酶活测定基本方法

前处理：

称取叶片0.5克，加5ml（1+4）提取液PH7.8 Pbs，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为粗酶提取液。

注：粗酶提取液要全部转移；加入石英砂后离心需配平

1.SOD测量

取透明度好的指形管，按下表加入各溶液：

试剂（酶）用量（ml）

0.05M磷酸缓冲液 1.5

65mM Met溶液0.3

500uM NBT溶液0.3

100uM EDTA-Na

2

0.3

200uM核黄素0.3

酶液0.1（对照管加缓冲液）

蒸馏水0.5

总体积 3.3

混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，其余各管于4000lx光下反应20-30min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，560nm测定OD值。按下式计算SOD活性。

SOD总活性=[(A

CK —A

E

)×V]/[ A

CK

×1/2×W×a]

SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度

SOD总活性以每克鲜重每单位表示：比活力单位以酶单位/mg蛋白表示A

CK

—照光对照管的消光度值

A

E

—样品管的消光度值

V—样液总体积（ml）

a—测定时样品用量（ml）

W—样重（g）

蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。

【试剂配制】

磷酸缓冲液配制：

母液：A：Na

2HPO

4

•12H

2

O 36g，稀释至500ml

B：NaH

2PO

4

•2H

2

O 15.92g，稀释至500ml

提取液配制：取0.0186gEDTA（0.1mM），5g PVP （1%（g/ml））,用磷酸缓冲液（PH7.8）稀释至500ml。

PH7.8 Pbs配制：A 114.35ml + B 10.625ml，定容至500ml。

PH7.0 Pbs配制：A 152.5ml（76.25ml）+ B 97.5ml（48.75ml）稀释至1000ml （500ml）。

65 mmol/L Met: 取0.97g Met 用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml；

500 umol/L NBT:取0.0409g NBT用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml（避光保存）；

100 umol/L EDTA-Na

2: 0.03721g（0.0186g）EDTA-Na

2

磷酸缓冲液（PH 7.8）定

容至1000ml（500ml）；

200 umol/L 核黄素：0.0753（0.03765）g核黄素磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；（现用现配）

注：若要抑制Cu-Zn/SOD的活性，可加入30mM的KCN0.3ml；若要抑制Cu-Zn/SOD

Fe-SOD的活性，可加入50mM的H

2O

2

（0.52ml 30%的H2O2稀释至100ml） 0.3ml；

2.CAT

酶提取液：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，4℃下保存备用。（同上）

0.1 ml 酶提取液+ 2.9 ml CAT 反应液，240nm比色，（10s∕20s）。

【E=39.4mMcm-1】活性=OD×1000/E(umol/L);

CAT反应液：0.28ml 30%的H

2O

2

用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至250ml。（H

2

O

2

为

10mM）。

3.APX

酶液提取液配制：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为APX酶粗提液，4℃下保存备用。（如果是长期保存的材料，则提取液为0.186g EDTA，0.7418g ASA，用pH7.0的缓冲液定容到500ml，此处作用是防止APX失活，但是新鲜材料则两种提取方法对后来结果影响差异不明显）。

APX 反应液：11.2ul 30%H

2O

2

+0.04718gASA，磷酸缓冲液（pH7.0）定容到500ml。

（此反应液必须现配现用）

0.1 ml 酶提取液+2.9 ml APX反应液，290nm比色（0~40s）。

4.POD

酶液提取液配制：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为POD粗提液，4℃下保存备用。

POD反应液：0.125ml愈创木酚+0.2553ml 30%H

2O

2

，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释

至250ml。

20ul酶提取液+3ml POD反应液，470nm比色（0s/30s）。

5.可溶性蛋白测定

0.1 ml酶提取液（测SOD的酶提取液）+5ml 考马斯亮蓝G250，反应2 min，595nm 比色，按下式计算蛋白质含量：

蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C×V/a）/W

C—查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）

V—提取液总体积（ml）

a—测定所取提取液体积（ml）

W—样品重（g）

考马斯亮蓝G250：0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%磷酸100ml，蒸馏水定容至1000ml。（配好后最好过滤）