实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册
RT-qPCR操作说明书
注意事项1.以下的Protocol主要适用于（1）所使用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。
2.RT-qPCR中的注意事项：（1）MgCl2的浓度2~4mM；（2）模板的浓度50ng~5pg之间；（3）引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择；（4）退火温度的选择，首次设置比实际小5℃的，之后在1~2℃选择；（5）引物设计的时候Tm值最好在60℃附近，正反向引物的Tm的差值在1~2℃之间；（6）抽提得到的RNA，需要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA的完整性；（7）在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）；（8）扩增曲线一定要做。
通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。
另外就是，一块板子上，尽可能取尽量多的样本，而不是基因；（9）扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的；（10）内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。
3.有关引物设计（1）扩增子长度小于150bp；（2）引物Tm的理想值57~60℃；（3）3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个；（4）GC含量介于20~80%，理想值40~60%；（5）避免引物二聚体及自身二级结构；（6）避免引物内的自身重复序列；4.在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线，做标准曲线的方法，以反转录得到的cDNA为模板，用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为基底，以10为倍数，稀释7~8个梯度（稀释点越多，稀释倍数越大，数据越精确），做qPCR，然后得到标准曲线。
利用标准曲线可以验证下列因素：（1）扩增效率；扩增效率E=10-1/斜率-1（2）标准品的梯度范围；（3）PCR抑制剂的存在于影响；（4）PCR仪验证灵敏度。
实时荧光定量PCR手册
3. 延伸：在 70-72°C 之间，DNA 聚合酶的活性最佳，引 物延伸速度达每秒 100 个碱基。当实时荧光定量 PCR 中的扩增片段较小时，通常将该步骤与退火步骤合 并，温度为 60°C。
在理论上，PCR 可呈指数型扩增 DNA，使每个扩增循环 中的靶分子数倍增。在 PCR 问世之初，科学家推断，通 过与已知标准品进行比较，利用循环数和 PCR 终产物的 量可以计算出遗传物质的起始量。为达到可靠定量的要 求，实时荧光定量 PCR 技术得以问世。如今终点 PCR 主 要用于扩增特定的 DNA，用于测序、克隆及其它分子生物 学技术。
两步法 qRT-PCR
两步法定量逆转录 PCR (qRT-PCR) 的第一步是采用逆转录 酶 (RT) 将总 RNA 或 poly(A) RNA 逆转录为 cDNA。采用 随机引物、oligo(dT) 或基因特异性引物 (GSP) 完成第一链 cDNA 合成反应。为在实时荧光定量 PCR 应用中平均表示 所有靶点并避免 oligo(dT) 引物的 3’ 偏差，许多研究人员 采用了随机引物或 oligo(dT) 和随机引物的混合物。
cDNA 合成采用的温度取决于所选的 RT 酶。逆转录完成 后，将约 10% 的 cDNA 转移至单独的管中，完成实时荧光 定量 PCR 反应。
一步法 qRT-PCR
一步法 qRT-PCR 可在同一管内完成第一链 cDNA 合成反 应和实时荧光定量 PCR 反应，简化了反应设置，并降低 了污染的可能性。需要使用基因特异性引物 (GSP)。这是 由于在一步法操作中使用 oligo(dT) 或随机引物将生成非特 异性产物，降低了目的产物的量。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
real-time qpcr technical 说明书
TECHNICAL MANUAL Real-time qPCR Technical Manual手把手教你从菜鸟到高手的学习手册Molecular Biology目录前言3 RT-PCR发展史3 RT-PCR概述3 RT-PCR实验设计8 RT-PCR操作流程9 RT-PCR数据分析16 RT-PCR问题分析19前言由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被Real-time qPCR所代替。
由于Real-time qPCR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测，很多没有做过Real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从Real-time qPCR的发展史说起，包括Real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作（以ABI StepOne仪器，和北京吉康医学科技有限公司的试剂为例），数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解Real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR的缺点，Real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman®技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
实时荧光定量PCR操作指南
实时荧光定量PCR操作指南实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、病毒检测、疾病诊断等领域。
本文将为您提供一份详细的实时荧光定量PCR操作指南，以帮助您正确高效地进行实验。
一、前期准备1.仪器准备确保实时荧光定量PCR仪的工作状态正常，能够提供稳定的温控和荧光检测功能。
2.试剂准备准备好使用的引物和探针、反转录酶、核酸模板、PCR酶、荧光探针等试剂，并按照相关说明进行稀释和储存。
3.实验室操作保持实验室环境清洁整洁，确保试剂和样品不受外界污染。
佩戴实验手套和口罩，避免DNA污染。
二、PCR体系设置根据您的实验目的和试剂系统的要求，设置PCR反应的体积和组分。
1.配置PCR体系a.将反向转录试剂盒中的试剂按照说明书中的比例进行配置，包括引物、探针、反转录酶、核酸模板等。
b.添加核酸模板到体系中，确保模板的质量和浓度适合实验要求。
c.添加合适的PCR酶，如Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶等。
d.添加稀释的胶原酶。
2.装管设置a.在无菌条件下，将PCR反应体系分装至PCR管中。
b.避免气泡的产生，确保体系均匀混合。
三、PCR参数设置根据实验需求和试剂系统的建议，设置PCR反应的温度和时间参数。
1.反转录步骤a.按照试剂盒说明书的建议，设置反转录温度和时间。
常见的反转录参数为42℃，60分钟。
2.PCR扩增步骤a.设置初始变性温度和时间。
常见的初始变性参数为95℃，5分钟。
b.设置PCR循环数和每个循环的温度和时间。
常见的PCR循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟，共40个循环。
c.设置荧光检测温度和时间。
根据荧光探针的特性，设置合适的温度和时间窗口。
四、数据分析和结果解读1.数据采集实时荧光定量PCR仪会自动记录荧光信号和温度变化数据，确保您保存这些数据供后续分析和结果解读使用。
real time quantative PCR(RT-PCR,qPCR)实时定量PCR详细操作流程
1.SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱。
2.引物特异性高，否则扩增有杂带。
3.反应温度和时间，根据酶和引物决定。
4.其他与常规PCR相同。
noise band建议刚好越过实验中设置的阴性孔。
不同的基因不需要相同的阈值，但是每块板上同一对引物扩增的基因使用相同的阈值。
横坐标：扩增循环数纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集荧光信号阈值：前15个循环信号作为荧光本地信号baseline，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。
荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct:PCR扩增过程中，扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值极具重现性。
定量时多取15-35较好。
1.dye kit：roche lightcycle 480 sybr green 1 masterKit中小瓶：Master 2x, 储存于-20℃，避光，避免反复冻融，使用前上下颠倒混匀，避免气泡，不能震荡Water，PCR grade储存于-20℃配制好的PCR反应液，可于室温稳定保持24h，需避光。
2.template：在20μl体系中，说明书中推荐20ng纯化的cDNA，50-100ng genomic DNA，108拷贝plasmid DNA。
根据以往经验，150-200ng cDNA（也许未纯化）为佳。
模板太多，会影响荧光发光。
如果模板不纯，则模板量不能超过2μl，预变性时间改为10min，可降低模板中杂质的影响。
3.primer：最终工作浓度为0.2-1μM, 推荐0.5μM。
引物浓度的原则是，达到目标荧光浓度时，最低引物浓度，导致最低crossing points，Cp值。
4.products: 产物长度最好不超过500bp5. system✧配制体系时，不能触摸PCR板的上表面以及封口膜，戴手套✧Master mix避光✧冰上加样✧准备好混合样品后，吹打混匀，不能震荡20μlMaster mix 10F（10μM）1（0.5μM）R（10μM）1（0.5μM）Template 1（150ng）DDW PCR grade 76.program：Incubation 95℃ 5min or 10min Amplification 95℃ 10s55-60℃（选58℃），5-20s（选20s）72℃5-30s（选30s）40 or 45 cyclesMelting Curve 95℃ 5s，65℃1min，97℃Cooling 40℃ 10s。
实时荧光定量PCR操作步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH25分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。
样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
RT-qPCR(实时荧光定量PCR)
• 2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹
探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成 。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产 生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信 号。
• 3、Amplisensor 双链信号引物，进行半巢式扩增
；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构 被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消 失，产物量与荧光成反比。
4. 反应Buffer体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6. 其他与常规PCR相同
优 点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜
缺 点
容易与非特异性双链DNA结合，产 生假阳性，但可以通过融解曲线的分
1
RT-qPCR 原理----绝对定量
R2为相关系数：R2>0.99时，认为 两数值之间相关性好。 E为扩增效率：一般认为在90%110%之间数据可用。 Logo
1
2.相对定量
RT-qPCR 原理----相对定量
病人内参 基因 Ct a
病人目的 基因 b
对照内参 基因 c
对Байду номын сангаас目的 基因 d
������−∆∆������������ = ������−(∆������������������−∆������������������) = ������−[
������−������ −(������−������)]
结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。
Logo
RT-qPCR 原理----融解曲线
荧光强度
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术一、实验目的：1、了解PCR的原理并熟悉其操作的方式。
2、学会使用PCR仪进行定量或定性的分析。
二、实验原理：常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。
2.1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-timePCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
2.2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。
这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。
所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异，所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。
2.3、荧光定量PCR中的概念2.3.1扩增曲线荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。
在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
实时定量pcr步骤(详细)
半定量和实时定量PCR步骤实验原理：RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。
另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA 文库克隆cDNA。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。
逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
在两步法RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。
cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
实验步骤：Trizol法RNA提取步骤1、提取总RNA2、逆转录反应3、PCR反应以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
rtqPCR实验操作 ppt课件
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
实时荧光定量PCR操作步骤
v201412Da
目
录
内 容
页 码
● 制品说明 ● 试剂盒原理 ● 制品内容 ● 试剂盒外必备主要试剂和仪器 ● 保 存 ● 使用注意 ● 操作方法 ● 实验条件的选择 ● 附 录 ● 质量标准 ● 关联产品
1 1 2 2 2 3 3 8 9 11 11
● 制品说明
本制品是采用 SYBR® Green I*嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。 制品中含有 Real Time PCR 反应的最适浓度 SYBR® Green I，是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，进行实验时，PCR 反应液的 配制十分方便简单。 本制品中还添加了 Tli RNaseH(耐热性 RNaseH)，以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，可以最大限度抑 制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 本制品 Buffer 经过改良， 使反应特异性比 SYBR® Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) （Code No.RR420A） 更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本 Buffer 和 Hot Start 法用 DNA 聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS 组合使用，可以进行重复性好、可信度高的 Real Time PCR 解析。 特长： 1. 适用于 Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2. 在 2×浓度的 Premix 中，预先混有 SYBR® Green I，PCR 反应液配制时，只需加入模板、引 物、灭菌蒸馏水便可进行 Real Time PCR 反应，操作简单方便。 3. DNA 聚合酶使用了 TaKaRa Ex Taq HS，可以进行 Hot Start 法 PCR 反应，再与 Takara Bio 公司独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 4. 在 2×浓度的 Premix 中， 预先添加了耐热性 RNaseH(Tli RNaseH)， 可以最大限度抑制以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 *：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR® 为 Molecular Probes Inc.的注册商标。
实时荧光定量PCR技术可编辑全文
淬灭(荧光)基团 TAMRA,BHQ1,MGB TAMRA,BHQ1,MGB BHQ2,MGB
校准物理误差:参比荧光(ROX)
• Master Mix中ROX浓度固定 • ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关 • ROX的功能：校准物理误差
–耗材质量、管盖厚度、透光性能
体系稳定性差 原料储存不当；体系配制时间 探针应避光；体系在冰上配制
过长；模板浓度低；模板不 ；使用合格的试剂盒制备模
纯，降解；
板，避免反复冻融；
···
谢谢
• 反应过程
MGB探针
• 新型TaqMan探针，其3`端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的 能量后并不发光，大大降低本底信号的干扰。此外MGB探针3`端还连接 了一个小沟结合物--二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模 板的杂交，提高探针Tm值，使得较短的探针也能达到较高的Tm值，淬灭 效果更好，荧光背景更低。
问题及优号
退火/延伸温度过高，引物未扩 取扩增后的产物5ul，2%琼脂
增或者探针未结合；探针设 糖凝胶电泳，观察电泳结果
计不合理；引物设计不合理 。若无条带或条带较弱，则
；···
降低退火/延伸温度，增加
离子强度，若优化无结果，
则需重新设计引物；若有条
带，则说明探针未结合，则
降低退火/延伸温度，若优
化无结果，则需重新设计探
针。
信号强度低， 基团本身信号弱；探针与引物 增加Mg2+的量；添加K+；增加
可能会导致 量不足；退火/延伸温度过高 探针与引物的量；降低退火
锯齿状曲线 ，探针结合能力弱；模板含 /延伸温度；提高模板浓度
；
有抑制物；离子强度低；
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)
关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR
方法简介
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.
RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):
1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3.总RNA或者mRNA
4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5.不同的酶以及酶的不同组合
6.变异系数、灵敏度
7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA 质量评价
现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR course (http://www-db.embl.de/jss/Embl GroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nan odrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
结果显示没有哪两种方法得到同样
的分析数据。
所以用不同的方法进行定量是不明智的。
因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。
传统的RNA 质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。
Agil ent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。
Agilent 的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。
样品的RINs在10-4之间。
10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA 的完整性。
这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。
设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。
探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。
扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。
如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR 抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，hep arin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌基因组检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议
使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3. 特异引物：最特异最灵敏的方法。
特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR 优化
PCR优化主要有：
1.引物的浓度
2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试
笔者建议的操作流程:
I．靶的选择和试验设计
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件. RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank (/primerbank/index.html)
Real Time PCR Primer Sets ()
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:
A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer()
B.DIY 的软件Primer Express
C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到
D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: /product s/probe_design.asp
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR
引物设计简介
DNA引物长度:15-25 个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争, 分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.
引物探针的保存一般遵循以下原则:
正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在/blast进行比对
3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计
4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过生物信息学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。
一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。
这是十分有必要的，特别当用基因组D NA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。
最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。
我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。
6.在RT步骤时，用(/applications/mfold/rna/form1.cgi) 工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低
7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。
GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是
的扩增时间缩短gDNA 污染可能性减少。
短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。
用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域。