ITS菌种鉴定方 法
its引物pcr体系学则
its引物pcr体系学则
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA片段的技术。
ITS （内转录间隔区）是真菌分类和鉴定的一种标记。
ITS引物PCR是一种基于PCR技术使用ITS序列进行菌种分类和鉴定的方法。
ITS引物PCR体系是包含DNA模板，引物，酶和缺失DNA，反应缓冲液和其他诸如浓度和pH值等条件的反应混合物。
常见的ITS引物包括ITS1和ITS4，是从内转录间隔区序列中选择的特定引物。
PCR反应分为三步，即变性、回退和延伸。
引物与DNA模板杂交，引物延伸成DNA链，扩增目标DNA序列，不断重复该过程可得到数百万个复制的DNA片段。
ITS引物PCR技术可以在短时间内快速确定真菌的系统分类位置和物种鉴定。
它简单易行，并可用于复杂菌群的鉴定。
因此，在微生物学、生态学、农业、食品科学等领域中得到了广泛的应用。
ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用
2 ITS 在真菌分子检测中的应用
目前 ， 关于真菌分子检测的研究主要是针对致病真菌进 行的。 传统病原真菌的检测主要基于形态学特征 、致病性测定 等。 但是这种方法耗时长、程序繁琐，不宜从发病初期的植株中 分离鉴定病原菌，难以做到对病害的早期检测 。 随着生物学的 发展，很多生物技术应用于检测领域 ，如酶联免疫荧光技术。 但 是该方法利用多克隆抗体进行检测 ，特异性不强 ，实际应用中 存在漏检现象［22］。 近年来 ，利用 PCR 扩增病原真菌核糖体 ITS 基因片段进行病原菌检测得到了很大发展 。 由于核糖体基因
第1期
白树猛等 ：ITS 序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用
53
面的研究起步较早，发展迅速，而且研究的范围比较广泛 ，主要 集中在黑粉菌 、疫霉菌 、轮枝菌 等植物病原菌的分类和系
［12］ ［13］ ［14］
利用 ITS 分子标记技术进行分子检测已经广泛应用于炭疽病 菌、大丽轮枝菌、黑斑病菌［27］、大豆疫霉菌等真菌分子检测中 。
ITS 序列系统发育树。 结菌株序列相似性较低 。 陈永青［8］等采用随机扩增多 态性 DNA 技术和核糖体 ITS 序列分析，对 22 种拟茎点霉共 34 个菌株进行了系统发育研究 ，结果表明 ，两种技术用于拟茎点 霉的亲缘关系分析和种类鉴定是可行的。 杨雅云［9］等对马铃薯 及番茄晚疫病菌的核糖体 DNA 的 ITS 区段序列分析表明 ，相 似的序列使得生物学特性也很相似 ，从而确定它们的亲缘关系 也就近。Karen 等［10］对 l7 属 44 种外生菌根菌 rDNA 上的 ITS 多 样性进行了研究 ，证实了 ITS 区域种间多样性较高 ，而种内多 样性较低。 Pritsch 等［11］系统研究了赤杨根系 16 种不同形态类 型的外生菌根 ITS 的多态性 ， 并与采集于 3 个赤杨林地的 28 种外生菌根菌的子实体 ITS 多态性进行了比较研究 。 国外这方
白僵菌菌株的ITS序列鉴定
Science &Technology Vision 科技视界白僵菌属Beauveria Vuill.是全球分布的最常见的土壤虫生真菌[1],包含有球孢白僵菌B.bassiana (Bals.-Criv.)Vuill.和布氏白僵菌B.brongniartii (Sacc.)Petch 这两种具有重要经济价值的种类。
前者是森林生态系统中最为常见的一种昆虫病原真菌,属世界性分布物种,是害虫虫口自然调节的重要因子和以菌治虫的重要生物防治材料[2]。
因其具有致病性强、寄主范围广、对动物植物无害、不污染环境及易培养的优点,被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一[3]。
随着分子生物学技术的发展,相关技术也开始广泛被应用于昆虫病原真菌的分类和鉴定中。
ITS (内转录间隔区Internal Transcribed Spacer)ITS 区域序列的测定是目前真菌分类研究的一项重要技术手段,对于鉴定白僵菌及研究真菌属内和属间遗传关系具有重要作用[4-8]。
ITS 区指的是5.8S rDNA、18S rDNA 和28S rDNA 之间的转录间隔区,因其进化相对迅速而具多态性与保守性,对此序列的检测有助于分析菌株的遗传关系适合较低水平的系统学研究,真菌的ITS 序列长度一般在550-750bp(碱基对)。
ITS 序列主要被用于对不同生物型、菌株、种、属的分类鉴定,也可用于研究近或低级分类阶元的系统发育。
本文以研究室保存的8株白僵菌菌株为研究材料,通过对其ITS 序列的鉴定,明确菌株的遗传背景,找出不同菌株间的遗传差异,为进一步的研究提供准确可靠的研究材料。
1材料与方法1.1供试菌株随机选取8株于本实验室保存的球孢白僵菌菌株进行实验。
其编号分别为Bb01-Bb08。
1.2培养基液体SDY 培养基:蛋白胨1.0%,酵母粉1.0%,葡萄糖4.0%,pH 值7.0;PDA 培养基:200g 土豆去皮沸水煮20min,取汁,葡萄糖2.0%,琼脂粉2.0%。
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌共4页
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。
丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。
随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。
本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。
1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。
阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。
1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。
1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。
具体步骤如下：①50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的 EP管中。
②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。
③80℃热变性 15 分钟后，低速离心，取1～5μl 裂解后的上清液作为 PCR 反应的模板。
1.4 真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。
PCR反应总体积50μl，10×buffer 5μl ，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L， DNA 模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，加入灭菌去离子水至50μl。
ITS菌种鉴定方 法
利用ITS 进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。
ITS 是内源转录间隔区( Internally Transcribed Spacer)的英文缩写, 位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。
其优点有: 具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800 bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列, 能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。
这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。
每个重复的rDNA 序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA 小亚基单元(SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。
本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析,结合传统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比较分析。
种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。
ITS区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。
其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。
选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。
因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。
1、通用引物①：ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3’ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’通用引物②ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC一3’。
利用ITS序列鉴定真菌
利用ITS序列鉴定真菌一、实验目的1，了解利用ITS序列鉴定真菌的原理；2，掌握用ITS序列鉴定真菌的方法步骤二、实验原理菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。
内转录间隔区ITS，位于18S和5.8S rDNA（ITS1）之间以及5．8S和28S rDNA之间（ITS2），ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8S RNA基因也被包括在ITS之内。
近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR 扩增、测序。
随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。
三、实验材料仪器用具：恒温水浴锅，移液器，离心机，核酸蛋白分析仪，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，PCR仪，离心管，微量移液器，枪头，一次性手套， PCR管 (0.2ml)；材料：金针菇试剂：1，基因组DNA提取试剂：氯仿-异戊醇(25︰1)；无水乙醇；蒸馏水；70%乙醇；TRIS饱和酚(pH 8.0) 提取液（Tris–HCl 1mol/L pH 8.0）2，特异性片段的PCR扩增试剂:MgCl2（25mM）；琼脂糖；DNA分子量标准物（100bp ladder）；10x缓冲液（Mg2＋free）；dNTP（10mM each）；Tag酶（5U/μL）；DNA模板；10μM引物：upper (31bp)；lower (30bp)3，ITS引物四、实验方法与步骤1，金针菇因组DNA的提取（TRIS 饱和酚一步法）。
⑴称取新鲜金针菇约0. 5 g ,置于洁净的小研钵中；⑵向研钵中直接加入1 ml TRIS饱和酚(pH值为8.0) 提取液,充分研磨至糊状；⑶用尖端剪除0. 5 cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到2 ml的离心管中,充分振荡约1 min ,随即加入0. 5 ml的氯仿-异戊醇(25︰1) ,轻轻振荡混匀；⑷将离心管于4 ℃,12 000 r/ min 离心10 min ,吸取上清于新离心管中,每管加入2 倍体积的无水乙醇,冰上放置10 min ；⑸4℃，12000 r/ min离心10 min ,弃上清；⑹沉淀用70 %乙醇漂洗2 次,超净工作台中吹干后,加50μl的蒸馏水溶解, - 20 ℃保存备用。
真菌its鉴定
真菌its鉴定真菌（Fungi）是一类特殊的生物，可以在各种环境中生存并繁殖。
它们通常以分解有机物质为生，有着重要的生态作用。
在鉴定真菌时，我们可以使用ITS（Internal Transcribed Spacer）序列来进行分析和判断。
ITS序列位于真菌的核糖体RNA基因间区域，是真菌基因组中高度变异的部分。
通过对ITS序列的测定和比对，我们可以确定真菌的物种归属和亲缘关系。
ITS序列的鉴定已经成为现代真菌分类学的重要手段之一。
ITS序列的鉴定过程通常包括以下几个步骤：第一步是样品的采集和处理。
我们可以从土壤、水体、植物组织、动物体表等不同的环境中采集样品。
采集后，我们需要将样品进行处理，提取其中的真菌DNA。
第二步是PCR扩增。
在这一步中，我们使用特定的引物对样品中的ITS序列进行扩增。
PCR扩增是一种将目标DNA序列扩大数百倍的技术，可以提高后续的测序效果。
第三步是测序和比对。
在这一步中，我们使用测序仪对PCR扩增得到的产物进行测序。
测序结果将是一系列的碱基序列，我们可以将这些序列与已知的ITS序列数据库进行比对，以确定真菌的物种归属。
第四步是数据分析和解读。
在这一步中，我们将根据比对结果来判断真菌的物种归属和亲缘关系。
通常情况下，我们会将测序结果与数据库中的参考序列进行比对，并计算相似性和进化距离等指标来评估真菌的分类位置。
通过ITS序列的鉴定，我们可以辨别出不同物种的真菌，了解其在生态系统中的分布和功能。
这对于研究真菌的多样性、生态学和进化等方面具有重要意义。
除了ITS序列，还有其他一些DNA标记物可以用于真菌的鉴定，如18S rRNA、28S rRNA等。
不同的标记物具有不同的特点和应用领域，在具体的研究中可以根据需要选择合适的标记物进行分析。
总结起来，真菌的ITS序列鉴定是一种常用且有效的方法，可以帮助我们准确地鉴定真菌的物种归属和亲缘关系。
随着测序技术的不断发展和数据库的不断完善，我们对真菌的了解也将越来越深入。
真菌its鉴定
真菌its鉴定真菌ITS鉴定一、引言真菌是一类广泛存在于自然界中的生物，它们在生态系统中扮演着重要的角色。
然而，在许多情况下，真菌的鉴定对于研究者和生物学家来说是一项具有挑战性的任务。
近年来，随着分子生物学技术的发展，特别是通过ITS序列分析，真菌ITS鉴定成为了一种常用且准确的方法。
二、真菌ITS序列ITS（Internal Transcribed Spacer）序列是真菌基因组中的一段高变区域，位于核糖体RNA基因之间。
由于ITS序列的高变性和高保守性，它成为了真菌鉴定的理想标记。
ITS序列的长度通常在150到600个碱基对之间，其中包含了1个或多个转录间隔区（ITS1）和1个内转录间隔区（ITS2）。
通过测定ITS序列的核苷酸组成，并与已知真菌ITS序列进行比对，可以准确确定待鉴定真菌的种属归属。
三、真菌ITS鉴定的步骤1. 样品采集：首先，需要采集待鉴定真菌的样品。
可以选择从不同的环境中采集，如土壤、水体、植物组织等。
采样时要注意避免外部污染，并尽量保持样品的完整性。
2. DNA提取：将采集到的真菌样品进行DNA提取。
常用的DNA提取方法包括CTAB法、菌丝破碎法等。
提取的DNA应该具有足够的纯度和质量，以确保后续的PCR反应能够成功进行。
3. PCR扩增：使用特定的引物对ITS序列进行PCR扩增。
引物的选择应该基于已知真菌ITS序列的保守区域。
PCR反应的条件需根据引物的特性进行优化，以获得高效的扩增。
4. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确定扩增的片段大小和纯度。
通常使用琼脂糖凝胶和DNA分子量标记物来判读PCR产物的大小。
5. 测序和序列分析：对PCR产物进行测序，并将测序结果与已知真菌ITS序列进行比对。
可以使用多种软件和数据库进行序列比对和物种归属的确定，如BLAST、NCBI等。
6. 结果解读：根据比对结果，确定待鉴定真菌的物种归属。
通常，根据ITS序列的相似性百分比和支持率来判断物种归属的可信度。
基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究
摘要本实验是利用采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌子实体作为研究对象，通过常规CTAB法对该子实体进行基因组DNA提取，并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4对特异的DNA片段进行PCR扩增，将扩增产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，并在紫外透射反射分析仪下观察检测的结果，对于较好的扩增产物利用回收试剂盒进行纯化，后将纯化产物送由上海生工进行DNA测序，将测序所得到的序列输入GeneBank数据库中的局部相似性查询（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)程序进行比对，列出数据库中与所测得到的序列同源性较高的序列信息并进行分类鉴定，然后运用软件raxmlGUI进行系统发育树构建。
最终的研究结果显示该菌种属于报道的choiromyces helanshanensis。
关键词：外生菌根真菌；ITS序列；分子生物学；鉴定AbstractIn this experiment, an ectomycorrhizal fungi collected from Helan Mountain, Inner Mongolia, was used as the research object. The extraction of genomic DNA of the fruiting body of ectomycorrhizal fungi was carried out by the conventional CTAB method. The specific primers ITS1F and ITS4 were used to amplify the specific DNA sequences by PCR amplification. The amplified products were tested by electrophoresis with a 1% agarose molecular biology grade gel, and the results of the gel were observed under the ultraviolet transmission reflectance analyzer. The better amplification products were purified by using a recovery kit. Then, the purified products were sent to Shanghai Shenggong for DNA sequencing. The sequence obtained by sequencing was input into the Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) program in the GeneBank database for comparsion. In the database, find out the sequences with higher homology with the sequencedsequences and perform the classification and identification. The phylogenetic tree was constructed by using the software raxmlGUI. The final results showed that the strain belongs to the reported Choiromyces helanshanensis in Helan Mountain, Inner Mongolia.Key words：ectomycorrhizal fungi; ITS sequence; molecular biology; identification目录引言 (1)1 材料与方法 (3)1.1 实验材料 (3)1.2 实验设备及药品 (3)1.2.1 试剂配方 (3)1.3 实验方法 (3)1.3.1 基因组DNA的提取 (3)1.3.2 rDNA ITS区段的PCR扩增 (4)1.3.3 PCR扩增产物的回收和纯化 (5)1.3.4 DNA测序分析 (5)2 结果与分析 (6)2.1 PCR产物的检测 (6)2.2 提纯效果的检测 (6)2.3 rDNA ITS序列的同源性分析 (7)2.4 raxmlGUI系统发育树分析 (9)3 结论与讨论 (10)参考文献 (11)致谢 (12)引言贺兰山坐落于宁夏回族自治区的西北部，是银川平原的原始屏障，也是三北防护林建设的重点地段[1]。
真菌核糖体its检测实操目的
真菌核糖体its检测实操目的真菌核糖体ITS检测实操目的目的：真菌核糖体ITS（Internal Transcribed Spacer）序列是一种常用于真菌分类和鉴定的分子标记。
ITS区域包含了16S和23S rRNA基因之间的非编码DNA序列，其高度变异性使其成为真菌物种鉴定的理想工具。
本实操旨在介绍真菌核糖体ITS检测的实际操作步骤和相关技术。
一、材料准备1. 真菌样品：选择需要进行ITS检测的真菌样品，可以是环境中采集得到的土壤、水样或植物组织，也可以是临床标本等。
2. DNA提取试剂盒：根据实验室使用情况选择适合的DNA提取试剂盒，如基于磁珠或柱子等原理的试剂盒。
3. PCR试剂盒：选择适合进行PCR扩增反应的试剂盒，包括聚合酶、引物、dNTPs等。
4. DNA电泳试剂：准备琼脂糖、TAE缓冲液和DNA染料等。
二、DNA提取1. 根据所选DNA提取试剂盒的操作手册，准备所需的试剂和设备。
2. 根据样品类型选择合适的提取方法，如土壤样品可以采用差异离心法或磁珠法，植物组织可以采用CTAB法等。
3. 按照试剂盒说明书的操作步骤进行DNA提取，注意保持操作环境的无菌和干净。
三、PCR扩增1. 根据所选PCR试剂盒的操作手册，准备所需的试剂和设备。
2. 设计合适的引物对，一般选择ITS1和ITS4引物对进行扩增。
根据需要可以选择其他引物对进行特定真菌属或种的扩增。
3. 准备PCR反应体系：将PCR试剂按照比例加入PCR管中，并加入模板DNA。
注意设置阴性对照组和阳性对照组。
4. 设置PCR反应条件：根据引物、模板DNA浓度等因素设置合适的PCR反应条件，包括温度、时间等参数。
5. 进行PCR扩增反应：将装有反应体系的管放入热循环仪中进行扩增反应。
四、电泳分析1. 准备琼脂糖电泳胶：按照比例将琼脂糖加入TAE缓冲液中，加热溶解后倒入电泳槽中，插入电泳膜。
2. 准备样品：将PCR扩增产物和DNA标记物混合，加入适量的DNA加载缓冲液，轻轻混匀。
菌株 its 序列
菌株its序列简介菌株its序列是一种用于分析真菌的种属和物种鉴定的标志性分子位点。
在分类学和生态学研究中，通过检测和比较菌株中的its序列差异，可以对真菌的分类、进化和多样性进行深入的研究。
its序列的定义菌株its序列即真菌内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，位于真核生物的rDNA中，包括ITS1、5.8S rRNA和ITS2三个区域。
其中，ITS1和ITS2是高变区，可以用于研究种属和物种间的变异。
ITS序列在物种鉴定中的应用ITS序列由于其具有高变性和物种特异性的特点，在真菌物种鉴定中得到广泛应用。
通过与数据库中已知的ITS序列比对，可以准确地将不同的菌株归类到其相应的物种或属级分类。
基于ITS序列的物种鉴定方法，可以实现快速、准确和高通量的真菌鉴定。
ITS序列的分析方法收集菌株样本在进行ITS序列分析之前，首先需要收集菌株样本。
可以选择不同环境中的真菌，如土壤、水体、植物等，或者从已知物种中选取不同的菌株进行分析。
提取菌株DNA从收集的菌株中提取总DNA，可以利用商用的DNA提取试剂盒进行提取。
保证提取的DNA质量和浓度足够用于后续的PCR扩增反应。
PCR扩增ITS序列利用特异性引物对ITS序列进行PCR扩增。
常用的引物对包括ITS1和ITS4。
在扩增过程中，需要根据反应条件进行优化，如温度、循环数等。
扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
分离和纯化PCR产物对PCR扩增得到的产物进行分离和纯化。
可以使用商用的PCR产物纯化试剂盒，或者通过凝胶切割和DNA回收的方法进行纯化。
测序和序列比对将纯化的PCR产物进行测序，可以选择传统的Sanger测序方法，也可以选择高通量测序技术。
得到测序结果后，进行序列比对，可以使用BLAST等序列比对软件进行比对和比对结果的分析。
物种鉴定和系统发育分析根据ITS序列比对结果，可以进行物种鉴定和系统发育分析。
基于ITS区序列的疑似野生双孢菇菌株的分子鉴定
图１ 显示 ， Ｓ区段是位于 ５ ０—７０ ｂ 间的序 列 ， Ｉ Ｔ ０ ５ ｐ之 琼
脂糖凝胶 电泳检测条带单一 、 清晰 ， 说明 Ｉ 通用引物适合 疑 Ｓ Ｔ
似野生双孢菇菌株的核糖 体基 因转 录间隔 区， 样本符合测序 的条件 。
Ｃ ３ ～ ０ ｐ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ ；５ ４ ０ ｂ ： Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｃ １
（． １ 塔里木大学食用 菌研究所 ， 新疆阿拉尔 ８ ３０ ； ４ ３ ０ ２ 塔里木盆地生物资源保护利用省部共建国家重点实验室培育基地 ， ． 新疆阿拉尔 ８ ３０ ） ４ ３０
摘要 ： 通过提取新疆南疆疑似野生双孢 菇基 因组 Ｄ Ａ， Ｎ 采用通用 引物 ＩＳ Ｔ １和 ＩＳ Ｔ ４扩增 ＩＳ区序列 ， Ｇ ｎ ａｋ Ｔ 在 ｅＢ ｎ 中进行 Ｂ Ａ Ｔ， Ｌ Ｓ 对疑似菌株双孢菇进行初 步分 子鉴定 。结果表 明 ： Ｇ ｎ ａｋ的核酸序列数 据库 中登陆 的、 在 ｅＢ ｎ 与双孢 菇
收稿 日期 ：０ １—１ ９ ２１ ０—１
退火 ３ ，２℃延伸 １ｍｎ共 ３ ０ｓ７ ｉ， ０个循环；２℃延伸１ ｉ。 ７ ０ｍｎ １２ ４ ＩＳ区序列测定 ． ． Ｔ 将 Ｐ Ｒ产物送往上 海生工 生物工 Ｃ
基 金 项 目： 疆 生 产 建 设 兵 团 科 技 攻 关 项 目 （编 号 ： 新
ＩＳ Ｔ 序列 相似度 为 ９ ％ ， 数十种之 多 ， 中与登 录号为 Ｅ４０５ ９ 达 其 Ｆ６３４的双孢菇 同源性 达 １０ ， ０％ 覆盖率 达 ９％ 。根 据 １ ｒＮ Ｓ区序列分析准则和双孢 菇的形态 特征 ， Ｄ ＡＩ Ｔ 鉴定新疆南疆疑似野生双孢菇为双孢菇 （ｇｒｕ ｂｐｒ ） Ａ ａｃｓ ｉｏ ｓ 。 ｉ ｓ ｕ
木霉菌定殖的its鉴定方法
木霉菌定殖的its鉴定方法
木霉菌（Wood-decay fungi）是一类生长在木材上并导致木材腐烂的真菌。
其鉴定方法通常涉及到对其内部转录间隔区（ITS，Internal Transcribed Spacer）的序列进行分析。
以下是关于木霉菌ITS鉴定方法的详细解释：
1. 样品收集，首先需要收集含有木霉菌的样品，例如腐烂的木头或者土壤样品。
确保样品收集的干净和完整性，避免外部污染。
2. DNA提取，从样品中提取木霉菌的DNA。
这通常涉及使用商业DNA提取试剂盒，遵循制造商的指南进行操作。
DNA提取的质量和纯度对后续的ITS序列分析至关重要。
3. PCR扩增，使用特定的引物（primers）对木霉菌的ITS区域进行PCR扩增。
这些引物通常是针对ITS1和ITS4区域设计的，能够特异性地扩增木霉菌的ITS序列。
4. 测序，对PCR扩增得到的ITS片段进行测序。
现代测序技术如Sanger测序或者高通量测序均可用于ITS序列的获取。
5. 序列分析，获得ITS序列后，将其与已知的木霉菌ITS序列数据库进行比对分析，以确定该木霉菌的物种。
常用的数据库包括GenBank、UNITE等。
6. 生物信息学分析，对获得的ITS序列进行生物信息学分析，包括构建系统发育树、物种多样性分析等，以进一步确认木霉菌的分类地位和系统发育关系。
除了上述的分子生物学方法外，还可以结合形态学特征、培养特性等传统的鉴定方法，以获得更全面的木霉菌鉴定结果。
总之，木霉菌ITS鉴定方法涉及到从样品收集到分子生物学分析的一系列步骤，需要综合运用多种技术手段和方法。
its序列鉴定真菌的原理
its序列鉴定真菌的原理ITS序列鉴定真菌的原理ITS序列是真菌的一个非常有用的鉴别工具，因为它是真菌中较小亚基的核糖体RNA基因簇的一部分，该部分是真核生物中RNA合成的必需部分。
ITS序列是指包含核糖体RNA基因簇内部转录间隔区1（ITS1）和2（ITS2）的DNA序列，它们分别位于核糖体RNA基因的5'和3'端。
ITS序列是小、高变异性的基因区域，通常用于标识特定的物种，因为它在物种级别上具有相对的保守性和可变性。
ITS序列也很有用，因为它可以从多个拷贝基因中重放并预设为同一区域，这使得在不同物种之间进行比较更容易。
下面，我们将详细介绍ITS序列鉴定真菌的原理：1. 样品采集首先，要进行ITS序列的鉴定，需要从样品中提取真菌的DNA。
在采集样品时，要选择适当的采集方法和合适的时间、地点，以最大限度地提高样品的纯度和品质。
电子显微镜、光学显微镜和PCR等技术可以用于检测和识别真菌。
2. PCR扩增在DNA提取后，应该进行反转录聚合酶链反应（RT-PCR）来扩增ITS序列。
将具有与所需ITS序列共同端的引物用于PCR扩增。
PCR扩增结束后，产生的DNA片段需要分离和纯化，以提高测序准确性。
3. 测序分析一旦PCR产物得到纯化，就可以送到测序中心进行测序分析。
通过将ITS序列与数据库中其他物种的ITS序列进行比较，可以确认样品是否与参考物种类似。
还可以使用计算机程序进行序列比对、构建进化树等分析，以确定物种的分类，从而探索物种间的关系。
ITS序列鉴定真菌的原理为分子生物学和生物信息学提供了一种强大的新颖方法，可以快速，可靠地鉴别和分类真菌，并为环境和健康调查等提供方便实用的工具。
然而，此种方法也存在一定的局限性，例如它严重依赖于可用ITS序列的数据库和文献，它无法检测到种类水平相似甚至相同的物种，也无法鉴别未知的物种。
因此，人们需要更多的发展和改进，解决这种方法在真菌鉴定中的限制，并使其成为更完善、更可靠的工具。
ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用_陈剑山
ITS 序列分析在真菌分类鉴定中的应用陈剑山1,2,郑服丛1,2*(1.华南热带农业大学环境与植物保护学院,海南儋州571737;2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州571737)摘要 综述了I TS 序列分析技术的原理、特点及近年来在病原真菌分类鉴定上的应用,同时对ITS 序列分析技术在真菌分类鉴定研究领域中的前景进行了展望。
关键词 ITS;分类;鉴定中图分类号 Q 789 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)13-03785-02A pplicatio n of ITS Sequences in Fungi C lassification and Identifica tion C HEN J ia n -shan et al (E nvi ronmen t and Pl an t Protecti on College,SC UTA,Danz hou,Hainan 571737)Abstract The pri nci ple,characteristics an d the ap plication of I TS seq uences in fun gi classification and identification in recent years were sum marized.And i ts prospect was pu t forward.Key w ords I TS;C lassification;Identificati on真菌的分类鉴定是一项浩大的系统工程。
传统的真菌分类学主要按照真菌的形态学、生理生化特点、抗原构造等特征。
由于真菌的种类众多、个体多态性明显,因此传统的分类学指标常会得出假阳性或假阴性结果,给真菌的分类鉴定带来了一定的难度。
而现代分子生物学技术,特别是核酸分子生物学技术,在1953年Watson 和Cric k 提出D NA 双螺旋结构以来得到迅速发展,并且已应用到各个学科领域。
rDNAITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展
ｂｐ之间。
ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析的应用原理 ｒＤＮＡ上的１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓ ｒＤＮＡ基因序列进化
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ均被正确检测出，结果与生化检测和形态 学鉴定的结果一致，且检测时间（６ ｈ）远远小于生 化检测（２６ ｈ）和形态学鉴定（８２ ｈ）所需时间。 速率慢且相对保守，存在广泛的异种同源性，其中 小亚基１８Ｓ ｒＤＮＡ序列常被用来研究属及属以上 分类群的演化关系，大亚基２８Ｓ ｒＤＮＡ中的Ｄ１／Ｄ２ 区域可用于属及临近等级的分类群＂Ｊ。ｒＤＮＡ—ＩＴＳ 由于不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较 小，进化速率较快，具有广泛的序列多态性，在其保 守性上表现为在种内不同菌株之间高度保守，而在 真菌种间差异明显，这种特点使得ＩＴＳ适合于真菌 物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明 显的菌群间的系统发育关系分析【８ｊ。ＩＴＳ区域相 对较短，能够很容易根据其保守区设计通用引物， 进行ＰＣＲ扩增，且该序列具有重复的多拷贝特性， 使ＩＴＳ区很容易从少量、稀疏或高度降解的ＤＮＡ 样品中获得一１。
由于ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列能准确快速地反映出属
间、种间以及菌株间的碱基对差异，目前已越来越
万方数据
・１２４・
澳大利亚的９６株新生隐球菌菌株的ＩＴＳ区进行序
序列存在４种亚型。中国发现的原新生隐球菌上
列分析，并明确地将新生隐球菌鉴定至变种水平。
Ｗａｔａｎａｂｅ等ｕ副曾对１２个国家的临床标本中分离 的２０４株申克孢子丝菌的ＩＴＳｌ、５．８ＳＲＮＡ基因和 ＩＴＳ２区测序分析，发现在各株之间碱基对差异一 般是８个以内，最大差异率是３．２％，而在申克孢 子丝菌和Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｉｓ ｓｔｅｎｏｃｅｒａｓ之间碱基对的差异 率是１０％以上。
存在费时及易受实验条件影响等不足，核糖体ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列分析法已越来越广泛的应用于真菌属内不同种间的系统发育 研究中。本文综述了核糖体ｒＤＮＡ．ＩＴＳ鉴定深部真菌菌种的研究进展，展望了其应用前景。
利用ITS序列鉴定真菌
利用ITS序列鉴定真菌摘要：采用蘑菇提取的DNA及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后进行分析照相，测序。
随着核糖体Rdna ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息的到阐明。
关键词：ITS序列酵母菌 PCR 菌种鉴定1 材料与方法1.1材料与试剂：真菌组织（蘑菇）、菌丝体或孢子、氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。
70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。
10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。
1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次，CTAB 溶液、异丙醇，双蒸水，3MNaAc，PH5.2 20ug/RNaseA，特异性片段PCR扩增，ITS引物（F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）。
1.2主要仪器与设备表一实验中使用的主要仪器仪器名称型号产地立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂数显HH-4 国华电器有限公司电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂制冰机AF200PSC50R ΜSA生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany电子精密天平HR-200 上海精科天平酸度计DELTA302 上海电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂台式常温高速离心机Centrifuge 5415D Germany恒温水浴锅多型号Germany生化培养箱LRH-250 上海一恒科技有限公司基因扩增仪Palm-Cyeler Aμstralia电泳槽DYCZ-24A 北京六一仪器厂1.3实验方法：真菌基因组DNA的提取（1）CTAB溶液在65℃水浴中预热（使用前加入1％巯基乙醇），取适量（2）取适量蘑菇置于研钵中，加入液氮，用小杵磨制粉状，研磨期间及时添加液氮防止高温氧化。
ITS序列分析法鉴定烟草病株分离出的两种真菌
1.1 材 料
烟株 烤烟品种云32，邵武地区种植，发病后送检。
孟加拉红培养基 北京奥康星生物技术有限责任公司 PDA培养基 北京奥康星生物技术有限责任公司 真菌基因组DNA快速抽提试剂盒 生工生物工程上海股份有限公司。改良马丁培养基配方1 L 蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸镁0.5 g， pH值 6.4，121 ℃灭菌20 min。
PCR反应体系为50 L DNA模板2 L 10缓冲液5 L d NTP每种2.5 mmolL12 L 引物10 molL1各2 L Taq DNA 聚合酶5 UL10.4 L 无菌水补足至50 L。PCR反应程序为 95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 L PCR产物加1 L 6溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上110 V电泳35 min，凝胶成像仪拍照。
1.2.4 ITS序列分析 测序交由生工生物工程上海股份有限公司进行，对所得序列进行BLAST分析[6]，采用Maximum LikelihoodML法构建系统发育树，Bootstrap 重复500 次检验各分支的置信度，最终确定菌株的分类地位。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离纯化
烟草作为一种重要的经济作物，在我国的种植面积和产量均居世界前列，但每年烟草病害的发生比较严重，给烟农和国家经济带来巨大损失。我国烟草种植区域广，病害种类、分布和危害情况因不同地域而有很大差异，全国 16个主产烟省区烟草侵染性病害有62种，其中真菌性病害30种[1]。福建省是我国烟草主产区，烟草侵染性病害发生种类有31种[2]，主要为烟草炭疽病、烟草赤星病、烟草黑胫病、烟草青枯病、烟草病毒病等5类[3]，在31种烟草侵染性病害中真菌性病害有10种，且新的侵染性病害不断出现，如米根霉引起的烟叶霉烂病等[4]。
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利用ITS 进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。
ITS 是内源转录间隔区( Internally Transcribed Spacer)的英文缩写, 位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。
其优点有: 具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800 bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列, 能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。
这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。
每个重复的rDNA 序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA 小亚基单元(SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。
本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析,结合传统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比较分析。
种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。
ITS区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。
其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。
选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。
因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。
1、通用引物①：
ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3’
ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’通用引物②
ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’
ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC一3’。