拟南芥胁迫处理条件

常见拟南芥胁迫条件处理方法：

盐胁迫处理方法：将野生型和转基因植株移入营养土中，放在培养箱中培养，每隔2天用1/8Hongland营养液浇灌，生长4周后，用含50mmol.LNaCl的1/8Hongland营养液浇灌，每隔一天以50mmol.L的浓度递增，最后到达终浓度0,50,100,150,200mmol.L，保持终浓度7天后，测定相关指标。每个指标至少6个重复。

干旱胁迫处理：将野生型与转基因植株分别种植在营养土中，用1/8Hongland营养液浇灌至田间最大持水量培养4周。然后停止浇水，使土自然变干，直到7天后所有植株出现萎蔫，在第8天再回复浇水至田间最大持水量。胁迫期间，每隔1天测定相关指标，每隔指标至少6个重复。通常测定指标包括：地上部分干重，钠钾钙含量，叶片相对含水量，叶片质膜透性（相对导电率），MDA（采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量），净光合速率。

PEG胁迫处理：PEG抑制主根生长：在40%PEG处理下Col-0和Ws主根的生长完全被抑制，并且Col-0有25%的主根根尖发生死亡；当PEG浓度达到50%时，Col-0全部主根根尖都已死亡，Ws的的幼苗主根根尖有86%发生死亡。Ws对PEG抑制主根生长及引起死亡发生的作用的抗性要强于Col。对50%PEG处理的Col-0的幼苗主根根尖死亡情况的分析可知，死亡的高峰期在第二天，有70%的主根根尖发生了死亡。经过TUNEL和DNA ladder检测发现这种死亡是PCD，在1.5天PCD的发生的反应最强烈。

在PEG胁迫后恢复时，也可诱导主根根尖产生PCD，且表现得比接受干旱胁迫敏感。在40%PEG处理时其死亡率仅为25%，而恢复后其死亡率增加到87%；将50%PEG处理1天还未死亡幼苗进行恢复，8小时后主根根尖全部发生死亡。侧生根产生的位置与开始受胁迫浓度有关，浓度越高其离根尖最近的侧根发生位置越远离根尖。经过40%PEG处理的幼苗在恢复时，离根尖最近的侧根发生的位置有82%集中于0-1/2（侧根到根尖的距离/主根长），其余的幼苗离根尖最近侧根发生位置介于1/2-3/4之间。而将50%PEG处理的幼苗在恢复时，离根尖最近的侧根发生的位置集中于3/4-1，剩下的发生位置介于1/2-3/4之间。长时间的干旱对拟南芥的恢复不利：50%PEG处理Col-0幼苗的时间长于15天后，在恢复时植株将会死亡，但是在50%PEG处理60天时幼苗仍然没有死亡。

拟南芥PEG胁迫处理：以拟南芥ATHK1基因T-DNA插入所产生的缺失突变体和野生型WS(Wassilewskija)生态型为材料，分析了它们在生理和基因表达方面的差异。结果表明突变体的离体叶片失水率明显大于野生型；在30％PEG-6000胁迫后，野生型和ATHK1突变体的细胞膜离子外渗率比胁迫前分别增加了50％和80％。PEG胁迫48h时突变体的萎蔫程度明显大于野生型WS。以上结果说明ATHK1突变体的抗渗透胁迫能力低于野生型，即ATHK1基因参与了拟南芥适应逆境的调节反应（ATHK1基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程）

PEG胁迫处理：种子萌发期筛时用滤纸，按培养皿直径裁剪，滤纸直径比其略小，每皿放2张；苗期筛选用纱布，用大培养皿( 培养皿底直径1 2 C m) ，将纱布按照培养皿底裁剪，比其直径略小裁剪好的滤纸和纱布平铺到培养皿中，连同镊子、小量筒一起用高温蒸气灭菌( 1 2 1 ℃，3 O 分钟) ，。P E G为P E G一8 0 0 0( 日本进口分装，北京鼎国公司出品) ，

其浓度根据不同筛选时期进行选择。实验的种子用50％漂白水表面消毒5min ，再用无菌水漂洗4-5次。萌发期筛选时，种子直接播种到滤纸上；苗期筛选则将种子直接播种到铺有纱布的MS( S i g ma ) 培养基( Ms + 2 ％蔗糖+1％琼脂，p H 5.7 0 ) 上。播种后于暗下以4 ℃低温处理4 8 h，放入培养室[ ( 2 l 士2 ) ℃，日光灯光强5 0 l a E ．m- 2 ．s ，1 4 h光照/1 0 h黑暗，相对湿度70％]中培养。

种子萌发期条件的确定在超净台上，将经过高温消毒后的0 ％、5％、l0％、15％、2 0％、2 5％PEG水溶液，用量筒各取7 mL充分浸润2层滤纸，再将经消毒过的拟南芥种子点播在滤纸上，封口，于暗中以4℃低温处理2d ，然后放到培养室生长5d，观察萌发及其他表型，统计相关数据。

苗期条件的确定将消毒后尚未凝固的MS培养液24mL直接倒入铺有纱布的培养皿中，凝固后播种。于低温下放置2d ，再放入培养室生长7d，用镊子轻轻夹起纱布一侧，将l2 mL 0％，10％、20％、30％的P E G溶液沿培养皿边缘缓缓倒入培养皿中，放下纱布并转动培养皿，以使PEG溶液均匀分布，封口后放入培养室中，每天观察，确定这一时期用于突变体筛选的指标。平皿中鉴定

结果：拟南芥Col播种在经水浸润的滤纸上，4d后萌发率为100％，随着PEG浓度的升高，萌发率逐渐降低。PEG的浓度为20％时，萌发率降至7.3％：PEG浓度升高到25％时

萌发率为零。可见，PEG对Col种子萌发的抑制对剂量是依赖的。因此，我们遂以25％的PEG下种子以是否萌发为指标，进行筛选( 图l 和2 )

经PEG处理5d的拟南芥幼苗主根伸长受抑制,，拟南芥幼苗主根的伸长生长在5％PEG溶液中极显著地被抑制，10％以上P E G中主根伸长生长则完全受抑制。据此，我们即以在此种浓度下主根是否伸长为筛选指标，并筛选到一部分在5％PEG下主根明显能生长的拟南芥突变体.将拟南芥生态型Co1种子播种到铺有纱布的培养皿中，在正常的MS培养基上生长7 d后施加不同浓度的P E G溶液，定时观察拟南芥苗的存活率，确定选用的浓度和时间。结果，在30％PEG中处理4d后的拟南芥生态型Col苗变白,萎蔫，其存活率为0。据此，我们即用30％PEG作为筛选浓度.

土中鉴定：将种子表面消毒后播种在MS培养基上,置于4°冰箱中避光春化4d后转入光照培养,光照强度为1 6 0umol photons m-2s-1,光周期为16 /8h (昼/夜) ,培养温度为23°,湿度为