酵母单、双杂交PPT

酵母单杂交基本原理
诱饵（Bait）--DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或者随即 拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效 整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株。
猎 物 (Prey)— 猎 物 蛋 白 ， 被 融 合 到 含 有 酵 母 GAL4 转 录 激 活 结 构 域 （GAL4 AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMART PCR扩增的cDNA 和线性化pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建 好酵母中的猎物文库。
基
目的片段与
因 合
载体的连接
成
诱饵 质粒
转入 酵母菌 Y1HGold
PCR 鉴定
检测诱饵菌 株AbA’基
因的表达
目 的
确定进行文库筛选 时抑制诱饵菌株报 告基因本底表达所 需的AbA最低浓度
文库构建及筛选流程
＋ ds cDNA
Y1HGold ＋ [Bait/AbAi]
cDNA融 合表达文 库的筛选
酵母单杂交原理
将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold 酵母基因组中以构建一个诱饵特异的菌株，一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列 相结合，就会激活AbA抗性（ AbA r）基因的表达，从而能够在含有抗生素 AbA的培养基上生长。
pBait-AbAi构建流程
目
的
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
阳性克隆 的鉴定及 cDNA质 粒的分离
鉴别阳性及假阳 性互作，阳性克
隆测序分析
3 Part
酵母双杂交--Sos蛋白介导的双杂交膜系统
Sos蛋白介导的双杂交膜系统是把蛋白质相互作用的场所从 核内转移到酵母的细胞膜上，通过应用2个蛋白质相互作用后对 Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制，克服了传 统双杂交系统的一些局限性。
膜系统酵母双杂交初识
CdC25H 菌株
MATα 型， 其基因的1328位氨基酸残基发生 点突变，编码脒基核苷酸交换因子，该因子结 合并激活Ras，启动RaS信号传导途径 生长温度：25℃可以生长，37℃不可以生长
配套 质粒
pSos：筛选标志为Leu，用于构建诱饵质粒 pMyr：筛选标志为Ura，编码十四烷基化膜定位
4
白/DNA-蛋白之间
相互作用验证
蛋白质/DNA与文库相互作用实验
诱饵基因克隆的获 得及DNA测序检验
诱饵基因的酵母单、双杂交 载体构建及其DNA测序检验
诱饵基因的酵母双杂 交自激活检验
酵母单、双杂交文库筛选
赛尔 生物
酵母细胞内的相互作 用验证（酵母回转验证）
阳性克隆DNA序列测定
5 Part
核系统酵母双杂交报告株
报告株指经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞,其作为报告株的酵母双杂交统具有许多优点： ➢易于转化、便于回收扩增质粒 ➢具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 ➢酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合 改造后的酵母细胞的特点: ✓基因组中GAL4是缺失型的 ✓基因组中引入额外的报告基因Leu、Trp、 His
细胞
(–UL) (–UL)
(–UL)
(–UL)
阳性对照
25℃
+
+
37℃
-
+
阴性对照
+
+
-
-
克隆
+
+
-
+
阳性克隆质 粒与诱饵质
粒共转
免疫共沉淀验证其相互作用
从抽提出的pMyr质粒上，将插入片段亚克隆到真核表达载体 pCD3cmyc上，用小提纯化试剂盒纯化质粒，转染HEK293细胞。 用鼠抗cmyc抗体作为一抗进行western blot。
互作蛋白CO-IP验证
目的基因引物
上
拉
扩增目的 基因
共转染
pGBKT7-Myc-Bait pCDNA3.1-HA-Prey
CO-IP验证
下 拉
模板--回转验证 阳性克隆质粒
2
Part
酵母单杂交技术
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵 母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋 白质间相互作用研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基 因的表型检测，分析DNA与蛋白质之间的相互作用，以研 究真核细胞内的表达调控。
既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也 适用于高等植物蛋白质之间相互作用的研究。
核系统酵母双杂交功能
发现新的与已知蛋白互作的蛋白
确定蛋白相互作用的区域
鉴定两个蛋白之间的相互作用
核系统酵母双杂交初识
Y187 菌株
Y2HGold 菌株
报告 基因
配套 质粒
MATα 型，筛选标记为： trp1，leu2 报告基因为： lacZ（对 ß-gal显阳性）
核系统酵母双杂交常用结构域
真核细胞：GAL4系统 (具有核定位序列)
原核细胞：LexA系统 (不具有核定位序列)
DNA DNA -BD -AD
GAL4、VP16、B42
YTH常用： GAL4系统
核系统酵母双杂交原理
Prey
Prey
DNA-BDDBNaiDAt N-BAD-BBaDitDDNNAA-A-ADD DNA-AD
酵母双杂交系统的实现过程
•将诱饵蛋白克隆到pSos载体中，可表达产生hSos和诱 饵蛋白的融合蛋白 •靶蛋白基因与pMyr载体相连接表达产生的融合蛋白可 以将其固定在细胞膜上 •将文库和诱饵质粒共转化到酵母感受态中 •诱饵蛋白与靶蛋白融合表达 •如果靶蛋白和诱饵蛋白相互作用，则hSos蛋白即可固定 于细胞膜上，hSos蛋白激活Ras信号转导途径 •酵母能够在37℃ 生长
GAL UAS
Promoter
Transcription lacZ(or HIS) reporter gene
文库构建流程
＋ ds cDNA
＋
Y187
SD/ -Leu
筛 选
cDNA
文库 的评 价及
cDNA
文库 扩增
文库分装 及冻存
鉴定
诱饵质粒构建流程
目的片段与
目
载体的连接
大肠
的
杆菌
基 因 合 成
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母单、双杂交技术
目 录
CONTENTS
1
核系统酵母双杂交技术
2
酵母单杂交技术
3
膜系统酵母双杂交技术
4 酵母单、双杂交在医学领域的应用
5 赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
1 Part
酵母双杂交--基于GAL4的双杂交核系统
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，用来研究活细 胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通 过报告基因的表达产物敏感地检测得到。
MEL1（对 α-gal显阳性）
MATa型，筛选标记为： trp1，leu2 报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，
MEL1
由一些营养选择标记HIS3和(或)编码 酶的基因IacZ基因组成，能显示“诱 饵’和“猎物”相互作用的基因
pGBKT7 ：筛选标志为Trp1，用于 表达 DNA-BD与 Bait)的融合蛋白 pGADT7 ：筛选标志为Leu，用于 表达DNA-AD与Prey 的融合蛋白
4 Part
酵母单、双杂交在生物医学领域的应用
酵母单杂交在生物医学领域的应用
1、确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。 2、分离编码结合于目的顺式作用元件或其他短DNA结合位点 的新基因。 3、定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合 结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长
ห้องสมุดไป่ตู้
文库构建流程
ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
酵母单杂交基本原理
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的 BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNA Gla4结合 位点。
该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。 靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gla4的激活结构域可 融合形成融合体， BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互 作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。
酵母双杂交在生物医学领域的应用
病毒学研究
可以筛选和病毒相互作用的 宿主蛋白，验证已知蛋白之间 的相互作用，揭示病毒的生理 过程
蛋白质组研究
筛选不同受体、蛋白激酶、 磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及 参与细胞周期调控和肿瘤发生 的蛋白质等
药物研究
筛选与来源于肿瘤、细菌及病毒的 蛋白间相互作用的多肽类药物，确 定药物互作蛋白在肿瘤、细菌及病 毒中的位置，有目标性地干扰疾病 蛋白的表达
感受 态的 制备
菌液 PCR 鉴定
诱饵质 粒毒性 及自激 活验证
核定位 检测
互作蛋白筛选流程
1ML 文库菌
杂交融合二倍体
混合
筛
培养
选
回转 验证
4 ML诱饵菌
免疫共沉淀的原理
细胞裂解液
与结合在固相支持物上 的抗体共孵育
在细胞裂解物中，加入结合在固相支持物上的某种特异性抗体共孵育，该抗体就能够与 其抗原形成免疫复合物。被抗体沉淀下来的靶抗原又在裂解液中共沉淀了一种结合伴侣蛋白。 那些不能被沉淀下来的蛋白就会被洗涤走。然后进行SDS-PAGE和Western blot分析。在coIP中，当相关蛋白能够被共沉淀下来时通常假定这些蛋白在细胞水平上与靶蛋白的功能相关。
融合蛋白可以 正确定位于胞浆中）
诱饵蛋白表 达WB验证
互作蛋白筛选流程
0.1ML 文库菌
杂交 阳性克 融合 隆挑选
和验证
37℃培养
SD/GLU (–UL) 和SD/GALA (–UL)
回转 验证
筛选 再次 验证
重复验证
1ML诱饵 质粒菌
酵母转化 SD/glu SD/gala SD/glu SD/gala
Amp抗 性阳性克 隆挑选
cDNA
文库的 扩增
cDNA
文库 的评 价及 鉴定
文库分装 及冻存
诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait