考马斯亮蓝法测蛋白质含量

作业指导书

标题：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的检验方法

修改记录

1．目的

1.学习一种蛋白质染色测定的方法

2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法

2．适用范围

组织中的蛋白质测定。

3．职责

3.1 检测人员按照本作业指导书进行该项试验，作好试验记录。

3.2 审核人员负责试验的审核，保证试验的准确性和科学性。

3.3 科室负责人负责监督试验指导书的执行。

4．正文

4.1 试验原理

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm 处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg 蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。

4.2 材料、试剂与器具

（一）试剂

1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。

2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。

3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml

（二）器具

1、试管及试管架

2、移液管（1ml,5ml）

3、可见光分光光度计

4.3 试验操作步骤

（一）标准曲线的制作

1、取7只试管，按下表加入试剂

2、将试管摇匀，放置20分钟。

3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。

4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（二）样品测定

1、取一只试管加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ML，蒸馏水0.8ML，考马斯亮蓝5ML。

2、将试管摇匀放置20分钟。

3、比色测定吸光值A595nm，考马斯亮蓝试剂调零。

4.5 注意事项

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。