分子荧光常见的问题和讨论

碳糊电极和化学修饰碳糊电极的制备及性能综述
《生物化学与生物物理进展》1979年02期李治湘
维普
/
帐号：nm531
密码：131420
YG-2型荧光分光光度计的试制生物化学与生物物理进展1980年第05期林波海仪器工作稳定性差，漂移大时，应该考虑更换光源或光电元件
常见的问题有几个部分：
1.测试过程中荧光峰常受到拉曼峰和锐利散射的干扰。

2.狭缝和扫描速度的选择对应光谱峰的影响非常大。

3.滤光片的不当使用。

4、如何有效消除杂散光对实验的影响？
5、在光谱分辨能力、狭缝宽度及光通量的选择上如何有效地做到优化地匹配和选择？
6、如何选择不同的滤光片，从而实现在测试过程当中有效地扣除多级衍射信号的影响，诸如2级衍射，三级衍射等等？
激发光不同，荧光峰的位置是不会改变的。

如果随着波长的改变，峰位置发生改变，那就不是荧光峰，很可能是拉曼峰或其他峰。

测定固体荧光时，会出现很大的平头峰，然后在峰附近出现一个小峰。

这是为什么？平头峰好像并不是固体的特征峰。

1.平头峰：一般是信号饱和；小峰：据称这和偏振有关。

2.那个平头峰可能是瑞利散射峰，那个小峰到有可能是样品的荧光峰。

3.狭缝太大，或者倍频峰出现了。

粉末材料的散射问题：
测量激发谱时候，如果涉及到400-500nm范围，灯的谱线会通过散射加入，特别是结晶好的样品。

这时候需要滤光片辅助。

一般可将仪器的激发波长(Ex)先设定为200nm，然后进行发射波长(Em)模式扫描，(Em)波长范围暂设定为210－800nm，然后记录所有出现的峰值波长；改变激发波长(Ex)后再扫描，如第二次发射图谱中的某个（或某些）峰的位置没有位移（或位移很少），一般来说这个（或这些）峰就是荧光峰；因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的，仅是峰高（或峰面积）发生改变。

将确定的荧光峰的波长作为发射波长(Em)固定下来，再做激发波长(Ex)的扫描，激发波长的范围要小于发射波长（根据斯拖克斯定律）；如果仅出一个峰则很简单确立下来，再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(Em)扫描，可以得到良好的信
因为氙灯在250nm及以下能力很弱，这样会导致很强的散射光虚假信号，所以不推荐选用250nm以下波长来尝试激发；
氙灯在250nm的能量远远低于325nm，所以看到谱线的锯齿状波动线。

对于未知样品，楼上的方法是没有问题，只是建议首次选取的激发波长做些修改。

比如
350nm--300nm--260nm--400nm--450nm激发找到发射谱后来反推。

这些只是个人的经验，供参考。

最省事的方法，将滤光片设置为“自动”。

做固体时，一定要正确设置滤光片。

对于激发侧而言，狭缝加大有时荧光强度反而减少。

对于荧光侧而言，狭缝加大可以使荧光强度提高同时重现性得到提高，但是分辨率随之降低。

1nm的狭缝是不经常使用的，因为荧光不是紫外可见分光光度计，荧光的信号很弱；如果使用过小的狭缝势必造成加大负高压的结果，那样，测试结果的噪声就会无形中被放大，这是我们所不希望的。

一般而言，5nm的狭缝是较为合适的；除非使用者有特殊的要求。

常用1nm或5nm. 多采用3 nm的。

在狭缝已经设定合适的前提下，负高压的选择主要是依据荧光值的强度而定。

一般而言，如果荧光值可以适中地读出（例如强度在20左右即可），则高压设定的越小越好。

这样可以避免将光电倍增管的暗电流或噪声也被同时放大的弊病。

一般狭缝设置在1nm，如果光强度较弱或较强的话，则会增大或减小狭缝大小。

5nm的话，未校正的发射光谱的强度会超过2000000，那么相应的经过校正的发射光谱则会被认为可信度不高。

可以试着调整一下激发光的狭缝，较大的狭缝可以使波动度减少，但灵敏度变差
狭缝越窄,分辨率越高,但灵敏度会随之下降,信噪比降低.
狭缝越宽,分辨率越低,但灵敏度会随之上升,信噪比提高,
同时狭缝进入杂散光的机率也会增大.
在荧光分光光度计中：光电倍增管的工作电压与仪器的狭缝确实是成反比关系。

但是有个前提，就是“当荧光值保持不变时”。

这个关系从实验中很容易判断出来；无论改变那一侧的狭缝，当负高压不变时，荧光值均会下降，要想回到原值，则必须提高复高压。

反之则反。

其实，狭缝与光电倍增管负高压的反比关系，不仅仅存在荧光仪上，在紫外可见分光广度计，原子吸收或红外光谱仪上也是一样的，只不过届时的负高压是自动调整的，使用者不会太关注罢了。

当用水的拉曼光谱做仪器灵敏度检查时，其指标远远低于仪器说明书的要求时，并且已经排除了仪器的其他原因时，则要更换氙灯了。

325激发？650的应该是倍频峰，除了450后的几个小峰没有明显的荧光峰了
样品本身发光很弱，激发侧开的太大了，加滤光片
试着改变下狭缝，峰强度太大了
改变扫描范围就行了那个可能就是个倍频峰
荧光光度计上常用的光栅对于一级光和二级光是没有办法分辨的。

比如1200nm的一级光和600nm的二级光及400nm的三级光是完全重合的。

假设以250为激发时，由于样品的强散射性，一部分散射到发射光一侧的分光系统中，在正好发射扫描到500时，由于二级光也就是250nm的散射光较强，会出现较强的荧光峰，俗称倍频峰。

很显然，倍频峰就是激发光的散射峰，虽然波长扫描到双倍波长的时候出现，但实际波长却是激发波长。

可以通过增加高通滤光片来去除。

不光是拉曼，连正常的荧光都会有倍频峰的，这是由发射侧的光栅造成的，但不是由光栅产生的，中阶梯光栅的光路系统好像可以把多级光处理的比较好，不会有重叠的情况。

倍频是一个非常浅显的说法。

散射光谱是荧光光谱分析的共存物，大概分为四种形式：瑞利散射、拉曼光谱、胶粒散射核容器表面散射。

散射光谱随着激发波长的改变而改变，但荧光光谱却不会。

荧光光谱中Em=0 nm，即0级光，所有波长的光。

或者是光栅当镜子用，做反射。

用来扫描激发波长。

瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，光子的运动方向发生改变，其波长与入射光相同。

拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生的同时，光子与物质分子发射功能能量交换，使光子能量发生改变，其波长可能长于入射光，也可能短于入射光
各位请帮帮忙，本人采用LS55作荧光测试时，激发峰在256nm处，发射峰应该在614处，可是每次作峰都在600左右移动。

参数设置是
Instrument Parameters
Measurement type: Wavelength scan
Scan mode: Emistion
Data mode: Fluorescence
EX WL: 256.0 nm
EM Start WL: 300.0 nm
EM End WL: 700.0 nm
Scan speed: 500 nm/min
EX Slit: 2.5 nm
EM Slit: 2.5 nm
PMT Voltage: 800 V
EMCorr: Off
并且还加了1%T的滤光片
在测试过程中发射峰的位置随激发峰位置的不同(256,280,300nm)等总是在500nm,600nm左右变化，是不是说出现的峰不是我的发射峰，那怎样设置条件才能测出发射峰呢。

请大家帮帮忙
原则上来说对于大多数的样品，荧光发射峰与激发光的波长无关因为荧光是分子本身的属性。

建议你选择更长一些的激发光波长，其他的峰目前来看有可能是有多个发射峰多导致。

可是激发峰我都试过300nm，350nm，每次得到的发射峰都不在同一个位置，就像图中从第二个峰开始都是每次变化激发峰得到的不同位置的发射峰
建议其他型号光谱仪测量后对比，找出原因。

已经在别的仪器上作过啦，在别的仪器上就能测出4条发射峰，条件也都试过啦，还是不行，并且我已经把仪器上测试可更改的条件都更改过啦，还是不出峰，问过工程师也不太懂，因为没有具体的应用工程师，所以都不知道为什么？
荧光分析技术
一.荧光分光光度计的主要部件
由激发光源、激发单色器(置于样品池前)和发射单色器（置于样品池后)、样品池及检测系统组成。

其结构如图所示。

二仪器的校正
(1)灵敏度校正：
荧光分光光度计的灵敏度可用被检测出的最低信号来表示，或用某一对照品的稀溶液在一定激发波长光的照射下，能发射出最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。

由于影响荧光分光光度计灵敏度的因素很多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器在不同时间操作，所得的结果也不尽相同。

因而在每次测定时，在选定波长及狭缝宽度的条件下，先用一种稳定的荧光物质，配成浓度一致的对照品溶液对仪器进行校正，即每次将其荧光强度调节到相同数值(50％或10 0％)。

如果被测物质所产生的荧光很稳定，自身就可作为对照品溶液。

紫外-可见光范围内最常用的是1 μg/ml的硫酸奎宁对照品溶液(0.05 mol/L)硫酸中。

(2)波长校正：
若仪器的光学系统或检测器有所变动，或在较长时间使用之后，或在重要部件更换之后，应该用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度重新校正，这一点在要求较高的测定工作中尤为重要。

(3)激发光谱和荧光光谱的校正：
用荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱往往存在较明显的误差，其原因较多，最主要的原因有：光源的强度随波长的改变而改变、每个检测器(如光电倍增管)对不同波长光的接受程度不同及检测器的感应与波长不呈线性。

尤其是当波长处在检测器灵敏度曲线的陡坡时，误差最为显著。

因此，在用单光束荧光分光光度计时，先用仪器上附有的校正装置将每一波长的光源强度调整到一致，然后以表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的感应强度进行校正，以消除误差。

目前生产的荧光分光光度计大多采用双光束光路，故可用参比光束抵消光
学误差。

三、荧光分析新技术简介
1．激光荧光分析 : 激光荧光法与一般荧光法的主要区别在于使用了单色性极好，强度更大的激光作为光源，因而大大提高了荧光分析法的灵敏度和选择性，特别是可调谐激光器用于分子荧光具有很突出的优点。

2．时间分辨荧光分析是利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，以实现分别检测的目的。

时间分辨荧光分析采用脉冲激光作为光源。

如果选择合适的延缓时间，可测定被测组分的荧光而不受其他组分、杂质的荧光及噪声的干扰。

目前已将时间分辨荧光法应用于免疫分析，发展成为时间分辨荧光免疫分析法。

3．同步荧光分析在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值出△λ(通常选用与之差)，同时扫描发射波长和激发波长，得到步荧光光谱。

若以值相当于或大于斯托克斯位移，就能获得尖而窄的同步荧光峰。

因荧光物质浓度与同步荧光峰峰高呈线性关系，故可用于定量分析，此法的灵敏度较高。

1.
一般激发波长要比发射波长小5－10nm为宜。

有人扫荧光发射时刚好相反，激发选250 nm，却从220nm开始扫起，导致仪器总是出错，显示什么overflow。

荧光物质的吸收峰和荧光发射峰之间是有些差别的，这个差别叫 stoke shift。

与激发光波长相同的荧光叫共振荧光。

瑞利散射和拉曼散射都不是荧光。

建议楼主再仔细阅读陈国珍的荧光分析法（第二版）。

2.在做荧光光谱时，在激发波长和激发波长整数倍的地方都会有瑞利散射，在激发波长几个纳米后还会有一个较弱的拉曼散射峰。

判断的方法是改变激发光波长，两个散射峰会随着激发光波长的改变而改变，你真正的荧光峰只会发生强度的改变，峰位置不会有改变.
3.并不是激发波长要比发射波长小多少。

当然激发波长肯定是比发射波长小的。

通过荧光物质已知的发射峰，扫描它的激发光谱，可以得到最大激发波长。

然后以它的最大激发波长，扫描它的荧光发射光谱，这样荧光才最强。

Stokes shift 是激发峰与发射峰之间的距离，即最大激发波长与最大发射波长之间的波长差。

Stokes shift 越大，瑞利效应越小。

荧光物质的激发峰一般情况下在吸收峰附近。

4.荧光发射的扫描范围，强调的是发射要从比激发波长大5－10nm的波段扫起。

需要补充的是扫描范围最大也就是激发波长的二倍足以。

5.荧光激发波长的选择，原则上说应该以紫外吸收峰为准。

即在测荧光之前，须先做一些准备工作。

在实际的选择上，在避开各种背景噪音的情况下，宜选取波长较长能量较低的光进行荧光激发。

这一点必须着重强调！换句话说，最大激发波长一般是不用的，大多也在205－220nm之间，因为：这个波长的光能量太高，对反射镜（光源后面的那个镜子）和激发光栅、发射光栅以及后面的光电倍增管都是严重的摧残和虐待！
此外还需要强调的是，在测荧光的时候，光源要不停开关的，所以在测的间隙建议随手关灯，以尽可能延长光源的寿命（一般是200－500h）。

6.荧光强不一定是好事，我经常为荧光太强，超出测量的极限而头痛，往往意味着必须改光栅狭缝的大小，或者调节入射光的通量。

如果是荧光物质本身的荧光效率很低，那根本就不用测荧光，因为影响荧光发射强度的因素太多了，什么都对它造成干扰。

另外soaring 0331知不知道荧光是没有单位的？它的强度只有相对的意义。

岛津SPD-10Avp型紫外检测器波长不准故障的检修
1 波长不准故障的检修
在正常使用下，如果显示波长不准，根据波长自检和自校原理，故障是由光电管没有检测到亮线引起的。

当显示波长不准时，应首先检查出流动相使用得是否合适，波长设定是否超出仪器的使用范围。

当排除了这些人为因素后，利用仪器的自校功能进行一次波长校正（校正方法见使用说明书）。

校正后如仍显示波长不准，则按面板上的Func键，把波长设定为254nm，并且使检测池充满甲醇或乙晴，查看SMPL EN（流通池）和REF EN（参比池）的吸光度值。

如果流通池和参比池的值相差很大，则故障是由光栅部分污染或氘灯能量降低引起的，按面板上的VP和Func键，查看氘灯的使用时间是否超过2000小时。

如果氘灯使用时间过长，即使氘灯能够正常启动，有时也发不出0nm,486nm和656nm亮线，从而引起波长不准。

这时，需要更换新的氘灯。

如果氘灯使用时间不长，则故障是由光栅部分引起的。

2 光栅部分的检修与调试
光栅部分主要是由M1、M2、M3、石英窗口和光栅组成的，是整个光路的核心。

反射镜镜面的光洁度越高，光电池接受到的光就越强，仪器的灵敏度就越高。

如果紫外光长时间故地功能照射镜面的一个地方，会在镜面上产生光斑。

如果使用环境不干燥，会在镜面上生成霉斑。

如果使用环境不洁净，灰尘也会对镜面造成污染。

这些都将使镜面的光洁度下降，严重时会使光电池无法检测出氘灯的亮线，从而引起波长不准。

如果故障是由石英透镜污染或光斑造成的，应该先把瞎缝从底板上卸下来，用脱脂棉或纱布沾无水乙醇反复擦洗透镜，直至擦洗干净为止，然后重新装上狭缝。

如果故障是由反射镜M1、M2、M3镜面的光斑，霉斑或污染造成的，用甲醇稀释的棉胶液（化学试剂商店有卖），在有光斑、霉斑或污染的镜面上均匀地涂抹一层，待甲醇蒸发后，会在镜面膜上形成一层薄膜，这时用镊子从镜子边缘把这层薄膜慢慢取下来。

用镊子取薄膜时，一定要小心，不能划伤镜面。

而光栅是一个相当于1600条/mm沟槽的全息光栅，当光栅上有光斑、霉斑或污染时，不能使用棉胶液涂抹或擦拭，只能连同处理后不能恢复光洁度的反射镜M1、M2、
M3一起更换。

在更换光栅部分的任何一个器件之后，都必须对光路进行调试。

首先，按shift键，开启电源，待氘灯点燃后，把波长设定为0nm，然后再把模板（调试光路的专用模具）放在反射镜M1、M2、M3和光栅上，如果没有模板，可把画有一竖线的白纸放在检测池的窗口处，使竖线正好位于流通池和参比池的中间，查看0nm亮线，是否与竖线重合，如果亮线不垂直，可拧松光栅支架上的光栅固定螺丝，轻轻转动光栅的位置，使亮线垂直。

如果亮线左右偏离竖线，则应调氘灯或反射镜M2的位置，使亮线与竖线重合。

如果亮线不能同时照射在流通池和参比池的窗口上，应用内六角扳手调整M2上面的螺丝，使亮线同时穿过流通池和参比池窗口。

调整完后，关闭电源，盖上光栅室的上盖，重新启动电源，待仪器自检后，再进行一次波长自动校正。

一般情况下，只要0nm亮线调整准确，486nm、656nm亮线经过波长自动校正后，都能将波长的误差控制在±1nm以内，使仪器显示CHECK GOOD。

光路的修理和调试是一个非常细致的工作，在修理或调试时，为了避免手不小心触摸到反射镜镜面而造成新的污染，一定要带上干净的手套。

特别是在调试光路时，为了减少杂散光引起的波长调试误差，最好在光线比较暗的室内调试。

当需要更换光栅部分的多个器件时，最好是更换一个调试一次，调好位置的器件，在更换下一个器件时不需要在重新调试。

1, 狭缝宽度在0.5mm量级上，而可见光在0.5um量级上，二者比>> 100倍，基本不用考虑衍射效应。

2, 杂散光主要来源不是狭缝衍射，而是光栅的高级次、所有光学元件表面的缺陷...
3，在通常的仪器中，衍射光由于不在正常光路中，是到不了样品室的。

即使有衍射光由于杂散的原因进入正常光路，它的能量也应是正常能量的0.01%以下，对于通常只有0.1% 精度的分光仪来说，直接忽略。