人类KRAS7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明书-P4.2-12T-2015.10.09
医疗器械：伴随诊断系列报告之二-核心技术突破不断，伴随诊断迎高速发展期
核心技术突破不断，伴随诊断迎高速发展期--伴随诊断系列报告之二[Table_IndNameRptType]行业评级：增持报告日期： 2021-06-24行业指数与沪深300走势比较[Table_Author] 分析师：文献 执业证书号：S0010520060002 邮箱：**************** 联系人：黎一江 执业证书号：S0010120110007 邮箱：*************[Table_Report] 相关报告1.技术推广双轮驱动，肿瘤早筛驶入发展快车道 2021-02-26 主要观点： [Table_Summary] ⚫ 伴随诊断技术：靶向引领个性化医疗，基因测序方法为核心 在伴随诊断技术中，基因测序方法是效率和精准度的核心。
主要的测序技术为PCR 、NGS 、FISH ，其中PCR 目前仍占据主流市场，NGS 是后起之秀。
此外，传统的靶向位点检测和新位点的开发亦是技术关注重点，对于新型靶向药物及伴随诊断的开发起着重要作用，伴随诊断中的常用位点为EGFR 、KRAS 、BRAF 、PIK3CA 、BRCA 等。
⚫ 市场竞争现状：各肿瘤伴随诊断企业同台竞技，技术为先渠道紧跟 随着伴随诊断行业不断成熟，市场上肿瘤伴随诊断企业先后涌出，优势企业密集出现。
由于伴随诊断行业属于高新技术行业，加速研发颠覆性的核心技术始终为先；在筑好技术护城河的基础上，各大企业不断拓展渠道优势，谋求企业合作，才能在竞争激烈的市场中脱颖而出。
⚫ 未来发展前景：伴随诊断行业发展路径清晰，应用前景广阔经过多年的发展，伴随诊断行业已度过稚嫩的新生期，逐步走向成熟，将会迎来广阔的应用前景。
未来我国伴随诊断行业将不断规范监管，靶向药-伴随诊断联合开发的形式可能会成为伴随诊断开发的主流模式。
在国家政策的支持下，伴随诊断或有可能进入医保，将大大降低有效减轻患者负担，不断扩大伴随诊断的应用范围。
⚫ 投资建议建议关注艾德生物、华大基因。
Kras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene(PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。
K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。
据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。
K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。
因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。
为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。
表1 本品可检测的K-ras基因突变K-ras基因12密码子突变K-ras基因13密码子突变Gly12Ser GGT > AGT Gly13Ser GGC > AGCGly12Arg GGT > CGT Gly13Arg GGC > CGCGly12Cys GGT > TGT Gly13Cys GGC > TGCGly12Asp GGT > GAT Gly13Asp GGC > GACGly12Ala GGT > GCT Gly13Ala GGC > GCCGly12Val GGT > GTT Gly13Val GGC > GTC【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras 基因12，13密码子是否存在突变。
人类HER2基因扩增检测试剂盒说明书
ICS11.100CCS44CASME中国中小商业企业协会团体标准T/CASME XXXX—2023人类HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）Human detection kit for analysis of HER2gene abnormalities（fluorescent in situhybridization）（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。
XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施目次前言 (II)1范围 (1)2规范性引用文件 (1)3术语和定义 (1)4要求 (1)5试验方法 (2)6标识、标签、使用说明书 (3)7包装、运输和贮存 (4)前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，本文件 3.2的相关内容涉及到(CN103409504B)《一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法》发明专利的使用。
本文件的发布机构作为此项专利的持有人愿意同任何申请人在合理且非歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。
该专利持有人的相关信息可以通过以下联系方式获得：专利申请人或受让人：武汉康录生物技术股份有限公司。
联系地址：武汉东湖新技术开发区高科园三路9号武汉光谷精准医疗产业基地一期(全部自用)8号厂房1-4层（1)厂房号。
联系人：联系电话或邮箱：请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由武汉康录生物技术股份有限公司提出。
本文件由中国中小商业企业协会归口。
本文件起草单位：武汉康录生物技术股份有限公司、宝日医生物技术（北京）有限公司、赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司、宝生物工程（大连）有限公司。
本文件主要起草人：孙华、付杰、陈刚、于福功。
人类HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）1范围本文件规定了人类HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的术语和定义、要求、检验方法、使用说明、标志、标签以及包装、运输、贮存。
KRAS基因突变及BMP3 NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒产品审评摘要
KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒（PCR 荧光探针法-胶体金法）产品审评摘要一、产品概述（一）产品主要组成成分表 1 试剂盒组成、规格各组分的主要成分详见说明书。
该产品配套使用的样本采集装置和核酸提取试剂为杭州诺辉健康科技有限公司生产的粪便检验预处理装置（浙杭械备20160367号）和核酸提取或纯化试剂（浙杭械备20180059号）。
（二）产品预期用途本试剂盒用于体外定性检测人粪便样本中的KRAS基因突变（包括但不区分G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D）、BMP3和NDRG4基因甲基化及血红蛋白，各个指标的检测值通过“KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测分析软件”计算综合评分，用于对肠镜依从性差的结直肠癌高风险人群的筛查。
综合评分大于或等于阳性判断值的样本为阳性，表示受检者体内可能有结直肠癌和/或进展期腺瘤，需要进一步接受肠镜检查；反之，如果综合评分低于阳性判断值，表示受检者体内有结直肠癌和/或进展期腺瘤的可能性低，但并不能完全排除疾病风险。
鉴于受试者为高风险人群，因此在必要时仍应建议进行肠镜检查。
该产品适用人群为年龄40-74岁的结直肠癌高风险人群（高风险人群判定参照中国结直肠肿瘤早诊筛查相关专家共识）。
本产品不能替代肠镜，不能用于普通人群的肿瘤筛查，临床诊断过程中不应以本产品检测结果作为临床诊断的唯一依据。
（三）产品包装规格48测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒基于荧光PCR技术和胶体金技术，对粪便样本中可能含有的脱落肠道癌变细胞中的变异核酸物质及粪便中可能潜隐的血红蛋白进行检测。
本试剂盒基因检测部分针对粪便DNA中的KRAS基因点突变及BMP3和NDRG4基因中CpG岛胞嘧啶甲基化。
其中KRAS检测采用TaqMan探针及ARMSPCR达到对KRAS基因第二外显子12和13编码子上7种点突变的特异性检测。
四正柏生物科技基因定点突变试剂盒说明书
基因定点突变试剂盒保存条件及效期：−20℃保存，有效期一年。
产品描述：定点突变是一种广泛应用的分析蛋白和DNA 的非常有力的工具。
普通的定点突变试剂盒通常是基于反向PCR 技术，采用高保真耐热DNA 聚合酶和互补的突变引物向目的基因引入单个碱基或多个邻近碱基的突变、缺失、或插入。
当遇到多个位点突变的需求时，利用单点突变试剂盒只能对目标位点逐一引入突变，耗时费力。
Mut Multi Site-directed Mutagenesis(MSDM)Kit 针对每一个目标突变只采用一条突变引物，利用Mut MSDMEnzyme 的耐热DNA 聚合酶活性合成与模板互补的带有引物突变的DNA 链，然后通过其耐热的连接酶活性修复突变DNA 链之间的切刻(nicks)，使其连接成为一条与模板互补的突变单链DNA 。
经过多个PCR 循环反应后，带有多个特定突变的DNA 链成倍增长。
PCR 反应结束后，采用DpnI 限制性内切酶消化含有甲基化的双链质粒模板，而带有突变的环形单链质粒则通过转化而在大肠杆菌体内复制，最终得到带有不同突变组合的质粒DNA 。
本试剂盒适用于≤6kb 质粒的多点突变，根据质粒性质不同，最多可引入5个位点的突变、插入或删除(通常以1~3个位点突变为主)。
该方法操作简单快捷，突变阳性率高。
产品组分:产品编号规格MSM5303-1010rxnMut MSDM Enzyme12μl 10x MutMSDM Buffer 100μl MutdNTPs25μl Dpn I (10U/ l)12μl ddH 2O1ml版本号:2016-02-19产品说明书图1.Mut 多点基因定点突变试剂盒原理和操作流程示意图使用方法：1.模板准备：(1)请使用6kb以下的质粒作为模板；如果模板质粒过大，可将所需突变的序列亚克隆到较小的载体中，完成突变后再克隆到目的载体中。
(2)对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的质粒)，可通过转化dam＋的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR反应模板。
艾德人类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）
艾德⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告产品中⽂名称：⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）产品管理类别：三类6840申请⼈名称：厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司国家⾷品药品监督管理总局医疗器械技术审评中⼼⽬录基本信息 (3)⼀、申请⼈名称 (3)⼆、申请⼈住所 (3)三、⽣产地址 (3)产品审评摘要 (4)⼀、产品概述 (4)⼆、临床前研究摘要 (7)三、临床评价摘要 (15)四、收益-风险评估 (24)综合评价意见 (28)基本信息⼀、申请⼈名称厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司⼆、申请⼈住所厦门市海沧区⿍⼭路39号三、⽣产地址厦门市海沧区⿍⼭路39号产品审评摘要⼀、产品概述（⼀）产品主要组成成分表1 试剂盒主要组成成分试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。
（⼆）产品预期⽤途本试剂盒⽤于定性检测⾮⼩细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的⽯蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。
其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显⼦缺失（19del）、L858R点突变⽤于吉⾮替尼⽚的伴随诊断检测，T790M点突变⽤于甲磺酸奥希替尼⽚的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）⽤于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野⽣型⽤于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所⽰。
表2 伴随诊断⽤途的基因变异类型及相应的靶向药物表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。
表3 未经伴随诊断⽤途验证的基因变异类型其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯⼀依据。
临床医⽣应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进⾏综合判断。
（三）产品包装规格24测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒通过构建样本DNA测序⽂库，并使⽤特异探针对⽂库进⾏⽬标区域捕获富集，捕获后的⽂库通过⾼通量测序，可实现多个基因多个突变的⼀次性检测。
人类Kras基因突变检测试剂盒说明书
人类Kras基因突变检测试剂盒说明书人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物经过抑制这些途径发生药理作用。
K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。
据中国《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。
K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。
因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。
为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。
【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。
用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列，利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基因的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析，荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近而被淬灭，不发荧光，杂交状态时，二者相互离开而产生荧光。
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒英文名称：Shuwen®Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包装规格】7测试/盒【预期用途】EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。
EGFR的主要信号转导途径有：PI3K-PDK通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路，PLC-γ通路，JAK-STA T通路。
通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。
EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。
其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的A TP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。
目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。
外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。
另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。
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人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。
该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。
导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。
KRAS 基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。
但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。
因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。
大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。
本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。
辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。
该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。
表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 532 13-2-A 【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。
利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用双环探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异Taq酶的使用，在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，以达到对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度，即高的选择能力。
【主要组成成份】试剂盒采用8联PCR管设计，每一个8联PCR管检测一个样品，8联管的1-7(或A-G，或8联PCR管两端各有一个小孔，小孔居侧端为1号管，小孔居中端为8号管)管内装有相应的KRAS基因7种突变检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX（或VIC）信号指示；8（或H）号管作为DNA提取质量的外控检测管，亦由FAM信号指示，内控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控，选择的检测区域是人类KRAS基因相对保守的区段，约100bp，这样即便DNA有降解，外控和内控仍然能够最真实地反应KRAS基因有效的DNA量。
每个PCR反应管内均含有5～10 pM特异性引物、20 pM双环探针、12.5 μM dNTP s、175 μM氯化镁、1 mM硫酸铵、2.5 mM氯化钾和纯化水等。
（详见表2和表3）表2 试剂盒组成试剂盒规格12测试8联PCR管反应条12条Taq酶（KRAS）35 μLKRAS阳性质控品250 μL表3 8联PCR管反应条的组成管号检测试剂体积荧光信号1 A 12-2-A 35 μL FAM，HEX/VIC2 B 12-2-C 35 μL FAM，HEX/VIC3 C 12-2-T 35 μL FAM，HEX/VIC4 或D 12-1-A 35 μL FAM，HEX/VIC5 E 12-1-C 35 μL FAM，HEX/VIC6 F 12-1-T 35 μL FAM，HEX/VIC7 G 13-2-A 35 μL FAM，HEX/VIC8 H 外控35 μL FAM其它需要自备的试剂和耗材有：1.石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用厦门艾德生物公司的核酸提取试剂（型号：FFPE DNA，Cat NO. ADx-FF01）；组织和胸水可使用厦门艾德生物公司的组织、胸水样品DNA分离试剂盒（Cat NO. ADx-TI01）。
2.无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。
3.无DNase和RNase的纯化水。
【储存条件及有效期】须避光储藏在-20±5℃。
有效期为10个月。
开瓶后使用不影响产品有效期。
使用完毕后于-20±5℃保存。
试剂盒在运输过程中，需要泡沫箱加冰袋密封运输，运输时间不超过一周，运输温度不高于室温。
【适用仪器】Stratagene Mx3000P™/3005P™、ABI7900HT、ABI7500、ABI StepOnePlus、ABI7300、LightCycler480、Bio-Rad CFX96。
注意：①使用ABI仪器时探针模式设置，Reporter Dye：FAM、VIC；QuencherDye：TAMRA；Passive Reference：NONE。
②在ABI7900中，本试剂盒仅适用于ABI7900普通机型（非FAST机型），反应程序模式为标准模式，反应体积选择40 µL，且需要PCR 8联反应条辅助器（BIOplastics 公司，Cat：7900RAN）。
③适用于LightCycler480Ⅱ代仪器，若需在LightCycler480Ⅰ代仪器上使用，则必须进行荧光校正。
若LightCycler480Ⅱ代仪器也出现荧光交叉现象，则也需要进行荧光校正，且需要PCR 8联反应条辅助器（BIOplastics 公司，Cat：B-79480）。
④在使用Stratagene Mx3000P™/3005P™仪器时若发现荧光净升信号（dR）较低且本底荧光（R）非常高，应适当降低仪器的增益设置。
⑤有关各仪器的具体设置方法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司网站资料下载区获得。
⑥PCR仪器在使用过程中应至少每年校准一次。
【样本要求】检测所用DNA的质量非常重要。
由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，不同类型样品正常细胞混杂程度不同，而且提取的DNA纯度和质量也因样品类型而改变，尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样品，福尔马林会对DNA有交联和降解作用，因此请按下面推荐样品类型顺序收集样品并提取DNA用于检测，客户可根据临床实际样品的情况进行选择。
1.推荐样品类型顺序：新鲜病变组织>冰冻病理切片>石蜡包埋病理组织或切片。
2.推荐使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA。
所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度，其DNA的OD260/OD280在1.8～2.0。
提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。
3.从新鲜病变组织中取样应确定至少含有30%肿瘤病变组织。
4.石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，所取部分尽量在蜡块中部。
5.所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。
【检验方法】建议在每次PCR反应中，每份样品和阳性质控品（STD）、阴性对照（NTC，自备纯化水）共同进行分析。
1.取出KRAS阳性质控品和Taq酶（KRAS），阳性质控品先解冻，再振荡混匀。
阳性质控品和Taq酶（KRAS）需快速离心15秒待用。
2.分别向体积均为45 μL的待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水（NTC）中加入2.25 μL Taq酶（KRAS），涡旋器上混匀15秒，然后快速离心15秒。
（1）根据样品来源不同，可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。
新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。
（2）石蜡切片样品的DNA浓度推荐为1.5~3 ng/μL，即每单个反应管添加的DNA量为7.5~15 ng。
根据石蜡切片样品保存的年限不同，建议：保存不超过三个月的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度为1.5 ng/µL；保存年限三个月至一年的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度为2 ng/µL；保存年限一年至三年的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度为2.5~3 ng/µL；不推荐使用保存超过三年的石蜡切片样品。
（3）非石蜡切片样品的DNA浓度推荐为0.4~1 ng/μL，即每单个反应管添加的DNA量为2~5 ng。
（4）稀释样品DNA时推荐使用TE（pH8.0）。
稀释方法不推荐跨数量级稀释，即每次稀释倍数控制在10倍以内；稀释时取样量体积不宜小于5µL，以免稀释后终浓度与预算值有偏差。
3.在PCR管冰架上，轻轻揭开8联PCR管反应条的条盖。
如发现管盖内侧有液点，开盖前请先离心。
4.将混好的DNA样品依次取5 µL靠着PCR管上管壁加入8联PCR反应条中，然后小心盖上8联PCR管反应条管盖。
注意：加好样品的PCR反应条应立即上机实验；若因特殊原因不能及时上机反应，应将PCR反应条置于冰水混合物上或4℃冰箱（温度恒定）保存，保存时间不宜超过12个小时。
5.离心8联PCR管反应条。
6.将8联PCR管反应条放入实时PCR仪器。
PCR反应板布局见表4中推荐方法。
7.打开仪器窗口，按照下图中说明的扩增程序图进行设置。
第一阶段：95℃5分钟，1个循环；第二阶段：95℃25秒，64℃20秒，72℃20秒，15个循环；第三阶段：93℃25秒，60℃35秒，72℃20秒，31个循环；信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX（或VIC）信号，执行实时PCR，保存文件。
8.实验结束后，使用2层PE手套包扎好PCR反应条（使用Mx3000P仪器时应该待热盖冷却后再处理，以免烫伤，同时可避免由于PCR管盖较热易开造成污染），并按生物垃圾处理。
如非特殊需要，严禁打开PCR管盖，以防造成污染。
【阳性判断值及检验结果的解释】1.阴性对照(NTC)的1-7（或A-G）号管的FAM信号应无曲线升起。
若7管其中任一管FAM信号升起，则此次实验结果无效，同时建议重做一次。