光度法酶活力测定计算方法
吸光度计算公式测酶活性
吸光度计算公式测酶活性引言。
酶是生物体内一类特殊的蛋白质，能够催化生物体内的化学反应。
酶活性的测定对于研究生物体内的代谢过程、生物学功能以及药物研发具有重要意义。
目前，常用的酶活性测定方法之一就是利用吸光度计算公式来测定酶活性。
本文将介绍吸光度计算公式测酶活性的原理、步骤以及应用。
一、吸光度计算公式测酶活性的原理。
吸光度法是一种常用的酶活性测定方法，其原理是通过测定反应体系中某一特定底物或产物的吸光度变化来间接测定酶的活性。
当底物被酶催化反应后，产生的产物或中间体会引起溶液吸光度的变化，利用吸光度计测定这种变化，就可以计算出酶的活性。
二、吸光度计算公式测酶活性的步骤。
1. 实验准备。
首先需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶样品、底物、缓冲液、吸光度计等。
同时，需要根据实验要求制定好实验方案，包括反应条件、测定时间等。
2. 反应体系的建立。
将酶样品、底物和缓冲液按照实验方案的要求加入反应管中，建立好反应体系。
在建立反应体系的过程中，需要注意控制好反应的温度、pH值等条件，以确保实验的准确性和可重复性。
3. 吸光度测定。
将建立好的反应体系放入吸光度计中，根据实验方案的要求，在特定波长下测定反应体系的吸光度变化。
通常情况下，会选择底物或产物在特定波长下的吸光度来进行测定。
4. 数据处理和计算。
根据吸光度测定的数据，可以利用吸光度计算公式来计算出酶的活性。
吸光度计算公式通常是根据反应体系中产生的产物或中间体的吸光度变化与其浓度之间的关系来建立的，通过测定反应体系的吸光度变化，就可以计算出酶的活性。
三、吸光度计算公式测酶活性的应用。
吸光度计算公式测酶活性是一种简单、快速、准确的酶活性测定方法，因此在生物学研究、生物医药和生物工程等领域得到了广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以利用吸光度计算公式测定酶的活性来评价药物对酶的抑制作用；在生物工程领域，可以利用吸光度计算公式测定酶的活性来优化发酵工艺和酶的生产过程。
od值酶活力计算公式
od值酶活力计算公式OD值酶活力计算公式酶活力是指酶在单位时间内所催化的底物转化的速率，是评价酶催化效率的重要指标。
而OD值（Optical Density）则是通过测量光密度来间接反映细胞浓度的一种常用方法。
那么，是否可以通过OD值来计算酶活力呢？答案是可以的。
在进行酶活力计算之前，我们需要明确几个概念。
首先是OD值，其实是通过光密度来衡量液体中溶质的浓度，它是光通过被测溶液后所减弱的程度。
OD值与溶质浓度呈正相关关系，即溶液中溶质浓度越高，OD值就越大。
其次是单位时间内酶催化底物转化的速率，这个速率可以通过测量底物的消耗量或产物的生成量来进行评估。
基于以上概念，我们可以推导出OD值酶活力计算公式。
假设OD1和OD2分别表示两个时间点上的OD值，t1和t2表示相应的时间点，底物的初始浓度为C0。
根据定义，酶活力等于底物转化速率，而底物转化速率可以用底物的消耗量或产物的生成量来表示。
在这里，我们以底物消耗量为例进行说明。
我们需要计算底物的消耗量。
底物的消耗量可以通过初始浓度与最终浓度的差值来计算，即ΔC = C0 - C。
其中，C是最终浓度。
我们需要计算时间间隔Δt = t2 - t1。
然后，我们可以根据底物消耗量和时间间隔来计算底物的消耗速率。
底物的消耗速率等于底物的消耗量除以时间间隔，即v = ΔC / Δt。
根据OD值与溶质浓度呈正相关关系，我们可以将底物的消耗速率与OD值进行关联。
假设OD值与底物的浓度呈线性关系，即OD = kC，其中k是比例系数。
那么，底物的消耗速率可以用OD值来表示，即v = kΔC / Δt。
我们可以得到OD值酶活力计算公式：酶活力= kΔC / Δt其中，k是比例系数，ΔC是底物的消耗量，Δt是时间间隔。
需要注意的是，这个公式是基于假设OD值与底物浓度呈线性关系的前提下得出的。
实际应用中，我们需要通过实验来确定比例系数k的值，并验证OD值与底物浓度的线性关系是否成立。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白酶酶活分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
酶活力单位计算公式
酶活力单位计算公式
酶活力单位是用于衡量酶活性的一种标准单位。
在生物化学和生物技术领域中，酶活力单位的计算是非常重要的。
酶活力单位的计算公式可以根据具体的实验方法和酶活性的测量指标来确定。
常见的酶活力测量方法包括酶促反应速率测定、底物转化率测定等。
一种常用的酶活力单位计算公式是根据单位时间内酶催化底物转化的速率来计算。
这个计算公式可以表示为：
酶活力单位 = 底物转化率 / 反应时间
其中，底物转化率指的是酶在单位时间内催化底物转化的数量，通常以摩尔或微摩尔为单位；反应时间是酶催化反应进行的时间，通常以秒或分钟为单位。
此外，酶活力单位的计算也可以根据酶的催化能力来确定。
催化能力是指酶在单位时间内催化底物转化的能力，通常以千单位或万单位为单位。
计算公式可以表示为：
酶活力单位 = 催化能力 / 单位酶浓度
其中，单位酶浓度是指单位体积或单位质量酶的含量。
它可以通过分光光度法、凝胶电泳等方法来测定。
需要注意的是，不同酶的活力单位计算方法可能有所不同，具体的计算公式应根据实验方法和测量指标来确定。
此外，还应注意酶活力单位的单位和量纲问题，在进行计算和比较时要保持统一。
总之，酶活力单位是衡量酶活性的重要指标之一，其计算公式可以根据实验方法和测量指标来确定。
准确的酶活力单位计算有助于评估酶的催化效率和比较不同酶的活性。
光度法酶活力测定计算方法
酶活力定义：酶促反应在单位时间内释放出1μmol产物所需要的酶量，定义为1U (Unit)。
延伸理解：对给定酶促反应，在单位时间内释放出n μmol底物，那么该反应体系中的酶活力即为n U。
注释：U为酶活力单位，并非酶活力指代符号，1U=1μmol/s酶活力的测定：根据定义，测定某种酶对某种底物的酶活，只需要测定反应时间t，以及经过t 时间后，体系内产物的物质的量变化量△n，该体系内的酶活力即为△n/t。
反应时间t：可以直接根据计时器得出产物生成量△n：主要需要解决的测定指标推论：测定酶活力的核心目标为测定单位时间内产物的生成量以下主要讨论用比色法进行产物生成量△n的测定：1、直接比色法：适用范围：产物/底物具有发色基团，可在特定波长的光照下产生吸收，且其摩尔吸光系数可查得发色基团举例：芳环类基团如苯基、硝基苯基、苯酚基、萘基等常用发色基底物：邻(o)/间(m)/对(p)硝基苯基(NP)修饰的酯/苷类物质核心计算公式：Lambert-Beer定律——△A：溶液吸光度变化量，无单位ε：发色物质的摩尔吸光系数，单位L/(mol·cm)b ：光程，即光线穿过溶液的距离，通常为比色杯透光面宽度，单位cm△c ：发色物质在溶液中的浓度变化量，单位mol/L 该公式可将发色物质的浓度与溶液吸光度建立联系，即：因此产物/底物变化量，故：2、间接比色法：适用范围：产物/底物不具有发色基团，需要与另一显色剂发生反应才可被检测，显色后的摩尔吸光系数可查得反应举例：葡萄糖氧化酶-苯酚与葡萄糖反应生成红色的苯醌，用于定糖DNS试剂与还原糖加热反应生成褐色复合物，用于定还原糖核心计算公式：Lambert-Beer定律——计算时需明确显色反应中，显色产物与酶促产物的摩尔比r3、外标比色法：)的产物/底物标准品，自身或显色产物可在特适用范围：有已知浓度(标定波长下产生吸收，且摩尔吸光系数未知核心计算公式：Lambert-Beer 定律——，再测定反应体系吸光度变化量△A，于是，先测定标准品的吸光度A标故：4、标准曲线比色法：适用范围：有产物/底物纯品，自身或显色产物可在特定波长下产生吸收摩尔吸光系数未知核心计算公式：Lambert-Beer 定律——将纯品配置成梯度浓度的一系列溶液，直接测定吸光度或经显色反应后测定吸光度，绘制溶液浓度—吸光度标准曲线(线性相关系数R2>0.99)，之后测定酶促体系吸光度或显色后测吸光度，通关标准曲线方程即可得出产物浓度变化量△c。
α-淀粉酶-酶活力GB24401-2009
n——样品的稀释倍数
样品酶活力X
ห้องสมุดไป่ตู้监督员：检验员：
陕西省酿造发酵产品质量监督检验站
原始记录表
No：______日期：_____年____月____日环境温湿度：_____
记录类别：中温α-淀粉酶——酶活力
产品名称：记录物品编号：
执行方法标准：
主要仪器
名称
编号
规格
精度
鉴定合格有效截止日期
电子天平
酸度计
恒温水浴
分光光度计
所用溶液配制
溶液名称
配制
原碘液
稀碘液
可溶性淀粉溶液（20g/L）
磷酸缓冲液(pH6.0)
盐酸溶液(0.1moL/L)
结果记录
样品称取量m(g)=稀释倍数n=
样品编号
吸光度(A)
对应酶浓度(c) (u/mL)
酶浓度(c)平均值(u/mL)
样品酶活力(u/g)
极差相对值(%)
1
2
活力计算：
X=c×n
式中：X——样品的酶活力，u /g(u/mL)
酶活力计算公式范文
酶活力计算公式范文酶活力（Enzymatic activity）是衡量酶催化效能的指标，它衡量酶催化单位时间内所转化底物的量。
酶活力的计算公式是根据底物的转化速率来确定的，通常采用“摩尔/秒”或“单位/毫升”作为单位。
下面介绍酶活力的计算公式及相关内容。
酶活力通常用单位时间内所转化的底物数量来定义。
酶活力的计算公式为：酶活力=转化的底物数量/单位时间在计算酶活力之前，首先需要确定酶活性的测定方法。
常见的方法有比色法、荧光法、放射性测定法等。
下面以比色法为例，介绍酶活力的计算方法。
比色法是通过酶催化反应的产物与染色剂之间的反应，使溶液颜色发生变化来测量酶活性的一种方法。
一般来讲，底物浓度的变化与产物浓度的变化成正比。
比色法的步骤如下：1.酶活性的测定需要准备酶底物溶液、酶溶液、染色剂、缓冲液。
2.在实验室条件下将上述试剂按照实验要求配制，保持一定浓度和相对数量。
3.将酶底物溶液和酶溶液混合，使底物和酶发生反应。
4.在一定时间间隔内，取少量反应液，在相同条件下添加染色剂。
5.测量反应液中染色剂的吸光度变化。
6.计算酶活力。
常用的比色法有分光光度法和比色计法。
其中分光光度法是最常使用的一种方法。
下面以分光光度法为例，计算酶活力。
假设实验条件下，分光光度法测得循环酶活性的吸光度为A，底物的浓度为C，单位时间为t。
根据比色法的原理，吸光度的变化与底物的浓度成正比。
酶活力=（A-A0）/t×C其中，A是反应结束后的吸光度，A0是反应开始时的吸光度，C是底物的浓度，t是单位时间。
需要注意的是，计算酶活力的公式中还要考虑到反应的温度、缓冲液的pH值等因素。
因为这些因素对酶的催化效果有重要影响，所以必须控制好这些因素。
除了比色法之外，荧光法和放射性测定法也是常用的酶活性测定方法。
对于荧光法和放射性测定法，需要根据具体的方法和实验要求来计算酶活力。
总之，酶活力的计算公式基于底物转化的速率，根据不同的测定方法和实验条件，计算公式也会有所不同。
紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法
葡萄糖 + ATP
己糖激酶 / Mg 2+
葡萄糖-6-磷酸 + ATP
葡萄糖－６－磷酸脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸 + NADP
6-磷酸葡萄糖 + NADPH2
图 2：葡萄糖或 ATP 的间接酶检测 两种物质可以通过己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶催化的偶联反 应得以确定（偶联测试系统 [1]）。通过生成的 NADPH2 的量来计算 两种物质的量。
糖酵解 几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细 胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵 解。葡萄糖通过分步反应转化为 2 分子的丙酮酸。1 分子的 葡萄糖生成 2 分子的 ATP 和 2 分子以 NADPH2 形式存在的 氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸 循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终 的降解产物是 H2O 和 CO2。
3C
迟”（Delay））加入己糖激酶开始的，总共检测时间为 6 分钟。
实验参数是根据初步实验使用 “单波长λ- 连续”（Singleλ-
continuous）（见上）设定的。以下公式分别用于计算酶活
性和底物浓度：
图 3：活性测定选项 A) 单波长λ- 连续 B) 简单动力学 C) 高级动力学 （Singleλ- continuous） （Simple kinteics） （Advanced kinetics）
Tris 缓冲液 pH 7.0 MgCl2 葡萄糖 NADP+ ATP 己糖激酶 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶
以上溶液均使用分子生物学用水进行制备，并在 Eppendorf IsoPack 冰盒中以 4 °C 保存。Tris 缓冲液在室温下保存。酶 在使用后立即放回冰箱。
酶比活力测定实验报告
摘要：本实验旨在通过测定酶的比活力，了解酶的催化效率和活性水平。
通过一系列实验操作，包括酶液的制备、反应体系的建立、酶活力的测定等，最终计算出酶的比活力。
实验结果表明，所测酶具有较高的比活力，符合预期目标。
关键词：酶比活力；酶活力测定；催化效率一、实验目的：1. 学习酶比活力的测定方法。
2. 了解影响酶活力的因素。
3. 计算并分析酶的比活力。
二、实验原理：酶比活力是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力。
其计算公式为：\[ \text{酶比活力} = \frac{\text{酶活力}}{\text{酶蛋白含量}} \]其中，酶活力通常以每分钟转化一定量的底物所释放的产物量表示，酶蛋白含量以毫克为单位。
三、实验材料：1. 酶制剂：蛋白酶、淀粉酶等。
2. 底物：蛋白质、淀粉等。
3. 试剂：盐酸、氢氧化钠、硫酸铜等。
4. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验方法：1. 酶液的制备：根据说明书，将酶制剂按照一定比例溶解于缓冲液中，制备成一定浓度的酶液。
2. 反应体系的建立：将底物、酶液和缓冲液按一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在适宜的温度下进行反应。
3. 酶活力的测定：在反应过程中，定期取样，用分光光度计测定反应体系中底物的浓度变化，根据反应速率计算酶活力。
4. 酶蛋白含量的测定：采用双缩脲法测定酶蛋白含量。
五、实验步骤：1. 准备酶液、底物和试剂。
2. 按照实验方法，制备酶液和反应体系。
3. 在恒温水浴锅中进行反应，并定期取样。
4. 用分光光度计测定底物浓度变化，计算酶活力。
5. 测定酶蛋白含量。
6. 计算酶比活力。
六、实验结果与分析：1. 实验结果：- 酶活力：0.5 U/mg- 酶蛋白含量：1.0 mg/mL- 酶比活力：0.5 U/mg2. 分析：- 通过实验，我们成功测定了酶的比活力，结果与预期相符。
- 酶比活力较高，表明该酶具有较好的催化效率。
- 影响酶活力的因素有温度、pH值、底物浓度等，本实验中温度和pH值均控制在适宜范围内，对酶活力的影响较小。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活[详解]
![紫外分光光度法测蛋白酶酶活[详解]](https://img.taocdn.com/s3/m/f0f89073f4335a8102d276a20029bd64783e62bd.png)
紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
2.5 10g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。
酶活力的单位
酶活力的单位酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率，使得生命体系能够进行各种代谢和合成过程。
酶活力是指酶在一定条件下催化反应的速率，也是酶性质的重要指标之一。
酶活力的单位是酶单元（enzyme unit，U），本文将从酶活力的含义、测定方法以及实际应用等方面进行探讨。
酶活力的含义酶活力是指酶在一定条件下催化反应的速率，通常用单位时间内转化的底物量来表示。
酶活力的单位是酶单元（U），一酶单元定义为在一定时间内催化底物反应的酶量，使得反应速率增加1微摩尔/分钟。
酶活力的测定通常包括底物转化率法、光度法、电位法等多种方法，其中最常用的是底物转化率法。
底物转化率法底物转化率法是测定酶活力最常用的方法，其基本原理是测定单位时间内底物的消耗量或产生量，从而计算出酶对底物的催化速率。
通常，底物转化率法的操作步骤包括：制备酶样品、制备反应体系、加入底物、控制反应条件、测定反应终点等。
制备酶样品是测定酶活力的前提，通常需要从生物体中提取酶或者通过基因工程等手段制备纯化的酶。
制备反应体系需要选择合适的底物、缓冲液、辅助酶等，以保证反应条件的稳定性和准确性。
加入底物后，需要控制反应条件，如温度、pH、离子强度等，以保证反应的可重复性和准确性。
测定反应终点后，需要通过分析底物消耗量或产物产生量等数据，计算出反应速率和酶活力。
光度法光度法是通过测定反应过程中液体的吸光度变化来测定酶活力的方法。
光度法的原理是酶催化反应会产生某种物质的吸光度变化，通过测定吸光度变化的大小和时间，可以计算出反应速率和酶活力。
光度法的优点是操作简便，反应时间短，但需要选择合适的底物和检测波长，以避免干扰和误差的产生。
电位法电位法是通过测定反应体系中电位的变化来测定酶活力的方法。
电位法的原理是酶催化反应会产生电位变化，通过测定电位变化的大小和时间，可以计算出反应速率和酶活力。
电位法的优点是反应灵敏度高，可以测定微量的酶活力，但需要选择合适的电极和反应体系，以避免电极干扰和误差的产生。
溶菌酶活力测定分光光度法流程
溶菌酶活力测定分光光度法流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行溶菌酶活力测定分光光度法之前，需要进行充分的准备。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。
2测定原理蛋白酶在一定得温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基得氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Ｆolin)还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品得酶活力。
酶活单位得定义:每１mL粗酶液,在一定温度与ｐH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u／ｍL)表示。
3仪器与设备3.1分析天平:精度为0。
0０01g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅:精度±0。
2℃。
3.4PＨ计:精度为0.0１PＨ单位。
4试剂与溶液除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。
4.1福林(Foｌin)试剂市售分析纯福林试剂、4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合,摇匀。
4.3碳酸钠溶液(42、4ｇ／L)称取无水碳酸钠(Na2CＯ3)4２.4ｇ,用水溶解并定容至1０0０ml。
4.4三氯乙酸c(ＣCl3COOH)=0、4mｏｌ/Ｌ称取三氯乙酸６５、4g,用水溶解并定容至１000 mL、4.5氢氧化钠溶液ｃ(NaOH)＝0.5ｍol／L称取氢氧化钠片剂２0。
0g,加水90０ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。
4.6盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0。
１mol/L1 ｍol/L HＣL:取９０mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mＬ。
０、1 ｍol/Ｌ HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至100０ｍＬ、4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pH＝７。
5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Na２ＨPO4•12Ｈ2Ｏ)6、02ｇ与磷酸二氢钠(NaＨ2ＰO4•1２Ｈ2O)0、5ｇ,加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液(ｐH=3。
0,适用于酸性蛋白酶)甲液:称取乳酸(80％～９0％)10、6g,加水溶解并定容至1000 ｍL。
漆酶活性测定方法
漆酶活性测定方法本页仅作为文档页封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March一、测 O法2漆酶是一种多酚氧化酶，它所催化的反应过程中有O z 的介入。
测量反应的耗氧量既可间接地推知漆酶的活性。
较早建立的瓦氏呼吸器检测法便是基于这一原理。
这一方法后来改进为利用氧电极来测量耗氧量，如弗罗纳等以愈创木酚为底物，利用氧电极测定了漆酶催化反应过程中的耗氧量，并将 1个漆酶活性单位定义为PH6 ． o 及2 5 ℃条件下以愈刨木酚作为电子供体时所需要的酶量。
亦可取醌醇作底物．利用氧电极测定漆酶消耗1. 0 μmo lO2的活性。
郭明高提出了测定生漆漆酶活性的吸氧法。
即将生漆溶于甲苯，测定酶促吸氧速度和累计酶促吸氧量，同时利用碱促吸氧法测定反应前后漆酚浓度的变化，从而可以求得漆酚浓度衰减的规律及漆酶促吸氧的克分子比。
此法的特点是反应时漆酶处于其天然存l 在的状态而反应底物又恰为漆酶的天然底物漆酚，这在漆酶测活研究中尚属首倒 [ 2 1 。
漆树酶活力检测用0..1m ol·L-1磷酸盐缓冲液与有机溶剂配成一定体积的底物，其浓度为1．35×10 m ol·L-1。
分别移取3mL于1cm测量池和参比池中，恒温水浴中预热10min．注入20μL漆树酶溶液(含酶2～3 μg)于测量池中，立即搅匀，测定350nm处吸光度A随时间的变化值．漆酶比活力定义为一定温度下,单位酶量催(mg·min-1)．将漆树酶在不同溶剂体系中的化反应的初速度，单位记为△A350mm比活力与漆树酶在纯水体系中的比活力相比，其比值称活力比()212 漆酶活性的定量测定方法21211 分光光度计法测定漆酶活性对苯二胺(λmax495) 、愈创木酚(λmax 485) 、邻苯二酚(λmax 400)和漆酚(λmax 420)都可用做漆酶活力测定的底物。
木瓜蛋白酶酶活力测定
木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。
4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。
在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。
4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活力测定方法
NH
NH-CO-
H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12 次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0. 4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品 37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进 样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起, 所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系 统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分 析。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
葡萄糖氧化酶活力测定(分光度法)
氧化酶 葡萄糖氧化酶活力测定（分光度法）1.原理（1） ）葡萄糖氧化酶的催化特性：葡萄糖氧化酶的每个酶分子中含有两单位 FAD （黄素腺嘌呤二核苷酸） ，作为受氢体催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸， 并产生过氧化氢。
C 6H 12O 6+O 2= C 6H 12 O 7+H 2O 2在一定时间内葡萄糖经氧化酶催化发生反应后， 测定其反应液的过氧化氢浓度即可算出葡萄糖氧化酶的活力。
（2） ）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢在一定 pH 值的缓冲溶液中 和加热条件下能使靛蓝胭脂红发生褪色反应， 并且其反应速度在一定范围内和过氧化氢浓度成正比， 据此测定出产生的过氧化氢的量， 进而计算出葡萄糖氧化酶活力。
（3） ）首先利用一系列浓度的过氧化氢标准溶液与靛蓝胭脂红反应，在 615nm 波长处测定吸光度，建立标准曲线。
然后，作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应，再取 其反应液与一定浓度的靛蓝胭脂红溶液反应随后测定其在 615nm 波长处测定吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程后可推算出氧化酶活力。
2 药品（1） ） 0.2mol/L 葡萄糖溶液 :称取 3.96g 一水葡萄糖定容于 100.00mL 冷藏3小时备用， 2 天内有效。
（ 2）1．0×10-3mol/L 靛蓝胭脂红溶液： 称取 0.466g 靛蓝胭脂红定容于 1000mL 。
（2） ） 0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲溶液 (pH=5.2) ：称取 16.16g 三水醋酸钠及2.48g冰醋酸定容至 1000mL（ 4）12mg/L 过氧化氢标准溶液： 准确称取 0.040g 30%的过氧化氢溶液 （过氧化 氢需事先标定取实际值）定容于 1000mL 。
3 实验方法（1） ）标准曲线的绘制准确吸取 0、1、2、3、4、5、6mL 过氧化氢标准溶液 (12mg/L) ，分别置于25mL 比色管中，加人 1.3mL 靛蓝胭脂红溶液(1．0×10-3mol/L) 和3．0mL 乙酸一乙酸钠缓冲液，再加人蒸馏水稀释至25mL 配成含有过氧化氢0.00mg/L、0.48 mg/L、0.96 mg/L 、1.44 mg/L 、1.92 mg/L 、2.40 mg/L 、2.88 mg/L 的溶液，于沸水浴中加热13min 后，用流水冷却比色管5min。
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酶活力定义：
酶促反应在单位时间内释放出1μmol产物所需要的酶量，定义为1U (Unit)。
延伸理解：
对给定酶促反应，在单位时间内释放出n μmol底物，那么该反应体系中的酶活力即为n U。
注释：U为酶活力单位，并非酶活力指代符号，1U=1μmol/s
酶活力的测定：
根据定义，测定某种酶对某种底物的酶活，只需要测定反应时间t，以及经过t 时间后，体系内产物的物质的量变化量△n，该体系内的酶活力即为△n/t。
反应时间t：可以直接根据计时器得出
产物生成量△n：主要需要解决的测定指标
推论：
测定酶活力的核心目标为测定单位时间内产物的生成量
以下主要讨论用比色法进行产物生成量△n的测定：
1、直接比色法：
适用范围：产物/底物具有发色基团，可在特定波长的光照下产生吸收，且其摩尔吸光系数可查得
发色基团举例：芳环类基团如苯基、硝基苯基、苯酚基、萘基等
常用发色基底物：邻(o)/间(m)/对(p)硝基苯基(NP)修饰的酯/苷类物质
核心计算公式：Lambert-Beer定律——
△A：溶液吸光度变化量，无单位
ε：发色物质的摩尔吸光系数，单位L/(mol·cm)
b ：光程，即光线穿过溶液的距离，通常为比色杯透光面
宽度，单位cm
△c ：发色物质在溶液中的浓度变化量，单位mol/L 该公式可将发色物质的浓度与溶液吸光度建立联系，即：
因此产物/底物变化量，
故：
2、间接比色法：
适用范围：产物/底物不具有发色基团，需要与另一显色剂发生反应才可被检测，显色后的摩尔吸光系数可查得
反应举例：葡萄糖氧化酶-苯酚与葡萄糖反应生成红色的苯醌，用于定糖DNS试剂与还原糖加热反应生成褐色复合物，用于定还原糖
核心计算公式：Lambert-Beer定律——
计算时需明确显色反应中，显色产物与酶促产物的摩尔比r
3、外标比色法：
)的产物/底物标准品，自身或显色产物可在特适用范围：有已知浓度(
标
定波长下产生吸收，且摩尔吸光系数未知
核心计算公式：Lambert-Beer 定律——
，再测定反应体系吸光度变化量△A，于是，先测定标准品的吸光度A
标
故：
4、标准曲线比色法：
适用范围：有产物/底物纯品，自身或显色产物可在特定波长下产生吸收
摩尔吸光系数未知
核心计算公式：Lambert-Beer 定律——
将纯品配置成梯度浓度的一系列溶液，直接测定吸光度或经显色反应后
测定吸光度，绘制溶液浓度—吸光度标准曲线(线性相关系数R2>0.99)，之后测定酶促体系吸光度或显色后测吸光度，通关标准曲线方程即可得
出产物浓度变化量△c。
5、内标色谱法：
适用范围：产物/底物无明显特征吸收，但可用液相/气相色谱分离，且有色谱级标准品
测定时将确定量的标准品加入样品中进行液相检测分离，物质的浓度与其色谱峰面积成正比，通过计算产物峰面积与内标峰面积比，即可求得产物量
酶活力测定注意事项：
使用恒温体系作为酶促反应的发生体系，例如使用恒温光度计测定酶促反应吸光度变化；
体系组成：缓冲体系+酶+底物（顺序固定，先加入酶令其充分适应环境温度，再加入底物反应）
比活力计算公式：
其中，△c为产物浓度变化量，单位μmol/mL；
t为反应时间，单位min
V反为酶促反应测活体系的体积，单位mL
V E为加入反应体系的酶溶液的体积，单位mL
c E为反应体系中实际的酶浓度，单位mg/mL
D 为稀释倍数，酶促反应体系未经稀释直接测定时，D=1
光度法比活力计算公式：
各项解释：
活度：，为直接从动力学表征软件上读出的数据，表示吸光度的平均变化率
反应速率：，亦可变形为，即产物浓度的平均变化率
酶活力：，单位为U，即反应体系中所加入酶的实际活力
体积比活力：，单位为U/mL，表示所加入的酶溶液单位体积含有的活力
质量比活力：即上式，表示每毫克酶蛋白所含有的活力。
光度法酶促反应动力学测定：
核心方法——双倒数作图法
涉及参数：反应速率v，底物浓度[S]
反应速率v即上述形式，单位μmol/(mL·min)；底物浓度[S]单位为mmol/L
取对作散点图，当趋势线方程y=ax+b中，b>0，a<0时有意义
其中，即常规米氏方程：
V max为最大反应速率，表示酶被底物饱和时的催化反应速率；
K m为米氏常数，表示酶与底物的亲和程度
其中，V max=k cat·[E]，k cat为催化系数，又称转化数，表示单位时间内1分子酶可以催化反应的底物分子数；[E]为反应体系中的实际酶浓度，单位mol/L。
有，Mr(E)为酶分子的相对分子质量，单位g/mol。
酶的常规性质表征：
主要表征参数：最适反应温度、最适反应pH、底物偏好（底物谱）、金属离子依赖性、热稳定性、pH稳定性、有机溶剂耐受性
常用方法：正交试验法
金属离子依赖性判别方法：加入EDTA后若酶完全失活，则为离子依赖；活性受到影响，但未完全失活，则为非离子依赖性。
稳定性表征参数：半衰期t1/2。
不考虑热激活效应，酶的热失活基本符合一级反应动力学
测定初始时酶促反应体系的吸光度A0，以及经过不同孵育时间处理后的酶在相同反应体系与条件下的产物吸光度A t，以ln(A t/A0)对孵育时间t做图，趋势线斜率为-k，当线性相关系数R2≥0.99时，则t1/2=ln2/k。
热激活发生时，热失活应从热激活效应达到峰值时开始计算，加上激活至峰值所需的时间即为实际半衰期
复杂反应的酶促动力学：
1、双底物反应机制的判断：
对酶促反应涉及双底物A、B时，可以通过固定其中一个的浓度为几个不同的值，分别在每个值下测定并绘制酶对另一个底物的动力学双倒数图像。
当A的浓度分别取[A]、2[A]、3[A]时，酶对底物B的动力学双倒数图像为一组平行直线时，则该酶促反应为乒乓机制；
当A的浓度分别取[A]、2[A]、3[A]时，酶对底物B的动力学双倒数图像为一组相交于一点的直线时，则该酶促反应为序列机制。
2、抑制剂与可逆抑制动力学：
1)竞争性抑制的双倒数方程：
特点：抑制剂浓度[I]增大时，图像均相交于纵轴，即V max不变，K m增大
2）非竞争性抑制的双倒数方程：
特点：[I]增大时，图像均相交于横轴，即V max变小，K m不变
3）反竞争性抑制的双倒数方程：
特点：[I]增大时，图像为一组平行直线，即V max与K m均变小
抑制常数K i：在不同的[S]下用对[I]作图，图像交点的横坐标绝对值即K i。