【控制菌检查方法验证操作规程】控制菌有哪些
控制菌检查(彩片)-仅供参考
取 规 定 量 供 试 液 ， 自 然 沉 降 5min ， 取 上 层 液 于 100ml增菌液中。 本法适用于难溶于水的抗菌制剂。
五、增菌培养
1、增菌培养基： 胆盐乳糖培养基 （BL） 分装成100ml / 瓶
121℃高压灭菌20min备用。
（药品中污染的控制菌数量少、分布不均，且多受药物 影响呈亚致死状态，适宜的增菌培养方法和高灵敏度 的培养基是提高阳性检出率的关键。）
1、供试品MUG阳性、靛基质阳性 报告检出大肠 杆菌。
2、供试品MUG阴性、靛基质阴性 报告未检出大 肠杆菌。
3、供试品MUG阳性、靛基质阴性、或MUG阴性、 靛基质阳性，EMB平板无菌落生长判未检出大 肠杆菌。
4、供试品MUG阳性、靛基质阴性、IMViC 试验为 － ＋ － － 、革兰阴性杆菌，检出大肠杆菌。
疑似菌落 纯培养 ： 36±1℃ 18~24h
革兰染色、生化试验
36±1℃ 24~48 h
报告
三、对照用菌液的制备
药典规定的阳性对照试验是必须做的。阳性对照菌 须加入供试液中与供试品检验同时进行平行试验。
制备：临用前用接种环取大肠杆菌 [CMCC （B） 44102] 的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至灭 菌的营养肉汤培养基中（5ml / 支），36 ℃培养18 ~ 24h。（把它定为浓菌液）再按10倍系列稀释，取 1ml营养肉汤菌悬液（浓菌液），加到9ml0.9%无 菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取 10-1菌液1 ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为 10-2 …以此类推，最终稀释到含活菌数在 50 ~ 100 个/ml，同时用营养琼脂平板计数。
适用于：液体、乳剂、或通过离心可除去不溶性药 渣取其溶液的固体制剂。
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物的无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨肉汤培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖肉汤培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时。
微生物限度检查-控制菌检查法标准操作规程
微生物限度检查-控制菌检查法标准操作规程1 目的明确微生物限度检查-控制菌检查法的过程，保证产品质量。
2 适用范围检查非无菌制剂及其原、辅料等是否存在特定的微生物（如：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）, 从而判断是否符合相应的微生物限度标准。
3 定义无。
4 职责与权限检验员：按本标准判定产品质量并出具报告。
负责人：监督执行情况，审批最终结果。
5 内容及流程5.1 实验说明5.1.1 TSB为“胰酪大豆胨液体培养基”。
5.1.2 所用材料及用具（待检品、菌株除外）应经过灭菌处理；检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
5.1.3 供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
5.2 检验量从一批中随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合后，从中抽取10g或10mL。
5.3 实验材料与用具5.3.1 混合后的待检品（供试品）、TSB培养基（9mL/管）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；5.3.2 铜绿假单胞菌实验用材料：铜绿假单胞菌菌悬液（≤100cfu/mL）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液（即用即配）；5.3.3 金黄色葡萄球菌实验用材料：金黄色葡萄球菌菌悬液（≤100cfu/mL）、甘露醇氯化钠琼脂培养基；5.3.4 用具：培养皿、接种环、洁净滤纸片、无菌玻棒。
5.4 供试液制备5.4.1 取供试品和pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以1:10稀释成供试液。
5.4.2 必要时，用统一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释；也可用混合的供试品原液作为供试液。
5.5 增菌培养5.5.1 供试品组：取1mL供试液，接种至9mL的TSB中，混匀，共接种2管。
5.5.2 阳性对照：取1mL菌液，与供试液同法操作，接种至9mL的TSB中，混匀，接种1管。
5.5.3 阴性对照：取1mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，与供试液同法操作，接种至9mL 的TSB中，混匀，接种1管。
微生物限度检查方法验证方案
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
微生物限度检查——培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验.
制作人：王丽娟 重庆医药高等专科学校
控制菌检查—— 培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
提纲
一、控制菌种类 二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验 三、对照试验
一、控制菌种类
耐胆盐革兰阴性菌
白色念珠菌
大肠埃希菌
控制菌检查项目 梭菌 沙门菌
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
1.控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应进 行培养基的适用性检查，检查项目包括培养基的促生长、抑制能力和指示特性。
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌 生孢Fra bibliotek菌2.检查方法的适用性试验 检查方法及流程同“微生物计数法适用性检查” 所用阳性对照菌液不同 结果判断不同：控制菌检查用培养基制药检出阳性对照菌即可判为无抑菌性
三、对照试验
阳性对照试验 • • • 目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜 操作：同供试品操作，仅加入了不超过100cfu的阳性对照菌 结果要求：应呈阳性 阴性对照试验 • • • 目的：检查操作环境、试验物品、操作技术是否无菌 操作：用稀释剂代替供试品，其余同供试品。 结果要求：应呈阴性
微生物控制菌检查方法验证方案
微生物控制菌检查方法验证方案一、背景介绍在制药、食品、医疗器械等行业中，微生物控制是非常重要的环节之一。
为了确保产品的安全性和合规性，对微生物的检查方法进行验证就显得尤为重要。
本文旨在提出一种可行的微生物控制菌检查方法验证方案。
二、方法验证目的本方案的目的是验证微生物控制菌检查方法的准确性、重复性、中间值和检测限度等关键指标，以确保该方法在实际应用中的可靠性。
三、验证方案1. 选择验证样品- 针对待验证的微生物控制菌检查方法，选择适当的微生物控制菌株作为验证样品。
验证样品应包含革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等常见微生物类型。
- 确保验证样品的纯度和活性，并按照国际、行业规定的标准方法进行检测。
2. 实验设计- 确定验证实验的设计方案，包括样品分组、样品数量、重复次数等。
- 考虑到实验条件对验证结果的影响，应合理设置对照组和正试验组。
3. 数据采集与处理- 在验证实验中，记录样品的检测结果、测试方法和环境因素等重要信息。
- 利用统计学方法对验证结果进行分析，计算实验数据的平均值、标准差、变异系数等，并进行显著性分析。
4. 验证指标- 准确性：评估该微生物控制菌检查方法的准确性，即其与已知标准方法结果的一致性。
- 重复性：通过对同一样品在相同条件下进行多次测试来评估方法的重复性，计算重复测定之间的变异程度。
- 中间值：通过对同一样品在不同批次进行测试来评估方法的中间值，计算不同批次之间的变异程度。
- 检测限度：确定该方法能够可靠地检测到微生物的最低浓度水平。
五、验证结果分析根据数据采集和处理的结果，对所验证的微生物控制菌检查方法进行评估，如准确性、重复性等指标是否符合要求。
若验证结果不符合要求，则需对该方法进行优化或调整，重新进行验证。
六、验证报告根据验证结果编写验证报告，并包括实验设计、数据采集与处理、验证结果分析等内容。
报告应具备准确性、完整性和清晰度，以便他人能够理解和复现验证过程。
七、验证结果的应用验证结果应用于实际微生物控制菌检查方法的应用中，作为判定产品合格与否的依据。
控制菌检验方法验证
（七）控制菌检验方法验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查方法测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应该进行重新验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B)44102】、验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌珠的生物学特性。
2.菌液制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35-37℃培养18~24小时;分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10~100cfu的菌悬液。
2.1阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
方法同试验组，验证大肠埃希菌的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。
阴性对照菌不得检出。
2.2常规法大肠埃希菌取相当于1g木香顺气丸的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10~100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10~100cfu，35~37℃培养18~24小时，取出培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。
2.3进行3次独立平行试验。
回收率阳性菌培养时间菌液组菌数试验组菌数供试品对照组菌数大肠埃希菌结果判断：以上试验菌回收不低于70%，则可按常规法进行控制菌检查。
结论：本品按中国药典2010版微生物限度检查，经方法适用性验证试验，结果可用平皿法进行细菌计数方法检验，用平皿法进行霉菌和酵母菌计数方法检验，用常规法进行控制菌检查。
检验者：校对者：。
控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程1.目的建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。
2.范围适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。
3.责任者QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部4.内容4.1检测准备4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。
4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。
4.2 供试液的制备4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。
4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。
如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。
4.2.2.1 可溶性液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。
可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
4.2.2.2 非水溶性液体供试品油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。
4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。
必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.2.2.4 非水溶性供试品取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。
微生物限度检验
2007.4
1
微生物限度检查 (Microbial Limits Test) ：
是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。 包括：
1）细菌计数； 2）霉菌及酵母菌计数； 3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡 萄球菌，大肠菌群
2
细菌、霉菌及酵母菌计数
大肠杆菌 1g (1ml)样品 样 100ml 胆盐乳糖 培养基 35-37 ℃,18-24h 大肠菌群 1g (1ml)样品 样 3X10ml 胆盐乳 糖发酵管 35-37 ℃,18-24h 沙门菌 10g (10ml)样品 样 200ml 营养肉汤 营养肉 铜绿假 铜绿假单胞菌 1g (1ml)样品 样 100ml 胆盐乳糖 培养基 35-37 ℃,18-24h 金黄色葡萄球菌 1g (1ml)样品 样 100ml 亚碲酸钾 碲酸钾 肉汤 (或营养肉汤) 或营养肉 35-37 ℃,18-24h 梭菌 1g (1ml)样品X2 样 (其中一份样品80 其中一份样 其中一份 ℃,10分钟) 分 100ml 新鲜庖肉 培养基 厌氧, 35-37 ℃,72-96h
8
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件 检验方法
检验规程
样品量 稀释液种类 稀释液体积 中和剂 培养基 培养时间 培养温度 ……
SOP
9
影响微生物检验的因素
- 样品/药品自身的特殊性 - 样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂 - 培养基的特性 - 培养条件 - 人员因素 - 实验器材的选择
甘露醇氯 甘露醇氯化钠琼 脂 (或卵黄氯化钠琼 或卵黄氯 或卵黄 脂) 35-37 ℃,18-72h
0.2ml 涂抹于 含庆大霉素的哥 亚琼脂 伦比亚琼脂 厌氧, 35-37 ℃,48-72h
控制菌检查法
液体培养基促生长能力检查 分别接种不大于 100cfu 的试验菌（见表 1）于
被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的
最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养基促生长能力检查 用涂布法分别接种不大于 100cfu 的试验菌（见
表 1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及
梭菌增菌培养基
促生长能力
生孢梭菌
哥伦比亚琼脂培养基 促生长能力
生孢梭菌
白色念珠菌 沙 氏 葡 萄 糖 液 体 培 养 促生长能力
白色念珠菌
基
沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 促 生 长 能 力 + 指 示 白色念珠菌
基
特性
念珠菌显色培养基 促 生 长 能 力 + 指 示 白色念珠菌
能力
抑制能力
大肠埃希菌
时。
结果判断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管
为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表 2 查 1g 或 1ml 供试品中含
有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。
表 2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）
各供试品量的检查结果
0.1g 或 0.1ml 0.01g 或
0.001g 或
小时）。
定性试验
除另有规定外，取相当于 1g 或 1mL 供试品的上述预培养物接种至适宜体积（经
方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养 24～48 小时后，
划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养 18～24 小时。如
果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。
控制菌检查
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出 结果为准，不再复试。
2
7/26/2016
耐胆盐革兰阴性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria） 大肠埃希菌（E.coli） 沙门菌（Salmonella） 铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa） 金黄色葡萄球菌（S.aureus） 梭菌（Clostridia） 白色念珠菌（C.albicans）
6
7/26/2016
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 3. 检验方法的适用性
目的： 某种样品采用某种方法得到一个检验结果
样品的影响 检验方法的影响
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 3. 检验方法的适用性
7
7/26/2016
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
3. 检验方法的适用性
供试液的制备
供试液、试验 菌加入规定的
培养基
如有抑菌活性： 稀释 中和 薄膜过滤
依相应的控制 菌检查法检验
结果判定
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 3. 检验方法的适用性
结果判定： 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法 进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活 性…，并重新进行方法适用性试验。
10
7/26/2016
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 3. 供试品检查 – 大肠埃希菌
结果判定： 麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证 是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但 鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
2010年版药典微生物限度检查法
附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。
控制菌检查
控制菌检查简述控制菌检查是用于检查某些特定微生物，规定按一次检出结果为准，不再复试。
由于控制菌为一次性报告试验结果，故应注意方法的有效性确证（方法验证或阳性对照）、实验过程保障和结果确证，以提高检验结果的可靠性。
既要避免漏检造成的假阴性结果，又要避免实验室污染造成的假阳性结果。
控制菌检查中，涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等，应在专门的阳性菌实验室进行。
除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家二级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。
阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。
目标控制菌的标准菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌菌液制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许接种至10ml营养肉汤培养基内，置30-35℃培养18-24小时，取均匀培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌10-100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后基数确定。
验证方法：试验组取规定量供试液和10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应的检查法进行检查。
当进行薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接至增菌培养基中。
阳性对照取10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应的检查法进行检查。
阴性对照取相应的稀释液替代供试液，按相应控制菌的检查法进行检查。
结果判定阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。
若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。
（一）大肠埃希菌简述大肠埃希菌即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。
埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。
控制菌检查法
控制菌检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适应性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。
菌种试验用菌种的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B）44102或CVCC1570]金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）[CMCC（B)26003或CVCC1882]乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphiB）［CMCC（B)50094］铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B)10104］生孢梭菌(Clostridium sporogenes）［CMCC(B)64941］白色念珠球菌（canidia albicans）[CMCC（F)98001］菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠球菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养18～24小时。
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。
适应性检查控制菌检查用培养基的适应性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。
表1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌(表1)于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养.与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50~100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。
控制菌及螨类检查技术—控制菌检查概述
• 5.1.1大肠埃希菌( Escherichia coli) • 5.1.2金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureu) • 5.1.3乙型副伤寒沙门菌( Salmonella paratyphi) • 5.1.4铜绿假单孢菌( Pseudomonas aeruginosa) • 5.1.5生孢梭菌( Clostridium sporogenes) • 5.1.6白色念珠.一般检查步骤 • 药品的控制菌检查的一般步骤包括供试液的制备、增菌培养、分离培养、 纯培养、革兰染色及生化试验或特定试验等。 • 增菌培养的目的是为了抑制不需要的细菌生长，面有利于需检菌的生长， 为此，不同的控制菌其增菌培养基会不同。 • 分离培养的目的是为了分离到需检菌的单菌落，而便于做纯培养和生化试 验。 • 纯培养的目的是为了得到纯种的培养物，便于做生化试验。生化试验根据 不同菌种代谢情况，如酶等的不同，而进行鉴别。
• 4.1大肠埃希菌的一般检步骤 • 增菌培养→MUG-Indole检査→分离培养→纯培养→染色镜检→生化实验（ IMViC） 。 • 注:阳性对照与阴性对照同时进行。 • 4.2铜绿假单胞菌的检查步骤 • 増菌培养→分离培养→纯培养→革兰染色镜检→生化试验(氧化酶试验、绿 脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验、明胶液化试验)。 • 4.3沙门菌的检查步骤 • 増菌培养(包括增菌和增菌培养)→分离培养→初步鉴别试验→生化试验(靛 基质试验、脲酶试验、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验、动力检査)→血清凝 集试验。
• 4.4金黄色葡萄球菌的检查步骤 • 增菌培养→分离培养→纯培养→革兰染色镜检→血浆凝固酶 • 4.5破伤风梭菌的检查步骤 • 增菌培养→分离培养→革兰染色镜检→过氧化氢酶试验 • 4.6白色念珠菌的检查步骤 • 增菌培养→分离培养→鉴定实验→芽管试验。 • 5.控制菌检查的菌种及菌液制备 • 5.1菌种 • 控制菌检查要进行阳性对照，其阳性对照菌种如下。菌种的选择以《中国 药典》附录为准，具体如下。
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【控制菌检查方法验证操作规程】控制菌有
哪些
GMP管理文件题目控制菌检查方法验证操作规程编码：页序/ 总页 1/1 制定审核批准制订日期审核日期批准日期颁发部门质量部生效日期分发部门化验室一、目的：为使控制菌检查的操作规范化、制度化，故建立此规程二、适用范围：控制菌检查必须按本规程执行。
三、责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。
四、正文：
1、控制菌检查方法适应性试验 1、1 供试液的制备取样品10g，用胰酪大豆胨液体培养基（TSB），作为稀释液制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养 ,培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。
1.2 试验菌大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 1.3适用性试验取相当于1mL供试品的上述预培养物及不大于100cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌分别接种至适宜体积肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养24小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18小时。
应能分别检出所加大肠埃希菌和铜绿假单胞菌相
应的反应特征. 1.4结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；
若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行山GMP管理文件题目控制菌检查方法验证操作规程编码：
页序/总页：2/2 方法适用性试验。
1.5耐胆盐革兰氏阴性菌的检查供试液的制备和预培养：取样品10g，用胰酪大豆胨肉汤琼培养基（TSB），作为稀释液制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养 ,培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时） 1.5.1定性试验：
除另有规定外，取相当于1g或ml供试品的预培养物接种至适应体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液培养基中，30～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃培养18～24小时。
判断结果：如果平板上无菌生长，判供试品未检出耐胆盐革兰氏阴性菌。
1.5.2定量检查：
选择和分离培养：取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01、0.001ml）供试品的预培养物或其稀释剂分别接种至适应体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液体培养基中，30～35℃培养24～48小时后，上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃培养18～24小时。
判断结果：若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则
对应培养管为阳性，否则为阴性。