花药与花粉培养

小的多细胞团
植
胚状体
株
DNA复制
2 两种营养核
发生融合
发育
2n、3n或4n胚状体
只见于南洋金花中
4、花粉均等分裂途径
花 均等分裂 营养核 粉
生核核
营养细胞
多次分裂
发育
生殖细胞
多细胞团
愈伤组织
单 倍 体
胚状体 植
株
这个途径在南洋金花中相当普遍
第三节 花药培养
概念： 花药培养（anther culture）：指用无菌操作
技术将成熟或未成熟的花药接种在人工培养 基上，诱导花粉单性发育形成植株的过程。
一、花药培养的一般操作程序
1.培养基的选择 2.材料选取 3.材料预处理 4.材料消毒 5.接种 6.脱分化培养 7.再分化培养 8.花粉植株移植 9.染色体加倍
花药培养.swf
1.培养基的选择
Nitsch H、MS被广泛用于双子叶植物的花药培养。 B5：被广泛用于十字花科及豆科植物的花药培养。 禾谷类植物的花药培养，早期多采用Miller培养基、
第一节 概述
图8.1 花药（A）和花粉（P）培养的雄核发育和单倍体植株的各种方式图解
第二节 小孢子的形成和花粉的发育途径
一、小孢子的正常发育
二、花药培养时花粉发育途径
1营养细胞发育途径（A型） 2生殖细胞发育途径 3营养细胞和生殖细胞并进发育途径 4花粉均等分裂途径
一、小孢子的正常发育
第一期:四分孢子形成期
5.接种
• 在无菌接种室或超净工作台上进行接种操作， 采用直径3cm的试管，每管接种花药30～60粒。
• 必须注意：在操作过程中，不应使花药受到损 伤，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的 愈伤组织。损伤的花药要淘汰。
6.脱分化培养
• 根据材料不同，选取适宜的基本培养基、 适当的生长素比例和最适的温度进行培养， 经10～30天可诱导愈伤组织形成。
一、花粉培养的一般操作程序
• 花粉培养与花药培养的一般操作程序基本相同。 • 花粉培养在材料消毒后要将花粉从花药中分离出
来，再进行接种，其基本操作程序可参照花药培 养。
二、花粉的分离方法
自然散落法
把花药从未开的花中在无菌条件下取出，直接插接在无菌培养 基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药， 让花粉继续培养生长。如果是液体培养基，可接种大量花药， 经1～2天，大量花粉散落入培养基中，经离心浓缩收集，再 接种培养。
7.再分化培养
• 愈伤组织增殖到1～3mm大小时，应及时进 行再分化培养以获得花粉植株。
• 要选择含适当激素水平的培养基进行培养， 约经20～30天就能诱导苗的分化。
8.花粉植株移植
• 当花粉植株的根系生长良好时，就要及时 进行炼苗并移至苗床或大田。
• 试管中花粉植株的移植是一个由异养转变 为自养的过程，必须细心管理，保持幼苗 的水分平衡和促进新根的发生。
常见的植物：烟草、大麦、光叶曼陀罗、小麦、小黑麦和辣椒
2、生殖细胞发育途径
营养细胞
完全不再分裂
只分裂有限几次即停止
单
多次分裂
生殖细胞
多细胞团
发育
愈伤组织 胚状体
倍 体 植
株
只在天仙子中出现
3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径
有两种情况
多次分裂
营养细胞
大的多细胞团
愈伤组织 单
1
同时发育
倍
体
多次分裂
生殖细胞
MS培养基、N6培养基和马铃薯2号培养基。 Sunderland(1984)设计了C17培养基，用于水稻、小
麦、大麦、小黑麦、黑麦、玉米和甘蔗等禾谷类作物 的花药培养。
2.材料选取 不同植物花药培养的合适花粉发育时期
பைடு நூலகம்
植
物
种
减数分裂 中期
减数分裂 晚前期
四分体
水
稻
小
麦
玉
米
油
菜
大
麦
番
茄0
茄
子
辣
椒
拟南芥菜
机械挤压法
优点：操作简便 缺点：花粉中混杂有体细胞并且所得的悬浮液中花
粉密度也不易控制。
三、花粉培养的方法
直接培养法
从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接接种到培 养基中进行培养的方法为直接培养。
预培养法
将花药在基本培养基中预培养3～6天，然后取出花粉，经离心冲洗后， 在液体培养基中进行培养，密度为105个/ml。培养三周后，可见到各 个阶段的花粉胚；4～5周后，可发育成小植株。
琼脂浓度一般以花药有1/3浸入而又不沉没于琼脂中为宜。
液体培养法
液体培养的培养基厚约0.5cm,若能让花药漂浮在液 面上,效果最好。
加入聚蔗糖(Ficoll),可使花药不下沉而漂浮在液面 上。
第四节 花粉培养
含义：
花粉培养(pollen culture)是指把花粉从花药中剥离出来，在无菌的人工环境 中，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养使其进一步生长发育的技术。
优点：
在于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是 单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植 株。
花粉是研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机制的较为理想的材料。建 立花粉培养实验系统也可为深入开展细胞工程、遗传工程和分子生物学的研 究提供技术基础。
9.染色体加倍
• 人工方法：用0.02～0.4%秋水仙素处理植 株，双子叶植物处理生长点或腋芽，禾本 科植物在分蘖期处理。
• 单倍体植株可以通过自发的核内有丝分裂 产生的二倍体。
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二、花药培养的方法
琼脂固体培养法
在培养基中加入0.5～0.7%琼脂，使培养基呈半固体状态。加 入的琼脂量因琼脂质量而定。
0
甘
蓝
苹
果
葡
萄
烟
草
0
小黑麦
小黑麦×羊
茅
杨
树
单核期
0 0 0 0 0
0 0
0 0 0 0 0
0
双核期
0 0
成熟期
0 0
3.材料预处理
• 低温： • 高温 • 生长素 • 其他方法处理 常能提高愈伤组织和苗分化的频率。
4.材料消毒
取回的材料，在接种前进行表面灭菌，一般 用70～75％酒精，将表面擦洗即可。
第二期:单核期 特点：特化的细胞壁逐渐形成。 可分为：单核早、中、晚（靠边） 第三期：双核期
第四期：三核期
二、花药培养时花粉发育途径
1、营养细胞发育途径（A型）
花粉 生殖核（小）------不分裂或分裂几次后退化 营养核（大）-----经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖
而突破花粉壁，细胞持续分裂形成类胚体或愈 伤组织，最后形成单倍体植株
看护培养法
先把植物的完整花药放在半固体琼脂培养基表面，然后在花药上覆盖 一张滤纸小圆片，用移液管吸取0.5ml花粉悬浮液，密度是每毫升含 有20个花粉粒，滴在滤纸圆片上，置于26℃下培养。