多糖提取实验设计流程【复习准备】

食用菌多糖的提取方法有水提法、碱提法和酶提法等，其中酶提法是利用酶对细胞结构的破坏作用，使存在于细胞内部的多糖释放出来，从而提高了多糖的得率。

本次实验采用纤维素酶和果胶酶对紫蘑菇进行水解，研究香菇多糖的最佳提取工艺，并探讨蘑菇粒度、蘑菇溶解方法以及酶法提取中多糖提取效果的评价方法。

可以同步做三组对比试验：⑴采用水提，不加酶；⑵采用酶法提取；⑶采用酶空白（只加酶，不加蘑菇粉）。

由于酶中也含有少量的糖类成分，其存在将会对蘑菇多糖的提取产生影响。因此，在计算酶法提取多糖的效果时，要减去酶本身所引入的糖。在确定最佳酶浓度时更要考虑。

一、实验流程：蘑菇干燥→粉碎过筛→加水浸泡0.5h→调PH→加入纤维素酶→提取→离心过滤→测多糖提取率

式中：n一提取液稀释倍数；

C一提取液中多糖的浓度（mg/mL）；

V一提取液体积（mL）；

m一蘑菇的质量（mg）。

测定时取三个平行样，结果数据为平行样的平均数值。

二、具体实验步骤：

1、多糖标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖标准品100mg,置于100 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL分别置于50 mL 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取上述各种溶液2.0 mL,分别加入5%苯酚溶液1.0 mL,摇匀,迅速加入5.0 mL浓硫酸,振摇5min,置沸水浴上加热15 min,然后置冷水浴中冷却30 min,随行空白,在490 nm波长处测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。

（1）精密度试验:精密吸取1.0 ml供试液按“标准曲线的制备”项下操作，分别测定吸光度，求得RSD。

（2）重现性及多糖含量测定:精密称取巴西蘑菇多糖0.1000g，按“供试液

的配制”和“标准曲线的制备”项下操作，分别测定吸光度，求得多糖的平均含量，及RSD值。

2、单因素实验

（1）水提法

称取蘑菇粉末2g，加入适量水（最佳固液比为1:20），在50℃水中浸泡1h。

升温至100℃，提取2.5h。将混合物离心、浓缩、乙醇沉淀，计算多糖提取率和纯度。

单因素选择范围

提取温度(℃) 固液比(W/V) 提取时间(h)

70 1:16 1h

80 1:18 1.5h

90 1:20 2h

100 1:22 2.5h

1:24 3h

（2）酶法提取

称取蘑菇粉末2g，加入适量水（最佳固液比为1:20），在50℃水中浸泡1h。

升温至90℃，提取0.5h。冷却至40℃，加入酶浓度1%，提取液总体积为100ml，PH值5.0，酶解提取1h。然后升温至90℃提取1h灭酶。将混合物离心、浓缩、乙醇沉淀，计算多糖提取率和纯度。

单因素选择范围

酶浓度% 酶解温度℃PH值酶解时间h

0.25 30 3.5 0.5

0.5 35 4.0 1

0.75 40 4.5 2

1.0 45 5.0 3

1.25 50 5.5 4

1.5 55 6.0

实验所需药品：纤维素酶，果胶酶，葡萄糖，苯酚，浓硫酸，乙醇器材：100ml容量瓶，50ml容量瓶