (AJ512463)Kribbella antibiotica YIM_31530T (AY082063)Kribbella mirabilis XMU 706T (KM189813) Kribbella swartbergensis DSM_17345T （FN643223） Kribbella catacumbae DSM 19601T (AQUZ01000130)Micromonospora endolithica DSM_44398T (AJ560635)Micromonospora chersina DSM_44151T (X92628)N5-4 (KT443821)X1-15 (KT581264)Isoptericola nanjingensis H17T (HQ222356)N1-35 (KT443802)Microbacterium trichothecenolyticum DSM 8608T （JYJA01000006）N1-2 (KT443794)Microbacterium pseudoresistens CC-5209T (FJ865214)X6-36 (KT581320)Cellulosimicrobium funkei ATCC BAA-886T (AY501364)Amycolatopsis tolypomycina DSM_44544T (AJ508241) X2-6 (KT581268)Amycolatopsis bullii SF27T (HQ651730)Paracoccus fistulariae KCTC 22803T (GQ260189)6364100 82 99 75 100 99 100 88 99 9979 6485 99 99597812. 3 生物活性测定抗菌活性测定结果显示，有82株放线菌对至少一株指示菌具有抑制作用（抑菌圈直径≥6 mm），占供测菌株总数的46.1%. 其中37株对一种或多种指示菌具有较强的抑制作用（抑菌圈直径≥9 mm），占总供测菌株的20.8%（表1），包含8株稀有放线菌，分别为微杆菌属（Microbacterium）2株、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）3株、野野村氏菌属（Nonomuraea）2株、链孢囊菌属（Streptosporangium）1株. 其中，编号为X2-6、X2-10的2株拟无枝菌酸菌和编号为X3-25的链孢囊菌对多种指示菌都有显著的抑菌作用（抑菌圈直径>15 mm），其抗菌活性优于大多数链霉菌属菌株. 所分离到的放线菌主要对革兰氏阳性细菌表现出抑制作用，其中抗枯草芽孢杆菌的菌株数目最多；对供测的革兰氏阴性细菌几乎没有抗性，少部分菌株对真菌具有抑制作用.表1 178株植物根际土壤放线菌的抗菌活性Tab. 1 Antimicrobial activity of the 178 isolated actinomycetes抑菌圈直径活性菌株数（比例/%）不同指示菌的抗性菌株数（比例/%）B.s S.a B.p M.l M.t E.c A.nC.a直径≥6 mm82(46.1)54(30.3)51(28.7)46(25.8)46(25.8)23(12.9)(0.0)15(8.4)9(5.1)直径≥9 mm37（20.8）34(19.1)25(14.0)24(13.5)18(10.1)12(6.7)(0.0)8(4.5)4(2.2)采用MTT法进行抗肿瘤活性测定的结果显示，所分离的放线菌中有60株对至少一种肿瘤细胞株具有抑制作用（抑制率≥50%），占供测菌株总数的33.7%. 其中，对一种或多种指示细胞株表现出较强抑制作用（抑制率≥90%）的有23株，占供测菌株总数的12.9%（表2），包含2株稀有放线菌，分别为野野村氏菌属（Nonomuraea）1株和韩国生工菌属（Kribbella）1株.表2 178株植物根际土壤放线菌的抗肿瘤活性Tab. 2 Antitumor activity of the 178 isolated actinomycetes肿瘤细胞株抑制率活性菌株数（比例/%）不同肿瘤指示细胞株的抗性菌株数（比例/%）BGC-823HepG-2MCF-7A549抑制率≥50%60(33.7)54(30.3)51(28.7)46(25.8)46(25.8)抑制率≥90%23(12.9)34(19.1)25(14.0)24(13.5)18(10.1)3 讨论选择合适的培养基对于选择分离稀有放线菌具有重要意义. 碳源是培养基的基本成分之一，寻找特殊的“稀有”碳源对于稀有放线菌的选择分离尤为重要. 采用聚乳酸（PLA）作为分离培养基的碳源进行放线菌的选择分离已有不少相关报道，大多数研究中采用的都是乳化PLA的方法[22-25]. 例如Jarerat[26]通过往PLA中加入氯仿使其乳化，然后真空抽干有机溶剂，制成PLA薄膜，再将其倒入基础培养基. 本研究对上述方法进行了改进，利用搅拌机将PLA颗粒直接打碎成粉末状，以此代替乳化处理方法，再将PLA粉末和明胶分别按0.1%的比例加入基础培养基当中配制PLA-G培养基. 采用PLA-G培养基从不同来源的植物根际土壤中共分离得到148株放线菌，且稀有放线菌出菌率高，分离效果远优于YIM 212培养基及已乳化PLA培养基. 由此说明，采用机械粉碎的PLA作为碳源制备的PLA-G培养基是优于YIM 212选择分离植物根际土壤中稀有放线菌的一种优良培养基.对本研究分离得到的178株放线菌进行16S rRNA基因序列分析结果表明，所有放线菌分布于7个科，10个属当中，呈现出良好的多样性. 其中107株分离自厦门市翔安区香山风景区的植物根际土壤样品，包含2株稀有放线菌新种，分离效果优于南京采集的土壤样品，尤其是稀有放线菌的多样性较为丰富. 香山风景区位于厦门市翔安区东南部，坐落于鸿渐山脉南麓的生态保护区和自然景观保护区，该地区植被繁茂，生态环境大多保持原始自然状态；南京中山植物园和玄武湖公园属于旅游观光景区，生态环境受人类活动的影响较大.由此可见，未经开发或自然生态环境保持较好的生态系统，其植物根际土壤也保持着较原始的状态，所以其中可能蕴含着更丰富的微生物资源.抗菌及抗肿瘤活性测定中，对至少一种指示菌和至少一种肿瘤细胞株具有抑制作用的活性菌株分别占供测菌株的46.1%和33.7%，进一步证明了所分离放线菌的次级代谢产物中可能蕴含着活性良好或结构新颖的化合物，具有极大的开发潜力，有待进一步深入研究.参考文献：[1] JÁNOS B. 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State-Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. National Engineering Research Center of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201406, China)Abstract: This study aimed to investigate the diversity of actinomycetes from rhizosphere soil in different regions, and to screen the strains with antibacterial and antitumor activity. The 16s rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis were used to explore the diversity of actinomycetes, which were isolated from 17 rhizosphere soil samples with two selective media. Using 6 bacteria, 2 fungi and 4 tumor cells as indicator to determine the biological acticity of actinomycetes. A total of 178 actinomycetes were isolated from rhizosphere soil, including 27 strains were rare actinomycetes, accounted for total 15.2%. The rare actinomycetes can be assigned 9 genera, which are Microbacterium, Amycolatopsis, Kribbella, Nonomuraea, Micromonospora, Streptosporangium, Kibdelosporangium, Cellulosimicrobium, Isoptericola, and 2 strains of them were novel species. Among them, 46.1% strains had antibacterial activity against one or more indicator, 33.7% strains had inhibitory activity of one or more tumor cells. The results showed that rhizosphere soil was a highly diverse actinobacterial communities，many of which appear to be novel candidate species. The actinomycetes having biological activity could be a promising source for secondary metabolites separation and microbial pharmaceuticals development.Key words: actinomycetes; selective isolation; phylogenetic analysis; bioactivity。
放线菌菌种筛选的一般流程
菌种筛选的一般步骤________、_________、________。
答案：菌种的分离和筛选一般步骤分为采样、富集、分离、目的菌的筛选四个步骤。
知识拓展：
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中。
分离和纯化土壤中放线菌的实验流程如下：土壤取样→系列稀释→涂布平板→恒温培养→观察菌落→菌种纯化。
回答下列问题：（1）取样时应选择有机物含量丰富且疏松的土壤，可判断大多数放线菌属于____（填“需氧菌”或“厌氧菌”）。
将1g土样放入盛有99mL无菌水的锥形瓶中混合均匀，再取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，则该试管中稀释液的稀释倍数为____倍。
（2）高氏1号培养基是培养放线菌的常用培养基，该培养基含有的营养物质主要包括____。
（3）在分离土壤中的放线菌时，为减少细菌和真菌的干扰，提高放线菌的分离效率，在培养基中要加入一定量的重铬酸钾，重铬酸钾在培养基中所起的作用是____。
（4）放线菌的培养温度一般应____（填“低于”或“高下”）细菌的培养温度。
（5）筛选放线菌可根据菌落特征进行判断，菌落特征主要包括____（答两点）等方面。
（6）分离得到土壤中的放线菌后，可利用____法对菌种进行纯化。
答案：(1). 需氧菌(2). 103（或1000）(3). 碳源、氮源、水和无机盐(4). 抑制细菌和真菌的生长（或选择作用）(5). 低于(6). 形状、大小、颜色和隆起程度(7). 平板划线或稀释涂布平板。
放线菌分离与筛选方法的研究进展
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放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法放线菌筛选是一种从大自然中寻找新的抗生素和其他有用化合物的方法。
放线菌是一类革兰氏阳性细菌，与其他细菌存在显著区别，它们具有许多生物活性代谢产物的天然合成能力。
因此，放线菌筛选被广泛应用于寻找新的抗生素和其他有活性的化合物。
1.采集样本：首先，需要在大自然环境中采集到放线菌的样本。
放线菌广泛分布于土壤、水体、植物等各种环境中，因此可以从这些环境中采集到样本用于筛选。
样本的采集可以通过在目标环境中收集土壤或其他样品，并将其置于合适的容器中保存。
2.预处理：采集到的样本通常含有大量不同种类的微生物，因此需要进行预处理步骤。
预处理的目的是去除其他微生物，只留下放线菌。
常用的预处理方法包括加热处理、酸碱处理、稀释等。
3. 筛选培养基的选择：放线菌的生长需要适宜的培养基，因此在筛选之前需要选择合适的培养基。
常用的培养基包括Mannitol-Soya agar （MSA）、Glycerol Yale agar（GYA）、Starch Casitone-Nitrate agar （SCN）等。
4.筛选培养条件的优化：放线菌的生长条件可以通过培养条件的优化来改善。
常用的优化参数包括温度、pH、培养时间和培养基成分等。
优化培养条件可以提高放线菌生长的速度和产生生物活性物质的能力。
5.放线菌分离：在筛选培养基上，可以观察到放线菌的集落。
这些集落可以单独分离，得到纯种的放线菌菌株。
分离放线菌的常用方法包括传代分离和扩散板法等。
6.放线菌菌株的筛选：得到纯种的放线菌菌株后，可以进行生物活性物质的筛选。
常用的筛选方法包括抗菌活性测定、抗肿瘤活性测定和酶活性测定等。
这些方法可以通过测量抑菌圈直径、细胞生存率和酶催化能力来评估放线菌菌株的活性。
7.活性物质的提取和纯化：经过筛选得到有活性的放线菌菌株后，还需要将其产生的活性物质进行提取和纯化。
常用的提取方法包括溶剂提取法、胶体微滤法和萃取法等。
而纯化方法则包括柱层析、薄层层析和高效液相层析等。
放线菌的分离与提纯 论文
放线菌的分离与提纯摘要：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，在医药工业上有重要意义。
本实验我们主要采用无菌培养、稀释法等方法对放线菌进行培养、分离和纯化，经过倒平板、制备梯度稀释液、涂布、培养、挑单菌落、保存等步骤即可使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
关键词：放线菌分离无菌一、实验目的学习从土壤中分离放线菌。
二、实验原理放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。
一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。
如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。
再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
三、仪器与材料（一）培养基（二）．溶液或试剂10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
（三）.仪器无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、链霉素和土样、显微镜、电热恒温水浴锅涂布器等。
（四）.流程倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→挑单菌落→保存四、操作步骤（一）．来源土壤中放线菌丰富，品种齐全，可以筛选出新的放线菌。
（二）．培养基的制备1、称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。
然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌（Actinomycetes）是一类革兰氏阳性细菌，常见于土壤和水体中。
由于其多样的形态和代谢特性，放线菌具有广泛的生物学和工业应用价值。
分离和筛选放线菌的方法是研究和利用其功能的基础，本文将介绍几种常用的方法。
一、分离方法：1.稀释和均匀涂布法：首先，将环境样品（如土壤、水样）进行适当稀释，并在培养基平板上平均涂布样品。
随着放线菌的生长，单个菌落会形成，然后可以通过挑选单个菌落进行分离纯化。
2.稀释和涂布法：方法类似于前者，但将初步培养得到的单菌落拖线在新的培养基平板上进行再次分离，以获得更纯的放线菌。
3.祛除污染菌法：样品前处理的关键是去除非放线菌细菌的干扰。
常见的处理方法有在分离培养基中加入抗生素、改变pH值等。
4.冷冻-融化法：利用放线菌对低温和高温的耐受性不同，将样品进行多次冻结-融化处理，可以选择性地分离出放线菌。
二、筛选方法：1.对抗菌活性筛选：放线菌具有对其他菌株的抗菌活性，可以使用对抗菌活性筛选方法，通过将待测分离物与感兴趣的致病菌共同培养，观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。
2.抗真菌筛选：放线菌不仅对细菌有抑制作用，也能抑制真菌的生长。
可以通过共培养放线菌和待测真菌，并观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。
3.溶磷筛选：放线菌具有溶解磷酸盐的能力，可以利用Na-P亚硝酸盐琼脂平板培养基来筛选放线菌。
4.产生生物活性化合物筛选：放线菌可以生成一系列生物活性化合物，如抗生素、酶、生物胺等。
可以根据需要设计相应的试剂盒，进行营养检测、酶活性测定或染色方法进行筛选。
5.双层平板筛选法：放线菌在液体培养基上生长一段时间后，将其转移到固体上层培养基上继续培养。
这种方法可以筛选出产生生物活性化合物的放线菌。
以上介绍的方法只是一小部分常用的放线菌分离和筛选方法，随着技术的不断发展，还有更多新的方法被提出。
分离和筛选放线菌是一个复杂且耗时的过程，需要根据具体的研究目的和条件来选择适合的方法。
稀有放线菌的选择性分离方法_彭云霞
云南大学学报(自然科学版),2007,29(1):86~89CN53-1045/N ISSN0258-7971 Journal of Yunnan University稀有放线菌的选择性分离方法彭云霞1,3,姜 怡1,2,段淑蓉1,李文均1,徐丽华1(1.云南大学教育部微生物资源重点实验室,微生物药物国家工程研究中心,云南省微生物研究所,云南昆明 650091;2.德国基尔大学海洋研究,D sternbroo ker Weg20,D-24105K iel;3.云南省出入境检疫局,云南昆明 650031)摘要:为了设计稀有放线菌的分离方法,对噬菌体S7,S3,重铬酸钾、萘啶酮酸、利富平、硫酸庆大霉素、柱晶白霉素、放线酮、制霉菌素等抑制剂及几种碳源进行了试验,设计或改良了几种培养基,研究它们分离稀有放线菌的效果.发现噬菌体能有效降低常见链霉菌的出菌率,重铬酸钾抑制真菌、细菌的效果好,M OPS、海藻糖、丙烯酰胺和乙二胺四乙酸能提高稀有放线菌的出菌率.推荐海藻糖-脯氨酸培养基、改良高氏2号、改良脯氨酸培养基作为稀有放线菌分离培养基.还提供了一些分离稀有放线菌的经验.关键词:稀有放线菌;分离方法;培养基中图分类号:Q93-331 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2007)01-0086-04放线菌是一类重要的微生物资源,它是抗生素及其他生物活性物质的主要生产者[1].几十年来,科研工作者发现,稀有放线菌能产生众多生物活性物质,包括红霉素、利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素、酶类、维生素等.其中一些抗生素已商业化,产生巨大的社会和经济价值.研究结果表明,环境中只有极少一部分微生物得到纯培养.因此,分离未知放线菌是利用它们的首要前提之一.由于链霉菌已经大量被发现,排除已知链霉菌的干扰,也是设计分离程序要考虑的重要问题之一.一些实验室曾经在特定类群放线菌的分离方面进行过研究,但稀有放线菌的出菌率仍然偏低[2~5].本文报道稀有放线菌(系指链霉菌以外的放线菌)选择性分离方法研究的部分结果.1 材料和方法1.1 土样来源 土样于2004年2月采自中国云南省南部西双版纳地区、老挝和泰国等,包括热带雨林、常绿阔叶林、松林和混交林等多种生态环境,按照采样地点、生态环境,混合成1~10号样品,用于本实验.1.2 噬菌体 从德国天然产物化学研究所(H KI)获得2株噬菌体:S3和S7.1.3 抑制剂 硫酸庆大霉素100 g/mL,柱晶白霉素20 g/mL,利富平20 g/mL,制霉菌素100 g/mL,放线酮100 g/mL,重铬酸钾50 g/mL,萘啶酮酸20 g/mL.在海藻糖-脯氨酸培养基和改良高氏二号改良培养基中分别加入1种或2种抑制剂分别进行实验.1.4 分离培养基(1)几丁质培养基(1000mL,下同):几丁质2 g,K2HPO4 3H2O0.92g,KH2PO40.3g, MgSO4 7H2O0.5g,FeSO40.001g,ZnSO40.001 g,M nCl20.01g,琼脂20g,pH7.0.(2)土壤浸汁培养基:土壤浸汁1000m L (400g土壤,1000mL水,1 105Pa灭菌1h,过滤或离心,用上清液),蛋白胨5g,牛肉膏3g,琼脂20 g.(3)海藻糖-天门冬酰胺培养基:L-天门冬酰胺1g,海藻糖10g,K2HPO4 3H2O1.31g,微量盐1mL(FeSO4 7H2O0.2g,M nCl 2H2O0.1g, ZnSO4 7H2O0.1g,水100mL.),琼脂20g,pH 7.2~7.4.(4)海藻糖-脯氨酸培养基:海藻糖5g,脯氨收稿日期:2006-04-10基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2004CB719601);国家自然科学基金资助项目(30270004、30560001). 作者简介:彭云霞(1964- ),女,云南人,硕士生,主要从事放线菌分类方面的研究.酸1g,(NH4)2SO41g,NaCl1g,CaCl22g,K2HPO4 1g,MgSO4 7H2O1g,复合维生素(维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、p-氨基苯甲酸各0.5mg,生物素0.25mg,下同),琼脂20g,pH 7.2.(5)改良脯氨酸培养基:脯氨酸5g,琼脂20 g,pH7.2.(6)改良高氏二号改良培养基:葡萄糖1g,蛋白胨0.5g,胰胨0.3g,NaCl0.5g,琼脂1.5g,复合维生素,琼脂20g,pH7.2.1.5 分离方法 分别称取2g风干土样,120 干热预处理1h;冷却至室温后,加入准备好的Na4P2O7无菌溶液中,振荡30min后,再用50W 超声波处理1min,用无菌水梯度稀释(最终稀释1000倍),涂布于平板.为了试验噬菌体,取土悬液2mL到酵母膏-麦芽膏液体培养基中,28 预培养5h;把培养液分别稀释10倍后,加入噬菌体S3和S7.再37 培养30min后,培养液稀释,涂布平板.平板在28 培养,3~5周,菌落计数,挑菌,记录结果.1.6 菌种鉴定 以菌落形态观察为主,结合光学显微镜进行形态特征观察,同时参照Lechevalier 等[6]的方法分析细胞壁氨基酸的类型,将菌株鉴定到属.2 结果与讨论2.1 噬菌体的使用 实验结果表明,噬菌体对稀有放线菌的分离效果有比较显著的影响.在几丁质培养基上,未加噬菌体时,分离到链霉菌147株,稀有放线菌93株,稀有放线菌占放线菌总数的38.75%;加入100 L噬菌体S3和S7,分离到链霉菌78株,稀有放线菌110株,稀有放线菌占放线菌总数的58.51%;加300 L噬菌体时,分离到链霉菌44株,稀有放线菌76株,稀有放线菌占放线菌总数的63.33%;加500 L噬菌体时,分离到链霉菌43株,稀有放线菌93株,稀有放线菌占放线菌总数的68.38%.随着添加噬菌体数量的增加分离到的链霉菌的数量呈明显的下降趋势,当加入噬菌体的量增加到500 L时链霉菌的数量降低约70%,稀有放线菌所占比例几乎是未加时的1倍.S3-phag e是一类对S trep tomyces albus专一性的噬菌体,S7-phage是除了Str ep tomyces oli vaceus,对其它80多种链霉菌都具侵染力,而且裂解能力强[7].本实验结果表明它们能有效裂解链霉菌,相对提高了稀有放线菌的出菌率.利用噬菌体裂解链霉菌,结合使用其他选择性分离方法,用于分离稀有放线菌是切实可行的.但是有2点值得注意.第1,自然界仍然存在大量未知链霉菌,我们不清楚这2种噬菌体是否会裂解这些未知链霉菌;第2,我们也不清楚,加入噬菌体以后分离到的链霉菌是否已感染噬菌体,是否会危害未知链霉菌,因此,建议慎重使用噬菌体.2.2 抑制剂的选择 实验结果表明,利富平、硫酸庆大霉素、柱晶白霉素能有效抑制细菌的生长,但抑制真菌的效果较差,放线菌的出菌率也较低.本实验的结果表明,采用100 g/mL的放线酮或者制霉菌素和20 g/mL的萘啶酮酸,能有效抑制真菌和细菌,以达到分离较多的放线菌的目的.我们的实践多次证明,使用这一组效果良好的真菌、细菌抑制剂,几乎没有真菌的干扰,细菌也很少,对于分离稀有放线菌极有好处.同时,分离培养基加入50~75 g/mL重铬酸钾,可有效抑制真菌和细菌,而又不抑制放线菌,从而大大提高放线菌的出菌率.2.3 碳源的选择 碳源是培养基的基本成分,甘油、淀粉、葡萄糖、腐殖酸等已广泛应用于放线菌分离培养基.再使用这些碳源,常见放线菌的出菌率会很大.因此探索 稀有 碳源,用于稀有放线菌分离,是一条可试途径.吗啉丙磺酸(M OPS,morpho linepropanesulfonic acid)是一种中性缓冲剂(pH 6.5~7.9).使用海藻糖-脯氨酸培养基,用0.1%的MOPS作碳源(代替海藻糖,下同),共分离到放线菌336株,其中稀有放线菌169株,占50.3%;用0.2%的丙烯酰胺作碳源,分离到放线菌229株,其中稀有放线菌135株,占59.0%;用0.5%的海藻糖作碳源,分离到放线菌285株,其中稀有放线菌155株,占54.4%;EDTA也是一种中性缓冲剂(pH7.0~8.0)、螯合剂的代表性物质,能和碱金属、稀土元素和金属等形成极稳定的水溶性络合物,能使分离培养基维持中性环境,用0.2%的EDTA作碳源,分离到211株放线菌,稀有放线菌111株,占52.6%.因此,MOPS、丙烯酰胺、海藻糖和EDTA是分离稀有放线菌比较理想的碳源,稀有放线菌的出菌率都能超过50%,建议采用.吐温80(polyoxyethylenesorbitan monooleate or polysor87第1期 彭云霞等:稀有放线菌的选择性分离方法bate)和聚乙烯醇均可以作为乳化剂,增加土壤中部分难溶物质的溶解.用吐温80(0.5%)作碳源,分离到放线菌329株,其中稀有放线菌119株,占36.2%;用聚乙烯醇(0.2%)作碳源,分离到放线菌328株,其中稀有放线菌94株,占28.7%.十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,对非产孢类微生物有较强的杀灭作用.分离培养基加入对氨基苯甲酸(0.2%)、十二烷基硫酸钠(SDS, 0.2%)、鞣酸(0.2%)的培养基,没有任何放线菌生长,但可以降低浓度进一步试验.2.4 选择性培养基 从表1可以看出,3种分离培养基中,改良高氏二号(1.4(6))是营养贫乏培养基,各种成分均只有高氏二号培养基的1/10,又加了混合维生素和抑制剂.在营养贫乏的条件下,对稀有放线菌产生选择性分离效果.表1所列3种培养基中,改良高氏二号培养基分离效果最佳,不仅放线菌出菌率高(908株),而且链霉菌所占比例也小,稀有放线菌比例高达81%(733株).从海藻糖-脯氨酸培养基(1.4(4))分离到1096个菌株,稀有放线菌855株,占78%,其中有小单孢菌(Mi cromonosp or a,占25%)、指孢囊菌属(Dycty losp or angium)、链孢囊菌(Strep tosp orangium)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、小四孢菌属(Mi crotetr aspora)小双孢菌(M icrobisp ora)、双孢放线菌(A ctinobisp or a)、糖单孢菌(Saccharomonsp ora)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、诺卡氏类(Nocar dia)和未能鉴定到属的菌株,表现出明显的物种多样性.从改良脯氨酸培养基(1.4(5))分离到542株放线菌,其中稀有放线菌355株,占66%.使用几丁质培养基,虽然小单孢菌较多,但这类单调.使用土壤浸汁培养基,尽管加了抑制剂,但细菌污染较重,稀有放线菌出菌率不到5%.使用海藻糖-天门冬酰胺培养基,稀有放线菌的出菌率有24%,细菌污染少,是较好的培养基.在作稀有放线菌分离时,建议采用2种培养基: 改良高氏二号培养基; 海藻糖-脯氨酸培养基和改良脯氨酸培养基中选1种.表1 不同培养基对稀有放线菌的选择性分离效果T ab.1Effectiveness of selective isolation for rare act inomycetes o n different media 培养基土样1土样2土样3土样4土样5土样6总数R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R A/%(4)136149252255657181232105166175237855109678(5)610891635831118012516225235554266(6)374222622833731291608812422028173390881 R:稀有放线菌的数量;A:放线菌总数;培养基编号见文1.4;3种培养基均加50 g/mL的重铬酸钾Waksman发现链霉素以后,开启对放线菌的广泛研究,大量放线菌(尤其是链霉菌)被多次重复 发现 和描述.现在要发现新的放线菌是越来越困难了.但是从现代分子生物学的研究结果看,自然界实际存在的未知放线菌至少还有90%.因此不断设计新的简便、有效的分离程序,排除已知链霉菌干扰,分离未知稀有菌仍然是放线菌资源开发的关键之一.为此,我们建议:第1,不断改变培养基的成分(尤其是碳源的种类和量),设计新的培养基.以上3种培养基可以作为分离稀有放线菌之参考;第2,抑制剂的选择很重要,我们建议使用两组抑制剂:100 g/mL的放线酮或制霉菌素+ 20 g/mL的萘啶酮酸和50 g/mL的重铬酸钾,使用噬菌体要持慎重态度;第3,加入维生素混合物常常有利于稀有放线菌的生长.参考文献:[1] 姜成林,徐丽华.微生物资源学[M].北京:科学出版社,1997.[2] 李文均,张忠泽,姜成林.几种主要稀有放线菌的选择性分离[J].国外医药(抗生素分册),2002,23:18 22.[3] CHORM ON OVA N T.Isolation o f actinomadura fromsoil sample on selectiv e media with kanamycin and rifampicin[J].A ntibiotiki,1978,23:22 26.[4] WA KI SAK A Y,KA WAM U RA Y,YASIDA Y,et al.Aselective isolation pr ocedure for micromonospore[J].J Antibiot,1982,35:822 836.[5] SUZU K I S,T A KAHASHI K,OK U DA T,et al.Selective isolatio n of act inobispor e on gellan g um plates[J].88云南大学学报(自然科学版) 第29卷Can J M icrobio l,1998,44:1 5.[6] LECHEVAL IER M P,LECHEVAL IER H A.T hechemo tax onomy of actinomy cets [J ]//Actinomy cetes T axonomy.Ar lington:SIM Spec,Publ,1980,(6):277284.[7] K U RT BOK E D I ,CHEN C F ,W ILL IA MS S e ofpo lyvalent phage for reductio n of streptomycetes on soil dilution plates[J].J Appl Bacter iol,1992,72:103 111.Selective isolation methods of rare actinomycetesPENG Yun x ia 1,3,JIANG Yi1,2,DUAN Shu rong 1,LI Wen jun 1,XU Li hua1(1.T he Key L aboratory for M icrobial Resources of M inistry of Education,T he National Engineer ingCenter for Resear ch of M icrobial P harmaceuticals,Yunnan I nst itute of M icrobiolog y,Y unnan University,K unming 650091,China;2.Leibniz Institut f r M eeresw issenschaften an der Universit a ..t K iel,D sternbrooker Weg 20,D 24105Kiel,Germany;3.Quarantine Bur eau of Y unnan Province,Kunming 650031,China)Abstract :T o selecte isolation methods of rare actinom ycetes,the effects of various phages,inhibitors,car bon resoures were tested.Based on the tested results,several medium w ere desig ned and improved.Isolation ef fects of the medium w ere compared.The results indicate that trehalose Proline ag ar,modified Gauo s 2agar and proline agar are good medium for selective isolation for rare actinomycetes.Some experiences about isola tion of rare actinomy cetes were provided.Key words :rare actinomycetes;selective isolation methods;media *******************************简讯本刊入选 首届中国高校精品科技期刊2006年10月,在教育部科技司委托中国高等院校自然科学学报研究会组织开展的 首届中国高校精品 优秀 特色期刊评比活动 中,本刊入选中国高校精品科技期刊.此次评比共评出包括本刊在内的52种精品科技期刊,98种优秀科技期刊,100种特色期刊.本刊是西南4省区(川、滇、黔、桂)仅有的2家精品高校科技期刊之一(另1家是 四川大学学报(医学版) 。
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草 甸 土＞ 沙土 ； 样不 同的预 处理 后稀 有 放 线 菌 的检 出 中， 风 土 自然 风干 ＞ 学 处理 ＞ 干 处理 ： 化 烘 土
壤 共有 ８个 菌株对 指 示菌有拮 抗 作 用 ， 中 ３株 具有进 一 步研 究的 价值． 其
关键 词 ： 有放 线 菌 ； 离； 抗作 用 稀 分 拮 中图分类 号 ： ３ ．３ Ｑ ９ ９１ 文献标 识码 ： Ａ 文 章编 号 ：６ ４ ４ ４ （ ０ ０ ０ — １５ ０ １ ７ — ９ ２ ２ １ ）２ ０ ８ — ３
ａ ｔ ｏ ｃ ｔ ｓｗ ｉｈ ｈ ｖ ｎ ａ ｏ ｉｔ ｃｉｎ ｔ ｅ ｉ ｄｃ ｔ ｒ ａ ｄ ｔ ｒｅ ｏ ｅ ｉ ｗｏｔ ｙ ｏ ｒ ｅ ｔ ｄ ． ｃｉ ｍｙ ｅ ｅ ｈ ｃ ａ ｅ ａ ｔ ｇ ｎｓｉ ａ ｔ ｏ ｔ ｎ ｉａ ｏ ， ｎ ｈ ｅ ｆｔ ｍ ｒ ｆｆ ｔ ｒｓｕ ｙ ｎ ｃ ｏ ｈ ｈ ｓ ｈ ｕ ｈ
稀有放线菌的分离及抗菌筛选
范 丽 霞 ． 郑 继 平
Ｃ 南大 学 食 品学 院微 生物实 验 室 ， 南 海口 ５０２ ） 海 海 ７２ ８
摘 要 ： 通过 对海 南不 同植被 的 土壤 、 土样 不 同的预 处理 方 式及 抑制 剂 的有 无对 稀有 放 线 茵进 对 行 分 离、 筛选 出 ５ ７株稀 有 放 线 菌 ， 用纸 片扩 散 法 测定 它 们对 大肠 杆 菌、 使 枯草 芽胞杆 菌、 黄 色 金 葡 萄球 菌 、 黑曲 霉的拮 抗 作 用． 果表 明 ， 不 同植 被 土壤 分 离的稀有 放 线 茵数 量 上看 ， 作 土＞ 结 从 耕
第２ ３卷第 ２期
２１ ０ ０年 ６月
海 南师 范大 学学 报（ 自然 科 学版 ）
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