酶活测定基本方法
酶活测定方法
酶活测定方法
测酶活？这事儿超简单！先准备好各种试剂，就像准备一场美食盛宴的食材。
然后按照步骤来，哇，那感觉就像在玩一场神秘的实验游戏。
步骤嘛，把样品加进去，看着反应发生，就像看着一场魔法秀。
注意别加错东西呀，不然就全乱套啦！那可太悲催啦。
安全性咋样？只要你小心操作，就没啥问题。
就像走在平坦的大路上，稳稳当当。
稳定性也不错，只要你严格按照要求来，结果就很靠谱。
就像盖房子，基础打好了就不会倒。
应用场景可多啦！比如研究生物过程，那可少不了酶活测定。
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就像有一把神奇的钥匙，能打开知识的大门。
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酶活测定，绝对是个超棒的方法。
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酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。
取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。
各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。
冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。
以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用P E塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100m L 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100m g 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
酶活测定实验方案
在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。
植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
酶的活力测定的原理是
酶的活力测定的原理是
酶的活力测定原理是通过测量酶催化下的反应速率来间接测定酶的活力。
一般情况下，可以在一定温度、pH值和底物浓度下进行反应，然后通过测量反应产物的生成速率或底物的消耗速率来确定酶的活力。
常用的酶活力测定方法有比色法、荧光法、化学发光法、电化学法等。
其中，比色法是最常用的方法之一。
比色法的原理是将产物或底物与某种试剂作用，使其产生特定的吸光度变化，然后根据吸光度的变化来计算酶的活力。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
酶活测定原理
酶活测定原理酶活测定是通过测定酶反应产物生成的物质量或反应速率来确定酶活性的一种方法。
这种测试被广泛应用于生物、医学、环境和食品科学领域。
本文将重点介绍酶活测定的原理和方法。
一、酶的定义和分类酶是一类具有催化生物反应能力的蛋白质，在生物体内担任调节代谢过程的重要角色。
酶的活性被认为是其特异性、选择性和效率的关键因素。
酶根据其催化反应类型，可以分为六类：1. 氧化还原酶：例如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，可以将还原剂氧化成相应的氧化物。
2. 转移酶：例如乙醛酸酯酶和谷氨酰胺转移酶，可以将一个基团从一个分子转移到另一个分子。
3. 加水酶：例如酯酶和葡萄糖苷酶，可以加入水分子切断化学键。
4. 合成酶：例如DNA聚合酶和RNA聚合酶，可以将单体结合成聚合物。
5. 裂解酶：例如蛋白酶和纤维蛋白溶解酶，可以降解大分子化合物。
6. 引导酶：例如酰基载体蛋白，可以在代谢过程中向该蛋白基团上结合或从该基团上解离。
二、酶活测定的原理酶活性通常通过测量酶反应的速率来评估。
酶反应速率与底物浓度、酶浓度、反应温度和pH值等条件有关。
在酶活测定中，这些条件必须被控制和标准化。
测量酶活性可以通过直接测量酶反应产物生成的量或测量反应底物消耗的量来进行。
下面介绍常用的酶活测定方法。
1. 进行光学密度测定酶活测定可以通过光学测量来实现。
在酯类水解反应中，酶催化酯水解为醇和羧酸。
在这种反应中，测量分离的醇透过率或吸光度变化，可以计算出相应的反应产物含量。
这种方法可以适用于其他酶反应，例如测定酒精脱氢酶催化的乙醛氧化反应。
2. 进行电化学测定另一种常用的酶活测定方法是电动势测定。
该方法用于测量电位差的变化以检测酶催化反应过程中电子的流动。
在氧化还原酶催化的反应中，测量体系中的电位差可以告诉我们酶的活性程度。
3. 进行放射性测定有些酶活性测定需要使用放射性示踪剂。
在DNA聚合酶催化下进行DNA复制实验中，可以使用放射性示踪剂来测量酶反应产物的数量。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.二、材料、仪器设备与试剂〔一〕材料；水稻或小麦叶片〔二〕仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯〔反应试管处照度为4000Lx〕；5.试管或指形管数支.〔三〕试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液〔pH7.8〕；2. 130mmol/L 甲硫氨酸〔Met〕溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片〔视需要定,去叶脉〕0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.2. 显色反应取5ml指形管〔要求透明度好〕4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂〔酶〕用量〔ml〕终浓度〔比色时〕0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min〔要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长〕.3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝<A ck－A E>×V/<A ck×0.5×W×V t>上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积〔ml〕Vt测定时样品用量〔ml〕W样鲜重〔g〕蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重. SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：〔V=3ml〕磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：<1> 0.05mol/L PBS：pH7.8<2> 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml<3> 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml<避光保存><4> 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml<5> 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml<避光保存>注：〔1〕对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管<2> 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：〔1〕5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml〔2〕0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：〔1〕0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A<0.2mmol/L的HAc溶液>—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中〔2〕0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中〔临用前配制〕〔3〕0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml〔临用前配制〕方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液〔5min值为500-800即可〕—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：<1> 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕 <2> 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：<1>以不加H2O2的50mmol/L的PBS〔pH7.0〕为空白把A240调零<2>50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min<连续读取5min>.20XX06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水.称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管〔做三个重复〕,加入25ml浓度为80％的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度,以80％的丙酮液为空白.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36〕也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰649Cx.c=<1000D470-2.05Ca-114Cb>/2452 抗氧化酶活性的定：〔2.5g样〕0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.8〕溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134〕. 取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液〔pH=7.8〕〔最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液.2.1丙二醛〔MDA〕的测定：20％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕；0.5% 硫代巴比妥酸〔TBA〕溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸〔TBA〕,用20％三氯乙酸〔TCA〕溶液溶解并定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕〔先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解〕；0.5ml酶液〔对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液〕〔做三个重复〕+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却〔至少30min〕――比色〔OD600、OD532、OD450〕.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕2.2超氧化物歧化酶〔SOD〕的测定：NBT<400ml>混合反应液:392mlPBS<Ph=7.8>,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液〔100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素〕.〔另配〕100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml<根>或0.02 ml<叶>粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度.2.3过氧化物酶〔POD〕的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.0〕溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml.0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS> + 0.02ml？？〔原来为0.01〕酶液〔根加0.05ml酶液〕〔对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液〕〔做三个重复〕,记录470nm处OD降低速度.将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕比色时加酶液,混合后即刻计时.2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量〔ml〕00.10.20.40.60.81.0H2O〔ml〕1.00.90.80.60.40.20冰乙酸〔ml〕2222222显色液〔ml〕3333333脯氨酸含量〔µl〕012468100.5ml酶液〔对照用0.5ml 80％乙醇代替〕〔做三个重复〕+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520.2.5可溶性蛋白的测定〔参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》〕牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml.90％乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水.？？？85％〔W/V〕磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水.考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中,加入85％〔W/V〕磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L.常温下可保存一个月.标准曲线的制作：配制0～100µg/ml血清白蛋白血液管号123456100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.020.040.060.080.10配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液管号789101112100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.20.40.60.81.00.1ml 酶液〔做三个重复〕+ 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色.2.6过氧化氢酶〔CAT〕的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到500ml.1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度.将每分钟OD 减少0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕2.7 抗坏血酸〔ASA〕的测定：〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125〕5％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml.10％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml.150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液的配制：100ml.44％H3PO4溶液的配制：250ml.4％2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml.3％FeCl3溶液的配制：100ml.首先标制作准曲线.粗酶液的提取：取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入15m 5％三氯乙酸〔TCA〕溶液〔最好是较冷的三氯乙酸〔TCA〕溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸〔ASA〕含量的测定.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕测定：0.2ml 粗酶液+ 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液+ 0.2ml H2O,混匀〔振荡〕,至少30秒后,再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸〔TCA〕溶液+ 0.4 ml 44％H3PO4溶液+ 0.4 ml 4％2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml 3％FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+ 2ml 0.3mol/L醋酸汞+ 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水〔每次10ml〕在摇动情况下冲洗2次.向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液,混匀,离心.上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗.离心后溶液与第一次离心液合并.向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止.1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽.〔参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院##植物生理研究所编〕.2.9天冬酰胺合成酶〔AS〕的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶〔AspAT〕的测定：3 硝酸还原酶<NR>的测定采用离体法：〔1g样〕〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29〕亚硝酸钠标准溶液〔1µg/ml〕：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml.0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml.3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml.1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中.0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中.0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液.0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L.提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液. 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液〔临用前配制〕. 首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液.摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色.以亚硝态氮〔μg〕为横坐标〔x〕,光密度值为纵坐标〔y〕绘标准曲线或建立回归方程.各试剂加入顺序管号1234567亚硝酸钠标准液<ml>00.20.40.81.21.62.0蒸馏水<ml>2.01.81.61.20.80.401％磺胺溶液<ml>44444440.2%α-萘胺<ml>4444444每管含NO2- <μg>00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶<NR>的测定.0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀〔对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替〕,在25℃水浴中保温30min.保温结束后立即加入1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2％a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度.根据回归方程计算.。
测定酶活性的方法
测定酶活性的方法
测定酶活性的常用方法有以下几种：
1. 吸光测定法：利用酶催化底物反应产生的产物对特定波长的光的吸收变化进行测定，常见的方法有比色法和荧光法。
2. 浊度测定法：在酶催化底物反应中，产生的沉淀、胶束或团聚物等形成浑浊或沉淀，通过测定反应溶液的浊度变化来确定酶活性。
3. 冷凝法：利用酶催化底物反应产生的产物，通过与特定试剂发生反应产生气体或形成沉淀，在特定条件下进行冷凝，并通过测定冷凝物的质量或体积变化来确定酶活性。
4. 离子选择性电极法：利用通过酶催化底物反应产生或消耗的离子浓度变化，通过检测特定离子选择性电极反应电位的变化来测定酶活性。
5. 标记物测定法：将底物或产物标记上特定的分子或放射性核素，通过测定标记物在反应中的变化来测定酶活性，如放射性测定法、荧光标记物测定法等。
这些方法根据不同的实验要求和酶的特性可以选择不同的测定方法来进行酶活性的测定。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
酶活性测定方法
酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm 下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶检测方法
酶检测方法酶是生物体内一类具有特定功能的蛋白质，它们在生物体内发挥着关键的催化作用。
酶的活性能够反映生物体内代谢的运行状态，因此酶检测在生物学研究、临床诊断和生物工程等领域起着重要的作用。
本文将介绍酶检测的方法，并分析其原理和应用。
一、酶检测的原理每种酶都具有特定的底物，当底物被酶催化后产生一定的产物，可以通过测量产物的数量或者相关反应的速率来间接反映出酶的活性。
酶的检测方法主要有光度法、荧光法、比色法和电化学法等。
光度法是利用酶催化反应后产生的物质溶液的吸收特性来检测酶活性的方法。
首先，选择具有特定光学属性的底物，使酶催化后的产物能够吸收特定波长的光线。
然后，通过测量反应体系中吸光度的变化来确定酶的活性。
举例：以辣根过氧化物酶的检测为例，辣根过氧化物酶能够将辣根过氧化物（HRP）和底物间的过氧化氢催化成高活性的自由基，进而氧化显色底物，形成有色产物。
利用比色法测定产物的吸光度变化，即可定量检测出辣根过氧化物酶的活性。
荧光法是利用酶催化反应产物的荧光特性来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，有些底物和产物具有荧光特性，通过测量产物的荧光强度变化可以确定酶的活性。
举例：以葡萄糖氧化酶的检测为例，葡萄糖氧化酶能够将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，产生荧光物质NADH。
通过测量NADH的荧光强度变化，可以判断葡萄糖氧化酶的活性。
比色法是利用酶催化反应后产生的有色产物来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，底物与其他试剂反应产生有色产物，通过测量产物的吸光度变化来确定酶的活性。
举例：以碱性磷酸酶的检测为例，碱性磷酸酶能够将对硝基苯磷酸钠底物催化成黄色产物对硝基苯胺。
通过测量对硝基苯胺的吸光度变化，可以确定碱性磷酸酶的活性。
五、电化学法电化学法是利用酶在电极表面催化产生电流来检测酶活性的方法。
在电极表面固定酶，底物被酶催化后，产生电荷转移，可以通过测量电流变化来确定酶的活性。
举例：以谷胱甘肽还原酶的检测为例，谷胱甘肽还原酶能够将还原型谷胱甘肽（GSH）氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。
酶活的测定方法
酶活测试及试剂1 木素过氧化物酶（Lip）：3ml反应体系：①0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0) 1.5mL；②10mmol/L藜芦醇1.0mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，25℃反应3min。
于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。
0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)：配0.1mol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为3.0。
（酒石酸：分子量75，0.1mol/L溶液为7.5g/L。
酒石酸钠：分子量230，0.1mol/L溶液为23g/L）10mmol/L藜芦醇：1.682g藜芦醇添加到1L水中即可（试剂藜芦（3,4-Dimethoxybenzyl alcohol）的分子量为168.19）10mmol/L H202（按1L计算）：称取1.13g过氧化氢试剂加入到1L纯水中即可（原试剂含30% H202）2 锰过氧化物酶（MnP）：3ml反应体系：① 0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5) 2.0mL；②15mmol/LMnSO4 0.5mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，37℃反应3min。
240nm测吸光值变化。
三价锰离子的吸光系数为8100 M−1 cm−1）0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5)：配0.05mol/L的琥珀酸和琥珀酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为4.5。
（琥珀酸：分子量118.09，0.05mol/L 溶液为5.9g/L。
琥珀酸钠：分子量270.15，0.05mol/L溶液为13.5g/L）15mmol/L MnSO4（按1L计算）：2.535g硫酸锰加入到1L纯水中溶解即可。
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前处理：称取叶片0.5克，加5ml（1+4）提取液PH7.8 Pbs，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为粗酶提取液。
注：粗酶提取液要全部转移；加入石英砂后离心需配平1.SOD测量取透明度好的指形管，按下表加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）0.05M磷酸缓冲液 1.565mM Met溶液0.3500uM NBT溶液0.3100uM EDTA-Na20.3200uM核黄素0.3酶液0.1（对照管加缓冲液）蒸馏水0.5总体积 3.3混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，其余各管于4000lx光下反应20-30min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，560nm测定OD值。
按下式计算SOD活性。
SOD总活性=[(ACK —AE)×V]/[ ACK×1/2×W×a]SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以每克鲜重每单位表示：比活力单位以酶单位/mg蛋白表示ACK—照光对照管的消光度值AE—样品管的消光度值V—样液总体积（ml）a—测定时样品用量（ml）W—样重（g）蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。
【试剂配制】磷酸缓冲液配制：母液：A：Na2HPO4•12H2O 36g，稀释至500mlB：NaH2PO4•2H2O 15.92g，稀释至500ml提取液配制：取0.0186gEDTA（0.1mM），5g PVP （1%（g/ml））,用磷酸缓冲液（PH7.8）稀释至500ml。
PH7.8 Pbs配制：A 114.35ml + B 10.625ml，定容至500ml。
PH7.0 Pbs配制：A 152.5ml（76.25ml）+ B 97.5ml（48.75ml）稀释至1000ml （500ml）。
65 mmol/L Met: 取0.97g Met 用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml；500 umol/L NBT:取0.0409g NBT用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml（避光保存）；100 umol/L EDTA-Na2: 0.03721g（0.0186g）EDTA-Na2磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；200 umol/L 核黄素：0.0753（0.03765）g核黄素磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；（现用现配）注：若要抑制Cu-Zn/SOD的活性，可加入30mM的KCN0.3ml；若要抑制Cu-Zn/SODFe-SOD的活性，可加入50mM的H2O2（0.52ml 30%的H2O2稀释至100ml） 0.3ml；2.CAT酶提取液：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，4℃下保存备用。
（同上）0.1 ml 酶提取液+ 2.9 ml CAT 反应液，240nm比色，（10s∕20s）。
【E=39.4mMcm-1】活性=OD×1000/E(umol/L);CAT反应液：0.28ml 30%的H2O2用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至250ml。
（H2O2为10mM）。
3.APX酶液提取液配制：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为APX酶粗提液，4℃下保存备用。
（如果是长期保存的材料，则提取液为0.186g EDTA，0.7418g ASA，用pH7.0的缓冲液定容到500ml，此处作用是防止APX失活，但是新鲜材料则两种提取方法对后来结果影响差异不明显）。
APX 反应液：11.2ul 30%H2O2+0.04718gASA，磷酸缓冲液（pH7.0）定容到500ml。
（此反应液必须现配现用）0.1 ml 酶提取液+2.9 ml APX反应液，290nm比色（0~40s）。
4.POD酶液提取液配制：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为POD粗提液，4℃下保存备用。
POD反应液：0.125ml愈创木酚+0.2553ml 30%H2O2，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至250ml。
20ul酶提取液+3ml POD反应液，470nm比色（0s/30s）。
5.可溶性蛋白测定0.1 ml酶提取液（测SOD的酶提取液）+5ml 考马斯亮蓝G250，反应2 min，595nm 比色，按下式计算蛋白质含量：蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C×V/a）/WC—查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）V—提取液总体积（ml）a—测定所取提取液体积（ml）W—样品重（g）考马斯亮蓝G250：0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%磷酸100ml，蒸馏水定容至1000ml。
（配好后最好过滤）注：抗氧化酶液可以统一提取———称取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（直接用pH 7.8Pbs即可）和少量石英砂，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为酶粗提液，4℃下保存备用。
同时酶液可用于测定可溶性蛋白质含量和超氧阴离子自由基的含量！注意CAT反应液和APX反应液要现用现配。
6.MDA含量测定称取剪碎的材料0.5g（需3个重复，也可直接取1.5g,然后再分3个样），用5ml（2+3） 10%TCA和少量石英砂研磨，10000g离心10min，上清液为提取液。
取提取液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min(玻璃试管)，迅速冷却后再3000g离心10min，取上清液测定450nm，532nm，600nm比色（M波长添加，三波长，分别是450 532 600，调零：基线400-700 结果：读取或F9）；按下式计算MDA浓度（umol/l）：C=6.45(D532-D600)-0.56D450MDA含量（umol/g）= MDA浓度（umol/l）×提取液体积（ml）/植物鲜重（g）【试剂】10%三氯乙酸（TCA）：50gTCA溶解于500 ml蒸馏水中。
强腐蚀性0.6%（体积比）硫代巴比妥酸（TBA）：先用少量的NaOH（10mol/L）溶解，再用10%TCA定容。
7.游离脯氨酸的测定取剪碎的材料0.2g，置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸盖口，沸水浴中浸提10min，冷却至室温，吸取上清液2ml（对照为蒸馏水），取2ml冰乙酸和3ml 2.5%酸性茚三酮，沸水浴反应40min，冷却后加5ml甲苯，充分震荡，静置分层，取上层甲苯溶液520nm比色。
【试剂】3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸溶于100ml蒸馏水中2.5%酸性茚三酮显色液：0.625g酸性茚三酮+15ml冰乙酸+10ml磷酸。
（现用现配）8.可溶性糖（蒽酮法）称取0.3g材料，放入试管中，加入10ml蒸馏水，封口，沸水浴30min，提取液过滤入50ml容量瓶，冲洗残渣及试管，定容。
吸取提取液1ml（空白为蒸馏水）于20ml刻度试管中，加入1ml蒸馏水，然后再按顺序加入0.5ml蒽乙和5ml浓硫酸，充分震荡，立即放入沸水浴中1min，冷却，630nm比色。
按下式计算可溶性糖含量：可溶性糖含量（%）=（C×V/a×N）/(W×106)C—标准方程式求的糖含量（ug）a—吸取样品液体积（ml）V—提取液量（ml）N—稀释倍数W—样品重量（g）蒽乙（蒽酮乙酸乙酯）：蒽酮1g+50ml乙酸乙酯（棕色瓶黑暗保存）9．细胞膜透性的测定（电导法）参照赵世杰等（2002）的方法。
用直径0.8cm的打孔器避开主脉打取用去离子水冲洗干净的叶圆片4片，放入洁净的具塞试管中，加入5ml含吐温（-80）的去离子水，室温下平衡2小时，期间要多次摇动试管，用DDS-307型电导率仪（上海精密科学仪器有限公司）测其初电导值。
测毕，置沸水浴中30min，冷却至室温，测其终电导。
以相对电导率表示细胞膜相对透性，其值是电导率与总电导率的比值。
10．膜渗透——电解质外渗法（叶片电导率的测定）参照赵世杰等（1998）的方法。
打取直径直径0.8cm的叶圆片，放入洁净的具塞试管中，用去离子水漂洗3次，加去离子水15ml置真空泵中抽气30min，后放振荡器上振荡3h，取下静置摇匀，测定初电导。
然后煮30min，冷却至室温，测其终电导。
相对电导率（%）=（初电导-空白）/（终电导-空白）×100%伤害度=（处理相对电导率-空白相对电导率）/（100-空白相对电导率）1)分别取常温和低温处理的植株上的同一叶位上的叶片，用去离子水清洗2次，然后用吸水纸洗净表面水分。
用打孔器打取叶圆片（避开主脉），每个处理打取叶片30片，每个管放10片。
2)管中加入15 ml含吐温的蒸馏水，然后将试管放入真空干燥箱中真空抽气10min。
3)然后将试管置室温下在振荡器上振荡1h。
4)用电导仪测初电导值（S1），然后将试管封口，置沸水浴中10min，以杀死植物组织。
取出试管用自来水冷却至室温，并在室温下平衡10min，摇匀，测终电导（S2），然后测含吐温的蒸馏水的电导值（S）。
计算相对电导度L（L=( S1—S) / ( S2—S)）5)伤害度（%）=（LTK—LCK）/（1—LCK）×100L TK 处理叶片的相对电导；LCK对照叶片的相对电导6)注意事项：S0 S1 —S2必须在同一温度下测定。
测定时不要让CO2进入试管。
11．叶片水势的测定打取叶圆片，置于露点微伏压计（HR-33-T-R,USA）封闭的不锈钢叶室内平衡2h （受胁迫的叶片时间要长一些），记录电热差，同时读取实测温度（T ℃），电热差除以0.75 uv/bar便是被测样品的水势（bar），1bar=105Pa。
叶片的实际水势=实测水势/（0.325+0.027T）12. 叶绿素含量的测定0.1g叶片，加入20ml 96%乙醇，黑暗处放置40h在665，649，470nm比色（95%乙醇调零）。
叶绿素a(Ca)=13.95D665-6.68D649叶绿素b(Cb)=24.96D649-7.32D665类胡萝卜素的总浓度Cxc=（1000D470-2.05 Ca-114.8Cb）/24513. 氧自由基的测定参阅中国科学院植物生理研究所和上海市植物生理学会编《现代植物生理学实验指南》北京科学出版社，1999：308-309（1）0.5ml酶提取液（测SOD的酶提取液）+0.5ml Pbs（50mM pH7.8）+1ml盐酸羟胺（1mM,相对分子量为69.49）摇匀。