孤雌激活

5.卵母细胞的孤雌激活

孤雌激活(parthenogenetic activation)是指处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞不经过精子受精作用，而在某些理化因素的刺激下继续生长发育的过程，包括恢复并完成第二次减数分裂，发生卵裂形成早期胚胎。由雌性配子经孤雌激活产生后代的生殖过程称为孤雌生殖形成的胚胎称为孤雌胚胎。

5.1.卵母细胞激活机制

在受精时，一系列的细胞内Ca2+ 多次持续波动引起MPF的失活和卵母细胞的激活(Cuthbertson and Cobbold 1995; Collas et al. 1993; Swann and Ozil 1994)。在小鼠(Miyazaki et al. 1986, 1993; Whitaker and Swann 1993; Kline 1994; Igarashi er al. 1997) 、仓鼠(Igusa and Miyazaki 1983; Miyazaki et al. 1986, 1991)和兔(Collas et al. 1995)上都证实了卵母细胞在受精时伴随有Ca2+的波动，说明Ca2+波动是启动卵母细胞周期和继续发育的前提。卵母细胞激活是以Ca2＋为第二信使，成熟促进因子(MPF)、细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、细胞静止因子(CSF)等细胞因子综合作用的结果。进行孤雌激活的卵母细胞是处于MII期的卵母细胞，其含有高活性的CSF，能维持MPF处于高活性状态，使卵母细胞处于减数分裂的中期(Rall J M 1992)。孤雌激活是通过各种物理、化学方法刺激MII期卵母细胞完成第二次减数分裂，阻止第二极体排出，形成常染色体二倍体胚胎(李裕强2001)。卵母细胞内Ca2+节律性脉冲的升高是卵母细胞完成孤雌发育不可缺少的过程(Hochi S 2000)。MII期的卵母细胞受精或人工激活后卵母细胞胞质Ca2+升高可使MPF和CSF失活或消失，从而启动成熟分裂器，促使M期卵母细胞继续第二次成熟分裂(Kline D 1988)，并形成孤雌胚胎(Swann M 1999)。MPF是一种蛋白激酶，在卵母细胞的减数分裂过程中起关键的调控作用，可促进细胞进入M期，并在M期维持高活性状态，在M期的中后期活性迅速下降直到消失，使卵母细胞活化，完成第二次成熟分裂(李裕强等1999)。不同物理或化学方法对卵母细胞激活效果不同，但其激活机理基本是一致的，同激活方法的最终目的均是要将静止在MII期的卵母细胞恢复减数分裂周期，这就要求卵母细胞内MPF和CSF的活性降低或消失。而MPF的活性是由对Ca2+非常敏感的CSF来维持，CSF的作用是抑制停滞于MII期卵母细胞内的cyclinB的降解。卵母细胞受精或人工激活后，细胞内Ca2+浓度迅速升高，使CSF的活性消失，cyclinB被降解，从而引起MPF的活性降低或消失，卵母细胞离开MII期，完成减数分裂并进行卵裂。有研究表明，抑制卵母细胞内游离Ca2+浓度的升高就会抑制卵母细胞激活的一系列反应，Ca2+浓度的升高是卵母细胞激活的重要诱导信号，但并不是诱导卵母细胞激活一定需要Ca2+浓度的脉冲升高(邓满齐等1994)。放线菌酮(CHX)是一种蛋白质合成抑制剂，通过作用于80S的核糖体来抑制肽链的转移，从而抑制蛋白质合成，己经有实验证实，CHX可使小鼠和牛的卵母细胞发生孤雌激活(Presicce G A 1994a; Bos Mikich A et al. 1995; Sun Q Y et al. 1999a; Sun Q Y et al. 1999b) 。而不能使猪(Nussbaujm DJ 1995)和中国仓鼠(Tateno H 1997)卵母细胞激活。一般认为，乙醇、电脉冲和氯化锶的刺激可以导致卵母细胞的活化，而随后CHX协同作用进一步抑制卵内新的相关蛋白质，如cyclinB、CSF的合成，使其不能产生新CSF和MPF，使MPF一直处于较低水平，进一步促进卵母细胞的活化。单独的CHX作用不能使猪IVM卵母细胞活化，说明猪卵母细胞对CHX不敏感，只有与其他刺激因素联合使用时，才能起到协同促进的作用。这也说明，CHX不是通过Ca2+波引起的卵母细胞活化，而是通过抑制有关蛋白质合成起作用。此外，6-DMAP是一种蛋白质磷酸化抑制剂。卵母细胞成熟和受精均涉及到多种蛋白质磷酸化状态的改变。6-DMAP对卵母细胞的激活作用主要是维持P34cdc2的磷酸化和抑制cyclinB的磷酸化使MPF活性下降。同时还可以抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化抑制极体的排出。但6-DMAP单独使用对卵母细胞的激活作用较弱，一般要与适度的能引起Ca2+波动的其他激活因子协同作用方可使卵母细胞充分激活(刘贞伟2004)。

近年来多用Ionomycin联合6-DMAP进行卵母细胞的孤雌激活，Ionomycin是一种高效Ca2+载体，它不能直接加速Ca2+的跨膜转运，而是动员细胞Ca2+释放，依次触发后期Ca2+内流(Morgan and Jacob 1994)，引起细胞内Ca2+浓度升高和卵母细胞激活(Jones et al. 1995)。

5.2卵母细胞孤雌激活方法

卵母细胞的孤雌激活方法分为三类：物理激活法，化学激活法和物理与化学联合激活。物理激活法又包括温度刺激、机械刺激、电刺激等。化学激活法有钙离子载体(A23187, lonomycin)、二价阳离子(SrCl2、CaCl2等)、乙醇、酶类(链酶蛋白酶、透明质酸酶等)，蛋白质合成抑制剂、蛋白质磷酸化抑制剂和麻醉剂等。物理与化学联合激活法有电脉冲、温度与乙醇、蛋白质合成抑制剂、蛋白质磷酸化抑制剂等结合使用(Jiang et al. 2002; Otoi et al. 2002; 陈呢喃等2010) 。在用乙醇、A23187、lonomycin、IP3激活卵母细胞以及核移植胚时，配合6-DMAP可以得到较高的激活率(Presicce et al. 1994)。6-DMAP对DNA的合成没有抑制作用(Ledda et al. 1996; Loi et al. 1996)，其单独使用对卵母细胞的激活作用较弱，一般要与可以引起Ca2+波动的其他激活因子协同作用才能使卵母细胞达到充分激活(Presicce et al. 1994; Booth et al. 1999)。目前，多种激活方法联合使用取得了较好的激活效果。Tateno和Kamiguchi利用5种化学介质如乙醇、氯化锶、CHX、PMA(PKC激活剂)和钙离了载体A23187分别对中国仓鼠卵母细胞进行激活研究发现，用A23187和CHX联合使用刺激激活最有效，而单独机械刺激和酶刺激不能使其活化，在小鼠(Hagemann et al. 1995)和牛(Miyazaki et al. 1995)的卵母细胞激活中也证实了这一结果。

5.3 孤雌胚胎的体外发育

卵母细胞被激活后，如果培养条件适宜，孤雌活化卵将同受精卵一样开始卵裂和发育。小鼠、兔、牛、猪等的激活卵在体外培养条件下均可发育到囊胚(陈大元2000)。将孤雌胚与正常胚构成嵌合体后，孤雌胚可以参与机体的全程发育，可使动物发育到期(Fundele at al. 1989)。Konoetal (2004)得到了孤雌小鼠性成熟后与雄性小鼠交配的后代。早期胚胎的体外培养比较复杂，培养液成分、培养温度、气相、湿度、pH、渗透压、离子浓度、能量来源、血清成分、光、水质和培养皿等都会对其有一定影响。不同种动物的早期胚胎代谢具有一定的差异性，而培养液的成分又极为复杂，这可能是造成各种胚胎培养基差异的原因。在培养液中添加尿嘧啶和三价因子能够促进颗粒细胞的增殖，提高牛卵母细胞的成熟率、卵裂率及8～16细胞率；ATP对牛卵母细胞成熟率影响不大，但能提高孤雌激活胚胎发育能力(王洪峰2006)。在培养液中添加血清及细胞因子可以提高体外孤雌胚的发育能力(田长永等2010; 许丹宁等2010)，体外培养时间和培养系统对山羊卵母细胞的孤雌激活及发育具有显著的影响(张果平等2009)。有研究表明CNP同时与许多种生殖过程有关，包括胚胎和胎儿的发育。在啮齿动物发情周期中，CNP和它的受体在子宫和卵巢有很高的表达量。在妊娠期，CNP mRNA在小鼠胚胎中可以检测到，并且表现出器官特异性表达，在雌性生殖组织胎盘中有高浓度的表达(T Waltherand H Stepan 2004)。CNP在生殖和胎儿发育过程中的生物作用有大量提示：(1)在成年鼠，子宫与卵巢中CNP基因的表达量最高(Stepan et al. 2000a)；(2) 至少在小鼠子宫内，雌二醇能够诱导CNP的表达(Acuff et al. 1997)；(3) CNP与它的受体在大鼠胎盘表达(Cameron et al. 1996)并且在卵巢和子宫中受发情周期的调控，且在发情期前期表达量最高(Dos Reis et al. 1995; Huang et al. 1996) ；(4)在人类生殖组织，病理性的怀孕像宫内胎儿生长迟缓会改变CNP的表达(Stepan et al. 2002a)。但是，在体外用添加了CNP的培养液培养卵母细胞后，对其胚胎发育有无影响尚不清楚。