碱性强弱染色非变性聚丙烯酰胺凝胶对微卫星DNA检测效果的影响

第 ３期
汪 虹英 ： 碱性强弱 染色非变性聚丙烯酰胺 凝胶对微卫星 Ｄ Ａ检测 效果 的影 响 Ｎ
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（ Ｐ 为催 化 剂 ， 四 甲基 乙 二 胺 （ Ｅ Ｄ） 加 速 Ａ） 以 Ｔ ＭＥ 为
式 反应 ） 方法 从 黄 牛基 因组 Ｄ Ａ 扩增 Ｉ Ｒ ２ Ｎ Ｎ Ａ １４微 卫 星 ， ８个黄 牛个 体 的基 因组 Ｄ Ａ作模 板 。Ｐ Ｒ 用 Ｎ Ｃ 扩 增 的 反应 体 系 的总 体 积 为 ｌ ５ ， 中１ 其 ０×Ｐ Ｒ Ｃ ｂ ｆ ｒ ． ．， “态 （ ５ｍ ｌＬ ０ ９ｐ ， Ｎ Ｐ ｕ ｅ ５ｐ Ｍｇ ｆ １ Ｌ ２ ｍｏ ） ． ． ｄ Ｔ ｓ ／ Ｌ （ ０ｍｍ ｌＬ １ ５ ｔ ， 板 Ｄ Ａ （ ０ ｎ ／ ， ． １ ｏ ） ． ｘ 模 ／ Ｌ Ｎ ２ ｇｐ Ｌ）１ ２ Ｌ， 下游 引物 （ ０ｐ ｏ Ｌ 上 １ ｍ ｌ ）各 ０ ７ Ｌ Ｔ ｑＤ Ａ ／ ． ５ ， ａ Ｎ
Ｋ ｅ ｗｏ ｄ ｙ ｒ ｓ：Ａｌ ｌ ｅ ｖｒ ｎ ｅ ｔ ｋａｉ ｎ ｉｏ ｍ ｎ ；Ｎａｉｅ ｐ ｌ ａ ｒ ｌ ｍｉ ｅ ｇ ｌｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ；Ｍ ｉｒ ｓ ｔ ｌ ｔ ｔｖ ｏｙ ｃ ｙａ ｄ ｅ ｌ ｃｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ｃｏ ａｅｌ ｅ ＤＮＡ ｉ
聚丙 烯 酰 胺凝 胶 电泳 简 称 为 Ｐ Ｇ （ ｏ ａｒｌ Ａ Ｅ ｐｌ ｃｙ ｙ — ａ ｉｅｇｌ ｌｅ ｏ ｈ ｒｓ ） 是 以聚丙烯 酰胺 凝胶作 为 ｍ ｄ ｅ ｅ ｔ ｐ ｏｅｉ ， ｅ ｒ ｓ 支 持介 质 的一 种常用 电泳 技术 。聚丙 烯酰胺 凝胶 由
收 稿 日期 ：０ １— ５—１ ２１ ０ ６
单体 丙烯 酰胺 和 甲叉 双 丙 烯 酰胺 聚 合 而成 ， 聚合 过 程 由 自由基 催 化 完 成 。催 化 聚合 的 常用 方 法 有 两 种 ： 学聚合 法 和光 聚 合 法 。化学 聚合 以过 硫 酸 铵 化
基 金 项 目： 四川 省 教 育 厅 重 点项 目（ ８ Ａ １ ） 助 。 ０Ｚ ００ 资 作 者 简 介 ： 英 （９ ５ ） 女 ， 教 ， 汪虹 １７ 一 ， 助 主要 从 事 有 机 化 学 与生 物 化 学 的 研 究 。 Ｅ—ｍａ ：ａ曲 Ｏｇｉｓ８６ １６ ｃｒ。 ｉ ｗ ｎ ｎｙｎｏ １ ＠ ２ ．ｏ ｌ ｎ
ｂ ｎ ｆｅｆｃ ｉｅ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｉ ｌ ｔ ｃ ｏ ａｅｌ ｅ ＤＮＡ． Ｉ ｈ ｓ ｗ ｒ ｅ ｏ ｅ ｏ ｆ ｔ ｔ ｏ ｓｔ ｓ ａｅ ｍｉｒ ｓ ｔ ｌ ｔ ｅ ｖ ｏ ｉ ｎ ｔ ｉ ｏ ｋ．ｍｉｒ ｓ ｔｌ ｔ ｃｏ ａｅｌ ｅ ＤＮＡ ｏ ａｔ ａ ｉ ｆｃ ｔ ｅ ｗ ｓ ｌ
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Ｍｉｎａ ｇ６ １ １ ，Ｓ ｈ ａ ， ｈｎ ） ａｙ ｎ ２ ０ ０ ｉ ｕ ｎ Ｃ ｉａ ｃ Ａｂｔａ ｔ Ｎ ｔ ｅｐ ｌ ｃｙ ｍｉｅｇｌ ｌｃ ｏ ｈｒｓ Ｐ Ｇ ）ｉ ｕｅ ｏ ｔ ｓｃ ｉ ｏｉ ｌ ａ ｒ ｏ— ｓｒｃ ： ａ ｖ ｏｙ ｒｌ ｄ ｅ ｅ ｔ ｐ ｏｅｉ Ａ Ｅ ｓ ｓｄｔ ｉ ｌ ｅ ｕ ｈｂｏ ｇ ａ ｍ ｃｏ ｌ ｉ ａ ａ ｅ ｒ ｓ（ ｏｓａ ｌ ｃ ｍ
Ｐ ＡＧＥ ｉ ｃ ｍｐｅ ｎ ｉ －ｏ ｓ ｍｉｇ ｈ ｒｆｒ ，ｔｉ ｍｅｈ ｄ ｗｉ ｐ ｌ ｏ ｔｅ ｓｎ ｉｖ ｅｅ ｔ ｎ ｏ ｓ ｏ ｌｘ ａ ｄ ｔ ｍｅ ｃ ｎ ｕ ｎ ．Ｔ ｅｅｏｅ ｈｓ ｔｏ ｌ ａ ｐｙ ｔ ｈ ｅ ｓｔ ｅ ｄ ｔｃｉ ｆ ｌ ｉ ｏ
第２ ６卷 第 ３期 ２１ ０ １年 ９月
西
南
科
技
大
学
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
学
报
Ｖ０． ６ Ｎｏ ３ １２ ． Ｓ ｐ． ｅ ２０１ １
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＳ ｕ ｈ ｓ ｉ ｅｓｔ ｆＳ ｉ ｎ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｏ ｒ ａ ｏ ｔ ｗｅ ｔ ｏ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ ｏ ｃ ｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｙ
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碱 性 强 弱染 色非 变 性 聚丙 烯 酰胺 凝胶 对 微 卫 星 Ｄ Ａ检 测 效 果 的影 响 Ｎ
汪 虹 英
（ 西南科技 大学材 料科学与工程学院 四川绵 阳 ６ １ １ ） ２０ ０
摘要 ： 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于分离不同分子质量和空间构象的 Ｄ Ａ或 Ｒ Ａ等生物大分子 ， Ｎ Ｎ 由于分辨率
Ｗ ＡＮＧ ｎ — ｉ ｇ Ｈｏ ｇ ｙ ｎ （ ｃｏｌｆＭａｅ ａｓ ｃ ｎｅａｄＥ ｇｎｅ ｎ Ｓｕｈ ｅ ｎｖｒｔ ｃ ｎｅａｄ Ｔｃｎ ｌ ｙ Ｓｈｏ ｏ ｔｉｌ Ｓｉ ｃ ｎ ｎ ｉ ｒ ｇ， ｏｔｗ ｓ Ｕ ｉ ｓｙｏ ｉ ｎ ｅｈ ｏ ｇ ， ｒ ｅ ｅｉ ｔ ｅ ｉ ｆＳｅ ｃ ｏ
品的检测。 关 键 词 ： 性 环境 碱 非变性聚丙烯酰胺凝胶 微卫星 Ｄ Ａ Ｎ
中图分 类号 ： ７ Ｑ８
文献标志码 ： Ａ
文章编号 ：６ １ ７ ５ ２ １ ） ３— ０ ４— ４ １７ —８５ （ ０ １ ０ ０ ８ ０
Ｄｅｅ ｔｎｇ ｏ ｉｒ ｓ ｔｌ ｔ ｔｃ ｉ ｆＭ ｃ ｏ ａ ｅｌ ｅＤＮＡ ｙ Ｎａ ｉ ｅ ＰＡＧＥ ａ ｎ ｄ ｉ ｂ ｔｖ Ｓｔ ｉ ｅ ｉ Ｓ ｒ ｎ ｒ Ｗ ｅ ｋ Ａｌ ａ ｉＳ ｌ ｔｏ ｎ ｔ ｏ ｇ ｏ ａ ｋ ｌ ｏ ｕ ｉｎ
剂 。在 聚合 过程 中 ，Ｅ Ｄ催化 过硫 酸 铵产 生 自由 Ｔ ＭＥ
基， 后者 引发 丙烯 酰胺 单 体聚 合 ， 同时 甲叉 双丙 烯 酰 胺 与丙烯 酰胺 链 间 产 生 甲叉 键 交 联 ， 而形 成 三 维 从 网状结 构 ］ 。在连 续 系统 Ｐ Ｇ Ａ Ｅ电泳 体 系 中缓 冲液 ｐ Ｈ值及凝 胶浓 度 相 同 ， 电颗 粒在 电 场作用 下 主要 带 通 过 电荷 和分子筛 效 应 而被 分离 。
４ ）１ｃｃ ＋ ９ ０Ｓ ｙｌ （３℃ ４ ， ５℃ ４ ， ２℃ ４ ） ｅ＿ ０Ｓ ５ ０ｓ ７ ０ｓ
２ ｙｌ －７ ｉ ｑ ０ｃｃ ｓ－ ２ｑ ５ｍｎ ｅ ￣ Ｃ — Ｃ保存。 １２ 强 碱性 染色 非变 性聚 丙烯 酰胺 凝胶 ．
每 头黄 牛个 体 在 ＩＲ ２ 卫 星 位 点 的 Ｐ Ｒ Ｎ Ａ １４微 Ｃ
ｃ ｎ ｅ ｉｎ ．Ｔｈ ｒ ｆｒ ｏ ｖ ｎｅ ｔ ｅ ｅｏ ｅ，ｔ ｉ ｔ ｏ ｌ ａ ｌ ｏ ｔ ｅ ｄ ｔ ｃｉｎ ｏ ｈ ｓｍｅｈ ｄ ｗｉ ｐｐｙ ｔ ｈ ｅｅ ｔｏ ｆＤＮＡ ａ ｌｓ ｗｉｈ ｌ ｒ ｅ ｑ ａ ｉ ｅ ． ｌ ｓ ｍｐ ｅ ｔ ａ ｇ ｕ ｎｔ ｉ ｓ ｔ
ｅ ｕｅ ｓＤＮＡ ｒＲＮＡ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｄ ｆｅｅ ｃ ｓｏ ｅ ｒｍｏ ｅ ｕ ａ ｉｈ ｎ ｐ ｔａ ｏ ｆｇ ｒ ｔ ｎ．Ａｓｔ ｅ ｃ ｌｓａ ｏ ｂ ｓ ｄ ｏ ｈ ｉｆｒ ｎ ｅ ｆｔ ｉ ｌｃ ｌ ｒｗｅ ｇ ｔａ ｄ ｓ ａｉ ｌｃ ｎ ｉｕ ａ ｉ ｈ ｏ ｈ
酰胺凝 胶 中 的 微 卫 星 Ｄ Ａ 一 般 通 过 硝 酸 银 （ ｇ Ｎ Ａ—
Ｎ 染色 ， Ｏ） 由固定 、 氧化 、 色 、 染 显影 、 止 等 步 骤 组 终
Ｐ Ｒ扩增 条 件 ：３℃ ３ｍｉ （ ３℃ ４ ， ５℃ ４ Ｃ ９ ｎ ９ 一 ０Ｓ ６ ０ ｓ７ ， ２℃ ４ ）１ｃｃ － （ ３℃ ４ ， ４ ５ ｏ ０Ｓ ０ｓ ｙｌ ＋ ９ ｅ ０ｓ ６ ． ４ ， Ｃ ７ 二４ ）１ｃｃ — ９ ２ｃ ０Ｓ ｙｌ （ ３℃ ４ ， ３℃ ４ ， ２℃ Ｉ ｅ ０Ｓ ６ ０Ｓ ７
ｎ ｌ ｉ ｃｄ ｉ ｅｇ ｎ ｒ ｍ ｗｏ ｂ ｓ ａｒ ｏ ｌ ｅ ｉｏ ａｅ ｙ ｔ ｉ ｉ ｄ ｏ ｌ ｃｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ｕｃｅｃ ａ ｉ ｓｄ ｖ ｒ ｅ ｔｆｏ ｔ ａ ｅ ｐ ｉｓｃ ｕ ｄ ｂ ｓ ｌｔ ｄ ｂ ｝ ｓｋ ｎ ｆｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ．ＰＡＧＥ ｈ ｕ ｄ ｌ ｓ ｏ ｌ
ＤＮＡ ａ ｓ ｍｐｌｓｗｉｈ ｓ ｌ ｑ ａ ｔｔ ｓ Ｉ ｈｅ ｓｒ ｎ ｌ ａｉｓ ｌｔｏ ｅ ｔ ｍａｌ ｕ ｎ ｉ ｅ ． ｎ ｔ ｔｏ ｇ ａｋ ｌ ｏｕ ｉ ｎ，ｔ ｅ ｓ ｎ ｉ ｖ ｎ ｓ ｆＰ ｉ ｈ ｅ ｓｔ ｅ ｅ ｓｏ ＡＧＥ ｉ ｏ ａ ａ ｉ ｓ ｃ ｍｐ ｒ —
可以达到 ２个碱基对 ， 因此非变性聚丙烯酰胺凝胶对于微卫 星 Ｄ Ａ有很好 的检测效果 。利用非变性聚丙烯酰胺凝 Ｎ
胶 电泳对黄牛微卫 星 Ｄ Ａ的检测表 明： Ｎ 碱性强弱的控 制对 于染 色的效果 和效率有显著 的影响 。弱碱性 环境下 ， 具
有背景浅 、 条带明显和检测灵敏 度高的优势 ， 但是染色过程较复杂繁琐 ， 适合 于少 量样 品的精细检测 ； 在强碱性环境 下， 对于微卫星 Ｄ Ａ的灵 敏度相对 弱碱性环境下降低 ， Ｎ 但是染 色过程简便 、 快捷且成 本相对较低 ， 适合 于大规模样
聚合 酶 （ ／ ）０ ３ ．， 纯 灭 菌水 ８０ ５Ｕ ．６ｐ 超 Ｌ ．４
；
微卫 星 Ｄ Ａ是真 核生 物基 因组 中 由 １— Ｎ ５个 核 苷酸 为重 复单位 组 成 的 串联 重 复 序列 ， 复 次 数 为 重 ｌ Ｏ～２ 。 由于 不 同生 物 个 体 在 基 因组 特 定 位 点 ０次 微卫 星重 复次数 的不 同以及 重复 程度 的不 完全 而 导 致个 体 的微卫 星 Ｄ Ａ具 有 不 同 的长 度 Ｊ Ｎ 。在 非 变 性 ＰＧ Ａ Ｅ电泳条 件 下 ， 复 次 数 或 长 度不 同 的 微 卫 重 星 Ｄ Ａ分子 由于具有 不 同 的迁 移 率而 被分 离 ， 而 Ｎ 从 显示 出不 同个体 之 间 的多态 性 。电泳 结束 后 聚丙 烯