细胞工程(一)(1)

细胞工程(一)(1)
细胞工程（一）
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一、细胞工程概述
（一）细胞工程的定义 （二）细胞工程分类和研究对象 （三）细胞的主要培养技术
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（一）细胞工程的定义
➢ 细胞工程是在细胞水平上的工程，它应用 细胞生物学和分子生物学的方法，以细胞 和细胞器为对象进行操作，在体外条件下 进行培养、繁殖，或人为的使细胞某些生 物学特性按人们的意愿发生改变，最终获 得人们所需要的组织、细胞或个体。 （P51）
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（二）细胞工程分类和研究对象
A、根据研究对象划分 动物细胞工程 植物细胞工程 微生物细胞工程
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B、根据研究水平来划分 组织水平 细胞水平 细胞器水平 基因水平
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C、根据实验操作对象可分为： 细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植 染色体操作 转基因生物等
三、转基因动物
转基因动物：是人类按照自己的意愿， 借助基因工程技术将外源基因导入受体动 物细胞染色体内，有目的、有计划、有根 据、有预见地改变动物的遗传组成，使得 外源基因与受体细胞整合、在体内稳定表 达并能稳定遗传给后代的动物。
细胞工程(一教)(1)材：P57～61
【羊城晚报】报道
英国一电视台在一节目中披露一：绵羊长着人心脏、山羊会吐蜘蛛丝、奶 牛尺寸是普通牛的3倍大，而猪则会在黑暗中发光！
当抗原，即某些外源生物（细菌等）或 生物大分子（蛋白质）等进入动物或人体 后，会刺激后者形成相应的抗体，抗原与 抗体之间是特异结合的，所以抗体种类有 百万种之多。抗体一般是有Ｂ淋巴细胞分 泌，每一种B淋巴细胞分泌一种针对性的 抗体，显然如果需要从某一种专一抗体， 需要首先从某个特定的B淋巴细胞培养大 量细胞克隆，然后体外培养。而B淋巴细 胞不能无限繁殖。需要新的技术
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2.转基因动物的应用
利用动物产生有益蛋白：如利用转基因技术，让羊乳汁分 泌人凝血因子、让牛分泌人乳铁蛋白和让猪分泌人血红 蛋白。
这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献 在于： ① 证明了动物细胞仍然具有全能性； ② 初步建立了体细胞核移植的实验体系， ③ 卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用
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2、动物细胞工程的应用 ❖ 动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体） ❖ 新品种培育 ❖ 试管动物与婴儿 ❖ 组织工程 ❖ 珍稀动植物资源的保存与保护
据悉，这一电视秀系列将由英国电视记者和生物学家奥利维娅·朱德恩主 持，朱德恩是转基因实验的支持者，她和许多科学家都相信转基因食品将是解 决全球饥饿问题的万能药，和战胜人类疾病的关键武器。
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（二）、转基因动物构建方法
1）显微注射法：利用纤维 操作技术系统和显微注 射技术将外源基因直接 注入实验动物的受精卵 原核，使外源基因整合 到动物基因组，再通过 胚胎移植技术将整合有 外源基因的受精卵移植 到受体的子宫内继续发 育，进而得到转基因动 物。
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3）、细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年, Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。 60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。 1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的
融合在一起。 ③ 筛选、克隆杂合细胞：通过选择性培养基，使得
杂合细胞生长而非融合细胞不能生长，并进一步 筛选和克隆杂合细胞，从而获得具有双亲遗传特 性的杂合细胞。
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4）细胞融合途径 ① 灭活病毒诱导：融合率较低，重复性不够高 ② 化学诱导融合：用聚乙二醇（PEG）介导 ③ 电融合：将悬浮细胞在低压交流电场（100～
细胞工程(一)教(1) 材：P53～56
二、动物细胞工程
（一）、动物细胞研究历史进展和应用 （二）、哺乳动物细胞培养 （三）、动物细胞融合和单细胞克隆等技术
简介
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（一）动物细胞研究历史进展和应用
1、动物细胞工程发展历史 1）、细胞融合现象的发现
19世纪30年代到50年代，Muller 等相继在肺结核、天花 等病理组织中和正常组织中（如骨髓和肺等）观察到多核 细胞现象；到1959年，自然界中广泛存在着多核细胞的事 实，才被接受。 2）、动物细胞培养技术的建立
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2）逆转录病毒感染法：用逆转录病毒作为载体 去感染受精卵（不适合显微操作)，反转录病 毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞的死亡， 被它感染或转化的动物细胞常可持续许多世代。
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3) 胚胎干细胞：胚胎干细胞(embryonic stem cell， ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分 离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发 育的多能性，能够分化出各种组织。这个途径是 将外源基因直接导人ES细胞，经体外培养筛选 后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚 集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。 由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其 中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体 ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化 而成的生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传 递下去。
据报道，英国第四频道将在一个富有争议的电视秀中揭开一个转基因动物 农场中的惊人内幕，这个电视秀将披露许多通过转基因技术、克隆技术和细胞 更改技术饲养出来的古怪动物。其中包括长着人类心脏的绵羊、会吐蜘蛛丝的 山羊、在夜晚身体会发光的猪、以及尺寸是普通奶牛三倍大的“施瓦辛格”奶 牛。研究转基因动物的科学家们甚至还通过高科技技术，单独培育出了一个人 的鼻子组织。
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2020/11/30
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举例：干扰素（IFN）是人体细胞分泌的一 种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿 瘤和免疫调节活性。早期的干扰素是用病 毒诱导人体白血球或白细胞产生的，其产 量低、价格昂贵。现在可以利用基因工程 生产干扰素。
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小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细 胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力， 并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。
4）、动物克隆技术的建立 1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种
或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％ 的重组卵发育成为成熟蛙。
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1975年，Milstein和 Kohler利用肿瘤细胞 无限增殖的分生的特 征，将B细胞与之融 合,获得了既能产生单 一抗体又能体外无限 生长的杂合细胞。
1984年，二人获得诺贝 尔生理学与医学奖。
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❖ 单克隆技术也可用来 构建连续细胞
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致死细胞：能在体外生存和增殖，但不能连续传代，往 往分裂几代或几十代后就会死亡。大多数细胞属于这 类细胞。
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2、培养过程
1）动物细胞分离和传代培养过程 A 获得原代细胞 原代培养：从特定功能组织器官中分离后，
无法Leabharlann Baidu殖或处于稳定传代培养前动物细胞， 又叫初代细胞。 获得原代细胞是一系列细胞培养的第一步
血清的缺陷，目前开发无血清培养基是细胞培养 的主要方向。
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3 动物细胞培养方法
动物细胞的离体培养方法有两种方式： 1）贴壁培养：贴附在比表面积较大的微载
体上或直接贴附在反应器器壁上， A 对象：大多数原代细胞 Ｂ贴壁基质要求：要求是单层膜和正电荷；
通常是用玻璃或一次性塑料 C 实验室培养：多空板培养皿和培养瓶等小
200v/cm）中聚集成串珠状细胞群，或将培养 细胞形成单层接触，然后加高压电脉冲（1～ 1.8kv/cm, 脉冲宽0～100μs），导致胞间细胞 质沟通，造成细胞融合。其优点有：效率高； 杂交频率高，为PEG法的100倍；操作方便， 对细胞无毒害作用；可在显微镜下操作
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2 单克隆抗体技术
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（二）、哺乳动物细胞培养
1、培养对象细胞和性质 v 培养对象：哺乳动物细胞和昆虫动物细胞 v 哺乳动物细胞种类与性质 根据细胞的寿命，分为
非致死细胞：在体外培养基中不断增殖，数目以指数式 形式增加，当细胞密度达到一定程度时，细胞停止分 裂，不再生长。但当被放到新鲜培养基中，细胞重新 生长。这样可以连续传代。这种细胞包括癌细胞、表 皮细胞和成纤维细胞。
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（三）细胞的主要培养技术
1、无菌操作技术 2、细胞培养技术：指生物细胞和组织在体外无菌条
件下和适当的温度、气体和营养环境中的保存、生 长和增殖。是细胞工程的最基本技术。 3、细胞融合技术：是指在离体条件下，用人工方法 将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无 性方式融合为一个杂合细胞的技术。包括病毒融合、 化学融合、和电融合 4、细胞核移植技术：利用显微操作技术将细胞核与 细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形 成杂种细胞。
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获得原代细胞的步骤： 解剖分离 培养液淋洗和切成碎片 再淋洗 酶法分离成单个细胞 离心分离后再培养
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B 连续化培养
v 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形 式增殖，当超过有限世代后，它们可能有 两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永 久细胞系或称连续细胞系。
v 适应在体外培养条件下持续传代培养的细 胞称为传代细胞。
1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观 察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为 是动物细胞培养开始的标志；
1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长 促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。
1914年，Thomson建立了器官培养技术。 1940年，1951年，Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔 组织细胞系的L系和人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系。
❖ 一般情况下，非致死细胞可直接转化为连 续细胞，可以连续增殖；而其他细胞需要 经过环境适应（如啮齿动物细胞）、杂交 或基因修饰才能转化为连续细胞。
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细胞系：经过原代培养，细胞逐渐形成具有 相似生理即代谢特性的稳定细胞系，可供 繁殖和多次传代培养。一旦原代细胞进行 了传代培养即成为细胞系。
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4）精子载体法：将外源基因与精子共同培 养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将 外源基因导入成熟的精子，使精子携带的 外源DNA进入卵中并受精，从而使外源 DNA整合到染色体中。再利用人工受精过 程产生转基因动物
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5）体细胞移植法：以动物细胞（包括动物 成体体细胞、胎体成纤维细胞等）为受体， 将目的基因导入能传代培养的动物体细胞， 再以这些动物体细胞为核供体，进行动物 克隆。
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用 单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单 细胞增殖形成的细胞群，称细胞株 。细胞 株具有特殊的表型性质。
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2）动物细胞培养的环境特性 A 生物特性 具有精细分工、职能专一的
细胞器 能够进行蛋白质翻译后的修
饰。
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B 营养要求 开始的培养基主要是全血清培养基，但由于
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（四）、动物细胞融合和单细胞克 隆等技术简介
1 细胞融合技术 1）、定义 细胞融合：两个或多个细胞融合成一个双核或多核
细胞的现象 2）分类 同源融合细胞：基因型相同的细胞形成的融合细胞。 异源融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞。
细胞教工材程(：一)P(16) 1～68
3）、技术过程 ① 原生质体制备: 主要针对植物细胞和微生物细胞 ② 诱导细胞融合：可以通过三种途径诱导两种细胞
容器
比表面积：单位质量物质的表面积（㎡/g）
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2）悬浮培养：直接培养于培养基中，不需 要任何贴附表面，可在同期搅拌罐中培养。
A 培养对象：极少数原代细胞适合悬浮培养， 仅有造血细胞系、啮齿类的腹水和小细胞 肺癌。而大规模的动物细胞培养往往是从 适应悬浮培养开始的。
B 培养方式： 实验室：采用小摇瓶和小转瓶形式 工业化生产（大规模培养）：通气搅拌罐