红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文

开题报告

课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文

系别城市建设学院

专业班生物工程0701班

姓名于凯

评分

指导教师

华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。

研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。

若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。

如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。

另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。

1.1.3关于MYB基因

①MYB基因

目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

2MYB基因编码蛋白（MYB蛋白）的结构特征

作为一类转录因子，无论在动物和植物中，MYB蛋白均具有高度保守的DNA结合结构

域以及转录激活域。动物中的MYB蛋白DNA结合域通常含有3个50-55个氨基酸的不完全重复区，每个重复区折叠成一个螺旋-转角-螺旋（HTH）结构，插入到目标DNA的大沟中[8]。植物的MYB蛋白大多含两个重复区，分别与动物MYB蛋白DNA结合结构的R2、R3相似，也发现了有3个重复区及只含有1个重复区的MYB蛋白[9]。MYB蛋白的DNA结合结构域集中在氨基端(图1)，每个重复区含有3个在空间上规则排列的色氨酸残基，这3个色氨酸残基在折叠形成MYB结构域的疏水核心中起重要作用，一般在所有的MYB 蛋白中是保守的，但R3的第1个色氨酸残基可被芳香族氨基酸(如苯丙氨酸)或其他疏水氨基酸所代替[10]。

③MYB基因的功能

通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。MYB转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，几乎参与了植物发育和代谢的各个方面[11]。MYB类转录因子可与其它转录因子家族成员尤其是bHLH类转录因子相互作用，通过组合调控的方式调节植物细胞的形成与模式建成，调节植物次生代谢特别是苯丙氨酸代谢，并对外界环境、激素及病虫害等做出应答[12]。

④MYB基因的研究进展

自Paz-Ares等从单子叶植物玉米中克隆出与色素合成相关的ZmMYBC1基因以来，大量MYB类基因从各种植物中得以分离鉴定[12]。其中在拟南芥中已发现超过198个Myb 家族基因，玉米有超过80个MYB转录因子，而棉花中发现大约有200个MYB转录因子[13]。

大量的研究表明，MYB基因，特别是R2R3-MYB基因在参与调控植物次生代谢途径中的作用至关重要。详细的调控情况见下表[14]

1.2研究的目的和意义

先从红豆杉细胞中克隆MYB基因，探索这种基因表达的转录因子与红豆杉细胞中次级代谢产物紫杉醇的表达量的关系。从而为构建基因工程植株，工业化生产紫杉醇提供依据。

探索红豆杉细胞中转录因子对其次级代谢产物紫杉醇的调控作用，有利于了解紫杉醇的生物合成途径，能够给构建高产紫杉醇的转基因工业化菌种或植物提供方向。如果MYB基因的表达确实在调控紫杉醇的合成过程中起到促进作用，接下来就可以建立转基因植株，以及建立更为期待的转基因工程菌种，为紫杉醇的工业化生产提供思路。这一方面有利于满足当今社会人们对这种抗癌特效药的需求，也在另一方面保护了红豆杉物种，维持了生态平衡，实现了生态的可持续发展。

2课题研究的主要内容

2.1本课题研究的切入点

MYB转录因子在多种植物中参与了次生代谢产物的调控，如在苯丙素代谢途径中的关键调控作用[15]，以及对于花色素苷的产生起着关键作用[16]，而且能够有效增强类黄酮生物合成基因的表达[17]，等等。目前，许多研究表明，作为代谢途径的关键基因的转录因子，MYB基因的表达产物对于萜类次级代谢产物的合成至关重要[18]。紫杉醇就是一种四环二萜类化合物[19]，它在红豆杉中的生物合成是否也受到MYB转录因子的调节，参与紫杉醇生物合成途径的关键酶基因的启动子是否能够被MYB转录因子所识别，从而调控这些基因的表达。因此，本课题从转录调控的角度，探索红豆杉MYB转录因子在其次级代谢产物合成过程中的作用，尤其是对于代谢产物紫杉醇的调节作用。

3.研究方法

3.1研究方案

（1）提取红豆杉总RNA

①Trizol法提取总RNA

②浓度和纯度检测：用紫外分光光度计测定样品OD260、OD280和OD230的值

以及

OD260/OD280和OD260/OD230的比值。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度、完整性。

（2）逆转录合成第一链

按照反转录试剂盒说明书的方法合成cDNA第一链。

（3）利用特异引物扩增cDNA

PCR扩增程序：95℃预变性6min，94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后降温10min，16℃保温10min。

（4）序列分析

①将（3）中的PCR产物与marker进行琼脂糖凝胶电泳，对比检验扩增产物，确定其分子量大小。

②回收DNA。

（5）基因表达分析

采用荧光定量PCR技术对回收的基因进行定性和定量分析。

（6）构建原核表达载体，进行原核表达

构建的原核表达载体pET32a(+),并将MYB基因克隆入载体内，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达。

（7）构建亚细胞定位载体，胞内定位分析

构建亚细胞定位载体pCAMBIA1304，基因枪法转入洋葱表皮细胞，通过GFP荧光检测MYB基因在胞内定位情况。

（8）构建组成型表达载体pCAMBIA1303

构建组成型表达载体pCAMBIA1303,并将MYB基因克隆入该载体内，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒，瞬时转化红豆杉细胞验证。