酵母单、双杂交PPT
酵母双杂交
X DBD-X 融合蛋白 DBD Y
Y
AD-Y AD 融合蛋白
AD
报告基因产物 激活转录 构建 表达
UAS 上游激活序列
报告基因 即：DBD-X为诱饵蛋白，AD-Y为猎物蛋白
一般步骤
1.改造酵母
使用特定的营养缺陷型菌株 例：Trp与Leu缺陷型，即酵母菌自身不能合成Trp和Leu，需 要从培养基中吸收Trp和Leu。
酵母双杂交系统的优点
•根据目标蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白， 不需分离靶蛋白 •蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相 互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合 也可被检测出来，真实反应体内蛋白质间相互作用情况
•可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断 目的蛋白的结的足够丰富的多样性 提供尽可能多地与AD连接位点 插入片段不能过大，否则因为非特异结合所导致的假阳性增多 选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的是综 合提高双杂交技术的一个重要方面。
改进
•4.利用酵母交配（yeast mating）可以很方便地将两种不 同的质粒转入同一酵母菌株。据此已发展出一套快速鉴 定假阳性的方法。 •5.体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验 证。
常见问题
•2.如果诱饵蛋白DBD-X能直接激活报告基因的表达，该如 何处理？ •该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过 基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活， 但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
常见问题
•3.转化效率太低怎么办？ •可以采用以下方法解决： 1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯 化。 2) DNA-BD很可能是有毒的。 3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。 4) 共转化或者单独转化
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交操作步骤
酵母双杂交操作步骤(总9页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母单杂交技术
酵母单杂交技术1．酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
酵母单杂交原理示意图2．酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。
应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。
近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。
随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。
采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
知无不“研”一文读懂酵母单双杂交点对点验证
知⽆不“研”⼀⽂读懂酵母单双杂交点对点验证⼀、前⾔酵母双杂交由Fields和Song在1989年提出. 他的产⽣是基于对真核细胞转录因⼦特别是酵母转录因⼦GAL4性质的研究。
酵母双杂交就是基因转录所需的转录因⼦的两个结构域在两个互作蛋⽩的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。
酵母双杂交系统的最主要的应⽤是快速、直接分析已知蛋⽩之间的相互作⽤，及分离新的与已知蛋⽩作⽤的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋⽩之间的相互作⽤具有以下优点：•⑴作⽤信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因⼦的作⽤⽽给出的，省去了纯化蛋⽩质的繁琐步骤。
•⑵检测在活细胞内进⾏，可以在⼀定程度上代表细胞内的真实情况。
•⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因⽽可检测存在于蛋⽩质之间的微弱的或暂时的相互作⽤。
•⑷酵母双杂交系统可采⽤不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA⽂库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋⽩等多种不同亚细胞部位及功能的蛋⽩。
⼆、酵母单/双杂交简介1、酵母单杂交酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展⽽来的⼀种研究核酸-蛋⽩相互作⽤的⼯具，被⼴泛⽤于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋⽩基因、分析DNA结合结构域信息等。
2、酵母双杂交酵母双杂交及系统是⼀种鉴定和检测蛋⽩质相互作⽤的研究⽅法，因其具有灵敏性⾼、功能强⼤、适⽤范围⼴等特点，现已被应⽤于多个研究领域。
①核蛋⽩酵母双杂交：核蛋⽩酵母双杂交技术最初由Fields等⼈在研究酵母转录因⼦GAL4性质时建⽴，后续经过不断改进已发展成为⼀种成熟的蛋⽩-蛋⽩互作研究⼯具，具有简便、灵敏、可反映蛋⽩在活细胞内互作真实情况的特点，被⼴泛应⽤于互作蛋⽩的筛选、蛋⽩相互作⽤的鉴定/验证、蛋⽩互作机理的探究、蛋⽩连锁图谱绘制等⼯作。
②膜蛋⽩酵母双杂交：DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利⽤分离的泛素系统（split-ubiquitin）进⾏蛋⽩质相互作⽤的筛选；泛素作为降解信号分⼦，⼈为分成两部分：N端（Nub），C端（Cub），互补重构的完整泛素分⼦可被泛素专⼀性蛋⽩酶（UBPs）识别，从⽽导致与泛素相连的蛋⽩被酶解。
酵母单杂交1
酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的
酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的 基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因 的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相 互作用。
酵母单杂交系统组成 (1)将基因片段与GAL4转录激活域融合报告基因的报告质 粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）
酵母单杂交序列，而无需分离、 纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋 白质是处于自然构象，克服了体外研究时 蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而 具有很高的灵敏性。
酵母单杂交体系的缺点:
假阳性结果 由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能 发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激 活因子就可以激活报告基因的转录 假阴性结果 如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或 融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融 合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细 胞核内，以及融合的Ga14 AD封闭了蛋白上与 DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋 白结合于靶元件的能力
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZ
AD
Prey-AD
Bait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
酵母双杂交
• 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白 质之间相互作用的影响 • 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之 间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采 取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病 的目的。 • 例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发 现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5） 与拓扑异构酶 NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin 的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这 些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基 因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病 毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
• 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map） • 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是 彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基 因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序 和序列分析发现了很多新的基因和EST序列， HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立 基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活 动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
• 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高 度敏感性。主要是由于： ①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。 ②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉 淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号 强度。 ③ 杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合 形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。 ④ 通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母 表型、X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母菌遗传课件
1.着丝粒
• 概念 着丝粒是真核细胞染色体DNA上的一段特殊序列。在有丝分 裂和减数分裂时，纺锤丝与着丝粒结合，将染色体拉向细胞的两极。 • 主要类型：点着丝粒（着丝粒序列很短 酿酒酵母） 区域着丝粒（着丝粒序列较长 脉胞菌、果蝇、人 ）
1.着丝粒
在酿酒酵母中，所有染色体的CEN序列的长度均大于130bp，
酵 母 菌 遗 传
酵母菌概述
酵母菌：一种单细胞真菌，属于兼性厌氧菌；个体形态有球状、卵圆、椭圆、 柱状和香肠状等。 酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、 线粒体等，酵母菌虽属于真核微生物，同时又具有原核生物的某些特征，例如 形成菌落特征与细菌相似，生长速度快等。 1996年完成酿酒酵母全基因组的测序，是当时完成测序的最大基因组，也是 真核生物中第一个被测序的生物。
2.GAL4转录因子和gal基因的表达调控
• 酵母半乳糖代谢酶基因（gal）表达可以被生长条件所控制。 半乳糖通过转化为6-磷酸葡萄糖后进入糖酵解途径而被酵母利用 。 • gal基因的转录是被严格调控的。gal1基因、gal7基因、gal10 基因和gal12基因在没有半乳糖的条件下不表达，而在半乳糖存 在条件下表达水平提高约1000 倍。 3.GCN4转录调控因子 GCN4能特异结合到许多氨基酸合成酶基因的启动子
1. 通用转录因子 结合在TATA序列附近，包括TFII-A、TFII-B、TGII-D、TFII-E、 TFII-F等。 2. 转录调控因子（结合在启动子上游） 转录调控蛋白由两个独立的结构域组成： （1）DNA结合区 （2）转录激活区
1.TATA 区结合蛋白
• 转录起始复合物由 TATA 元件附近序列及转录起始位点等顺式 作用元件和多种通用转录因子及RNA聚合酶Ⅱ组成。 • 成环假说
育种--酵母双杂交
酵母转录因子（ 酵母转录因子（Gal 4） ）
与BD-fusion ---诱饵（bait） 诱饵（ ） 诱饵 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein） 猎物或靶蛋白（ ）
报告基因（ 报告基因（reporter gene） ）
---Lac Z（编码β-半乳糖苷酶） 半乳糖苷酶） （编码β 半乳糖苷酶
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 和 将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 质粒上，一个是将 的 与酵母蛋白 SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白 融合；另一个是将 的 和酵母蛋白 融合 SNF4融合。 融合。 融合 其中， 是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 其中，SNF1是一种丝氨酸 苏氨酸的蛋白激 是一种丝氨酸 是它的一个结合蛋白， 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 是它的一个结合蛋白 已知可以相互作用的。 已知可以相互作用的。
（二）酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
AD
Y
GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene
AD
X
DNA-BD
Y
Promoter
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
1989年美国纽约州立大学的 年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述 年美国纽约州立大学的 和 首先描述 了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 了酵母双杂交系统 。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： DNA结合结构域 结合结构域(BD) 结合结构域 (DNA binding domain)
酵母双杂
Total
351ml
两种质粒。所以，这种情况下，最好先将诱饵质粒转入
注意：此处的加入顺序非常重要，PEG必须得首先加入， 它可以将酵母细胞与高浓度的LiAc分开，使酵母免
酵母中（用本方法或快速转染的方法），然后再Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-
1、制备酵母感受态，实验步骤同上；
7、以6000～8000rpm离心30s，用微量移液枪尽量除去转
2、将1 mL单链载体DNA样品煮沸5 min，迅速 化混合液；
置于冰水中冷却； 3、取制备好的酵母感受态，14000rpm，离心 30s，用微量取样器尽量除去残留的LiAc； 4、往盛有酵母感受态的离心管中按表7加入酵 母转化所需物质：
中文方法：
（样品较多时候可以先把其他的加好，最后分加入管内） 4、漩涡离心混匀，然后置于30℃气浴锅中温浴30分钟，
酵母双杂交体系的转化方法(一对一转化遵照此
其中每隔10分钟混匀一次细胞； 5、30℃温浴最后一次混匀后，置42℃水浴热激22分钟；
方法进行）
6、热激后，将酵母感受态细胞放置冰上3～5分钟；
I Yeast Two-Hybrid System
中文方法：
酵母双杂一对一单转（诱饵和捕获分别转入Y2HGOLD和Y187，再共培养,如 果是双转，则转入Y2HGOLD）
筛选方法： 酵母感受态细胞的制备 （LiAc/PEG制备法） 1、取-80℃25%或者50%甘油保存的Y2HGold菌种,上试剂（除了质粒 DNA之外）预先混匀，然后在每管酵母沉淀上加入 355µl这种预混物（TRAFO），最后加入5µl质粒DNA
Leu/x-α-Gal/AbA营养缺陷培养基上分别涂布100μL阴性 对照与阳性对照的杂交液, 30℃培3-5天。 对照：
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
第一实验：酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）
第一实验：酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、目的掌握酵母双杂交原理和方法。
利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
二、原理酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。
DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。
将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
酵母双杂交系统
酵母双杂交的原理
• 利用酵母作为真核鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
• 双杂交系统的两个重要元件：
• 转录激活因子： DNA结合结构域（DNA binding domain， 简称为DB）和转录激活结构域（activation do筛选相互作用的蛋白
序列分析
酵母双杂交系统 的优点与缺点
再次，双杂交鉴定过程中要经过两次转化，而且，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。
对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母
Bait Protein
Prey Protein
DNA-Binding Domain
DNA-Binding Site
Rep4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构 建诱饵质粒
• 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被 转化的酵母
GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Promoter
Transcription GAL1
Protein X GAL 4 DNA-BD
GAL4 AD protein Y
Protein X
GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Protein Y
Transcription
DNA-Binding Site
酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）
报告基因的表达
将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒
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Amp抗 评 价及 鉴定分装 及冻存诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长构建流程ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
酵母单杂交基本原理
诱饵（Bait）--DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或者随即 拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效 整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株。
猎 物 (Prey)— 猎 物 蛋 白 ， 被 融 合 到 含 有 酵 母 GAL4 转 录 激 活 结 构 域 （GAL4 AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMART PCR扩增的cDNA 和线性化pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱
相互作用验证蛋白质/DNA与相互作用实验诱饵基因克隆的获 得及DNA测序检验
诱饵基因的酵母单、双杂交 载体构建及其DNA测序检验
诱饵基因的酵母的相互作 用验证（酵母回转验证）
阳性克隆DNA序列测定
5 Part
酵母双杂交系统的实现过程
•将诱饵蛋白克隆到pSos载体中，可表达产生hSos和诱 饵蛋白的融合蛋白 •靶蛋白基因与pMyr载体相连接表达产生白与靶蛋白融合表达 •如果靶蛋白和诱饵蛋白相互作用，则hSos蛋白即可固定 于细胞膜上，hSos蛋白激活Ras信号转导途径 •酵母能够在37℃ 生长
酵母单、双杂交技术
目 录
CONTENTS
1
核系统酵母双杂交技术
2
酵母单杂交技术
3
膜系统酵母双杂交技术
4 酵母单、双杂交在医学领域的应用
5 赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
1 Part
酵母双杂交--基于GAL4的双杂交核系统
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，用来研究活细 胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通 过报告基因的表达产物敏感地检测得到。
阳性克隆 的鉴定及 cDNA质 粒的分离
鉴别阳性及假阳 性互作，阳性克
隆测序分析
3 Part
酵母双杂交--Sos蛋白介导的双杂交膜系统
Sos蛋白介导的双杂交膜系统是把蛋白质相互作用的场所从 核内转移到酵母的细胞膜上，通过应用2个蛋白质相互作用后对 Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制，克服了传 统双杂交系统的一些局限性。
酵母双杂交在生物医学领域的应用
病毒学研究
可以筛选和病毒相互作用的 宿主蛋白，验证已知蛋白之间 的相互作用，揭示病毒的生理 过程
蛋白质组研究
筛选不同受体、蛋白激酶、 磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及 参与细胞周期调控和肿瘤发生 的蛋白质等
药物研究
筛选与来源于肿瘤、细菌及病毒的 蛋白间相互作用的多肽类药物，确 定药物互作蛋白在肿瘤、细菌及病 毒中的位置，有目标性地干扰疾病 蛋白的表达
感受 态的 制备
菌液 PCR 鉴定Fra bibliotek诱饵质 粒毒性 及自激 活验证
核定位 检测互作蛋白筛选流程1ML 菌杂交融合二倍体混合
筛
培养
选
回转 验证
4 ML诱饵菌
免疫共沉淀的原理
细胞裂解液
与结合在固相支持物上 的抗体共孵育
在细胞裂解物中，加入结合在固相支持物上的某种特异性抗体共孵育，该抗体就能够与 其抗原形成免疫复合物。被抗体沉淀下来的靶抗原又在裂解液中共沉淀了一种结合伴侣蛋白。 那些不能被沉淀下来的蛋白就会被洗涤走。然后进行SDS-PAGE和Western blot分析。在coIP中，当相关蛋白能够被共沉淀下来时通常假定这些蛋白在细胞水平上与靶蛋白的功能相关。
核系统酵母双杂交常用结构域
真核细胞：GAL4系统 (具有核定位序列)
原核细胞：LexA系统 (不具有核定位序列)
DNA DNA -BD -AD
GAL4、VP16、B42
YTH常用： GAL4系统
核系统酵母双杂交原理
Prey
Prey
DNA-BDDBNaiDAt N-BAD-BBaDitDDNNAA-A-ADD DNA-AD
膜系统酵母双杂交初识
CdC25H 菌株
MATα 型， 其基因的1328位氨基酸残基发生 点突变，编码脒基核苷酸交换因子，该因子结 合并激活Ras，启动RaS信号传导途径 生长温度：25℃可以生长，37℃不可以生长
配套 质粒
pSos：筛选标志为Leu，用于构建诱饵质粒 pMyr：筛选标志为Ura，编码十四烷基化膜定位
GAL UAS
Promoter
Transcription lacZ(or HIS) reporter gene构建流程＋ ds cDNA
＋
Y187
SD/ -Le构建流程
目的片段与
目
载体的连接
大肠
的
杆菌
基 因 合 成
细胞
(–UL) (–UL)
(–UL)
(–UL)
阳性对照
25℃
+
+
37℃
-
+
阴性对照
+
+
-
-
克隆
+
+
-
+
阳性克隆质 粒与诱饵质
粒共转
免疫共沉淀验证其相互作用
从抽提出的pMyr质粒上，将插入片段亚克隆到真核表达载体 pCD3cmyc上，用小提纯化试剂盒纯化质粒，转染HEK293细胞。 用鼠抗cmyc抗体作为一抗进行western blot。
基
目的片段与
因 合
载体的连接
成
诱饵 质粒
转入 酵母菌 Y1HGold
PCR 鉴定
检测诱饵菌 株AbA’基
因的表达目 的确定进行筛选 时抑制诱饵菌株报 告基因本底表达所
Y1HGold ＋ [Bait/AbAi]
cDNA融 合表达文 库的筛选
融合蛋白可以 正确定位于胞浆中）
诱饵蛋白表 达WB验证
互作蛋白筛选流程0.1ML 菌杂交 阳性克 融合 隆挑选
和验证
37℃培养
SD/GLU (–UL) 和SD/GALA (–UL)
回转 验证
筛选 再次 验证
重复验证
1ML诱饵 质粒菌
酵母转化 SD/glu SD/gala SD/glu SD/gala
核系统酵母双杂交报告株
报告株指经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞,其作为报告株的酵母双杂交统具有许多优点： ➢易于转化、便于回收扩增质粒 ➢具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 ➢酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合 改造后的酵母细胞的特点: ✓基因组中GAL4是缺失型的 ✓基因组中引入额外的报告基因Leu、Trp、 His
互作蛋白CO-IP验证
目的基因引物
上
拉
扩增目的 基因
共转染
pGBKT7-Myc-Bait pCDNA3.1-HA-Prey
CO-IP验证
下 拉
模板--回转验证 阳性克隆质粒
2
Part
酵母单杂交技术
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵 母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋 白质间相互作用研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基 因的表型检测，分析DNA与蛋白质之间的相互作用，以研 究真核细胞内的表达调控。
4 Part
酵母单、双杂交在生物医学领域的应用
酵母单杂交在生物医学领域的应用
1、确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。 2、分离编码结合于目的顺式作用元件或其他短DNA结合位点 的新基因。 3、定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合 结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。
MEL1（对 α-gal显阳性）
MATa型，筛选标记为： trp1，leu2 报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，
MEL1
由一些营养选择标记HIS3和(或)编码 酶的基因IacZ基因组成，能显示“诱 饵’和“猎物”相互作用的基因
pGBKT7 ：筛选标志为Trp1，用于 表达 DNA-BD与 Bait)的融合蛋白 pGADT7 ：筛选标志为Leu，用于 表达DNA-AD与Prey 的融合蛋白
既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也 适用于高等植物蛋白质之间相互作用的研究。