实时定量PCR

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实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。

自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。

随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。

本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。

文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。

接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。

文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。

通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。

二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。

其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。

实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。

定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。

实时荧光定量PCR技术

千里之行，始于足下。

Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。

染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。

荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。

目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。

荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. Ct 值的定义-- Ct值。

C代表Cycle，t代表（如图1所示）。

2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-153. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct越多，Ct贝数的对数，纵坐标代Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。

而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2）SYBR 荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方PCR来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件

定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较定量PCR
常规PCR
灵敏度高高精确度安全省时
只能进行半定量或定性分析不安全易污染费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度加样精度反应体系的优化模板降解
59
定量PCR的新运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析基因拷贝数（CNV)分析蛋白质分析
61
62
相对定量的问题样品材料不均一造成的差别
内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合信号结果不准确
理想的PCR反应：非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度

实时荧光定量pcr标准曲线

实时荧光定量pcr标准曲线实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的方法，它能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的快速、准确的定量分析。

在实时荧光定量PCR实验中，标准曲线是非常重要的，它可以用来确定目标序列的数量，并进行定量分析。

本文将介绍实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法及其应用。

1. 实验设计。

在构建实时荧光定量PCR标准曲线之前，首先需要设计实验。

确定需要检测的目标基因或RNA序列，选择合适的引物和探针，设计PCR扩增反应体系。

同时，准备一系列已知浓度的标准样品，用于构建标准曲线。

2. 标准曲线构建。

将已知浓度的标准样品进行系列稀释，得到一系列不同浓度的标准曲线点。

然后进行实时荧光定量PCR反应，记录每个标准曲线点的荧光信号强度和对应的PCR循环数。

利用这些数据绘制标准曲线，一般采用对数浓度与荧光信号强度的散点图进行绘制，然后利用线性回归分析得到标准曲线方程。

3. 标准曲线验证。

构建标准曲线后，需要进行验证。

将标准曲线方程应用于实验样品，通过检测实验样品的荧光信号强度和对应的PCR循环数，计算出目标序列的浓度。

然后与实际浓度进行比较，验证标准曲线的准确性和可靠性。

4. 标准曲线应用。

一旦标准曲线构建和验证完成，就可以应用于实际样品的定量分析。

通过实时荧光定量PCR检测实验样品的荧光信号强度和对应的PCR循环数，利用标准曲线方程计算出目标序列的浓度，从而实现对目标序列的快速、准确的定量分析。

5. 结论。

实时荧光定量PCR标准曲线的构建是实验中的关键步骤，它直接影响到定量分析的准确性和可靠性。

通过合理的实验设计、严谨的实验操作和准确的数据分析，可以构建出准确可靠的标准曲线，为实时荧光定量PCR的定量分析提供可靠的依据。

总之，实时荧光定量PCR标准曲线的构建是实验中的重要环节，它为定量分析提供了可靠的基础。

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。

它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。

本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。

实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。

其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。

实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。

引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。

引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。

2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。

标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。

这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。

通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。

3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。

此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。

4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。

实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。

通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。

实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。

实时定量PCR技术(real-time PCR)

样品重复

重复次数请遵循统计学的要求小样本统计，n>6（n>3）未知样品和标准品都要重复所有复管在同样条件下完成PCR

2.2 技术方法及数据

绝对定量与相对定量

绝对定量：绝对标准曲线法

标准品拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

扩增效率扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。

TaqMan探针

TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)

当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。

PCR效率对定量结果的影响

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。

下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。

1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。

2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。

3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。

反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。

4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。

对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图)、实时荧光定量PCR原理(一)定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

(二)实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析• 4、几个概念:(1 )扩增曲线斬确餅扩増曲钱图占横坐标：tr增褥环飒(Cv'cle) t纵坐标丈5?光强度每个摘环进行一次荧光信号的牧集(2) 荧光阈值：荧光伫卩阈『i (threshold ):□FTLStS环信号柞均荧光本底信号^baseline),即样本的荧光誉景值和開性对照的黄光值□黄光城嵋的缺省设置是”鮎十蓮环的茨光信号的恬准俄菱的10信口手动设■；忌剧慕丈于样本的荧光背倉值和阴性对黑的荧光星高值F同时要尽虽遥择进人指数期的最初阶段.并且保证回归系数大于699□真正的信号I荣光信号超过域值CT值的重现性:纵轴：菟光信号星楫轴；pcRwgimCt值的特点’■相同模板进行9就扩增，终点处产物量不恒定,・Ct值则极貝重现性5、定量原理：理想的PCR反应：X=Xo*2n非理想的PCR反应：X=Xo (1+Ex) nn：扩增反应的循环次数X :第n次循环后的产物量Xo：初始模板量Ex :扩增效率5、标准曲线: "ind «r口模板DNA®越多.荧光达到域值的循环数越少，即仕值越小口Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品G值*就可以计算岀样品中所含的模板量6、绝对定量1 )确定未知样品的C(t )值2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记:二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Gree n 法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA 双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链 DNA , SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号r1■ 一 11J1 w-" -1 -_____________________ - ______________________________ 1-|--1 ■Tm 值：DNA 解链一半时的温度1/! ■ /“I 1 I1au i〈TTm[14■<W4$14Vl[iHHfW Awe]•将温度与荧光强度的变化求导乜Cdl/dT)脏解曲涉务析卜出睨杂吃其悒&關出现非料异性荧光’因此宦量丁准确U 模板DNAfi g 多.荧光达到域值的循环数越少□ Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品G 值.就可以计算出样品中所含的模板量PCR 反应体系的建立及优化：1、SYBR Green 使用浓度：太高抑制Taq 酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、 Primer :引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、 MgCI2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数：由酶和引物决定6、其他与常规 PCR 相同（二）应用范围 1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR 反应的条件，对常规PCR 有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

实时荧光定量pcr原理

实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，rt-qPCR）是一种常用于新生儿筛查和诊断病原体检测的分子定量方法。

它利用荧光标记的分子生物学技术，可以快速直接对特异的核酸序列进行检测，使检测过程更加精确快速，具有更高的特异性，可以测量微量样品。

实时PCR是基于PCR（聚合酶链反应）技术，它可以连续调整DNA或RNA片段的分子复制，目的是使目标DNA或RNA片段的量变得更多。

实时荧光定量PCR与其他实时PCR技术类似，但具有独特的优势，即在各个PCR周期中，它不仅可以检测和计数特定的DNA或RNA片段，而且可以定量检测，其特异性高强烈。

实时荧光定量PCR的工作原理是将一种可燃的标记的荧光物质（如恩替卡韦）收集到一起，成为荧光标记物或标记基因。

在性能上，它是一种热力学分子生物学技术，可以直接对特异的核酸序列进行检测。

当溶液中的特定核酸序列（如基因型）与检测溶液中的匹配（比如，使用收集器）时，荧光探针的特定的荧光单片将被激活，以及一系列的共同发光反应，从而产生荧光终级产物（FIP）。

最终，FIP的强度可以确定检测溶液中特定的基因的数量，用于定量。

实时荧光定量PCR的优势有：（1）高灵敏度。

它可以检测出非常小的核酸序列，即使它们微乎其微，甚至只有几个DNA底片；（2）快速。

可以在几个小时内完成；（3）高选择性。

它只是仅仅检测和计数特定的基因序列；（4）高特异性。

实时荧光定量PCR可以检测出比单次PCR更多的核酸片段，因此更加精确可靠；（5）高绝对量数据。

它可以提供准确的检测结果，并可以用于直接比较不同标本的数量差异；（6）同时测量多个基因。

可以特异性地检测不同家族的基因，即使这些基因的序列和尺寸都存在很大的差异，也可以很容易的检测到它们。

实时荧光定量PCR的主要应用是在基因组学及病毒学研究中，如检测HIV抗原、癌症基因组遗传学分析、突变定位以及新生儿疾病筛查等。

实时荧光定量PCR仪操作流程

实时荧光定量PCR仪操作流程实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种常用的分子生物学实验仪器，用于定量检测DNA或RNA样本中的特定序列。

通过对PCR反应进行荧光检测，可以实时监测目标序列的扩增过程，并且具有高灵敏度和高特异性的优势。

下面将介绍实时荧光定量PCR 仪的操作流程，以帮助您正确进行实验。

1. 准备工作在开始实时荧光定量PCR实验之前，需要准备以下实验器材和试剂：（1）实时荧光定量PCR仪：确保仪器已预热至适当的温度；（2）PCR反应管或板：根据实验需要选择适当的规格；（3）PCR试剂盒：包括DNA模板、引物、探针、酶等；（4）DNA/RNA样本：按照实验设计合理稀释或提取，确保样本质量良好；（5）聚合酶链式反应混合液（PCR Mix）：根据试剂盒说明配置混合液。

2. 操作步骤（1）设置PCR仪参数：将需要的实验参数输入PCR仪中，包括扩增阶段的温度、时间和循环次数等。

（2）制备PCR反应体系：按照试剂盒说明书中的配方将PCR Mix、DNA模板、引物和探针等加入PCR反应管或板中。

（3）密封反应管或板：确保反应管或板密封良好，避免样品蒸发或污染。

（4）放入PCR仪：将密封好的PCR反应管或板放入PCR仪中，确保仪器已预热至适当的温度。

（5）运行实验：启动PCR仪，开始实时荧光定量PCR反应。

仪器会根据设置的参数自动进行温度循环和荧光信号监测。

（6）数据分析：实验进行过程中，可以通过PCR仪的软件实时监测扩增曲线和荧光信号，获得相关的实验数据。

（7）结果解读：根据实验目的和结果，对荧光信号和扩增曲线进行分析和解读，获得所需的定量PCR结果。

3. 注意事项（1）实验操作应按照严格的无菌操作要求进行，避免PCR反应受到外部污染。

（2）实时荧光定量PCR仪涉及的试剂和标本具有一定的生物安全风险，应按照相关安全规范进行操作和处理。

（3）准确的数据记录和标注是保证实验结果可靠性的重要环节，务必在实验过程中进行详细记录。

实时荧光定量PCR的应用前景

实时荧光定量PCR的应用前景实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的高效、灵敏的分子生物学方法。

它通过在PCR反应过程中监测PCR产物的荧光信号来定量检测DNA或RNA的数量。

随着生物科学研究的不断深入和生物医学领域的发展，实时荧光定量PCR在基础研究、临床诊断和生物工程等领域都具有广阔的应用前景。

1. 基因表达研究实时荧光定量PCR可以准确地测定靶向基因在不同生物样本或不同处理条件下的表达水平。

通过构建合适的荧光探针或引物，可以快速、精准地检测并定量基因在细胞或组织中的表达水平。

这对于研究基因调控、信号传导通路以及疾病发生机制等具有重要意义。

2. 微生物检测实时荧光定量PCR可以在短时间内检测出微生物的存在和数量，具有高度的灵敏性和特异性。

在感染性疾病的诊断中，通过检测患者体液中病原微生物的核酸，可以快速准确地确定感染病原体，并指导临床用药。

此外，在食品安全领域，实时荧光定量PCR也被广泛用于检测食品中的致病微生物，确保食品安全。

3. 个体基因分型实时荧光定量PCR可以对个体基因进行高通量的快速分型。

通过引物设计和荧光标记，可以对多个位点的基因进行同步检测，从而迅速获取个体的基因型信息。

这对于基因相关疾病的研究、药物治疗反应性的评估以及遗传学研究都具有重要意义。

4. 微量核酸检测实时荧光定量PCR对于微量核酸的定量也具有高灵敏度。

在复杂样本中，如稀释的血液样本、环境水样或古老的DNA，实时荧光定量PCR能够快速、准确地检测到微量的核酸。

这对于犯罪学、考古学以及环境监测等领域具有重要意义。

5. 肿瘤研究实时荧光定量PCR在肿瘤相关研究中发挥了重要作用。

可以通过监测癌基因、肿瘤抑制基因的表达水平，评估肿瘤的恶性程度和预后，为肿瘤的个体化治疗提供依据。

另外，实时荧光定量PCR还可用于检测循环肿瘤标志物等肿瘤相关指标，辅助肿瘤的早期诊断和疾病监测。

实时荧光定量PCR

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
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3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

实时定量pcr原理

实时定量pcr原理
实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一种用于检测和测量特定DNA序列量的技术。

该技术结合了传统PCR和DNA定量技术，可以在PCR反应进行过程中实时监测和记录DNA的增殖情况。

实时定量PCR的原理是通过特定引物和荧光探针结合，实时监测和记录PCR反应中DNA的增量。

该技术通常采用荧光染料或探针，如SYBR Green或探针涉及双校验报告器染料。

SYBR Green可以结合PCR产物中的双链DNA，生成荧光信号，而探针方法则利用探针与PCR产物的高度特异性结合，产生荧光信号。

这些信号可以由实时定量PCR仪器进行检测和记录。

在实时定量PCR中，反应体系包含待测DNA样本、引物、荧光信号探针（如SYBR Green）或特异性探针以及其他反应组分。

PCR反应进行过程中，随着DNA的增殖，荧光信号也会相应地增加。

实时定量PCR仪器可以对荧光信号进行连续的检测和记录，通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值），可以确定初始模板DNA的量。

实时定量PCR的原理基于实时检测和记录PCR反应中DNA 的增量，无需进行后续凝胶电泳或测序等步骤，从而实现了高效、准确和革新的DNA定量。

由于其高灵敏性、快速性和定量性，实时定量PCR在生物医学研究、遗传学分析、疾病诊断和药物筛选等领域得到广泛应用。