感染性疾病病原的诊断策略(讲座)参考模板

感染性疾病病原的诊断策略在我们的日常生活中，小到一个皮肤创卫，大到肺炎，肝炎，性传播疾病，都有感染声音的存在。

在感染性疾病的诊疗过程中，对于其感染性病原体的诊断处于一个非常重要的位置，因为他既帮助我们确定疾病的病原，又指导我们后期的治疗与用药，可以说是一个不可或缺的因素。

但我们都知道，造成感染性病原体的千差万别，他们都具有不同的生物学特性，这就迫使我们用策略和手段去寻找他们。

随着科学技术的发展，微生物学的鉴定和专断技术也有了长足的进步一、病原诊断策略的分类如今病原学的诊断技术多种多样，从最简单的手工平板划线分离到最常规的自动化细菌鉴定仪，到最新的DNA测取技术，病原学的诊断技术几乎覆盖了医学微生物学、分子生物学、生物化学的方方面面，具有很长的交叉性，这个问题看起来似乎复杂，没有头绪，但是我们能够认真梳理还是很容易的理出一条主线，其实无论什么方法，都能归入两个大类。

一类是以病原体表现型为基础的方法；另一类是以病原体基因型为基础的方法，所以表现型就是病原体直接表型出的一些性状，其物理学性状、生化反应特性、免疫学特性，特性可以通过平板划线分离，生化反应，血性型实验的检测出来。

从分子微生物学的角度讲，表现型是病原体基因组，特别是一些活跃的基因经过转入翻译后的外在表现，虽然只能体现病原体基因组的部分特征，但是由于针对其实验技术成熟，操作方便，成本相对低廉，因此，仍然是当今病原体诊断的常规技术，相比之下以基因型为基础的方法更加接近病原体的本质，因为基因组的存在了病原组的全部遗传信息，以基因性为基础的方法大致可以分为基于退性基因的检测，以及基于测序的两大手段。

前者主要针对退役性基因，这些基因包含了病原体的某些种系特征，该方法快速特异，但鉴于临床标本千差万别，有时会出现敏感性问题。

而后者主要基于病原体ＤＮＡ剪辑系列，可以说做到了触及病原体的本质，是当今所有检测技术的基因标准，但是由于经济成本和标准化的问题还很难广泛推广，不可否认它将是未来诊断技术的趋势和发展方向。

二、以表现型为基础的方法（一）基因物理学特性和生化反应的诊断在整个微生物的发展历史中，人类经历了经验时期、现代微生物学时期这几个重要的历史阶段，在1670年荷兰人发明了显微镜，第一次揭示了微生物世界的存在，开始人类进入了实验时期，从那以后至今300多年的时间里，通过多种多样的实验方法来鉴别不同微生物的物种间的不同性质；这其中有形态学的方法最基本的格兰染色，鉴定白喉棒状杆菌的染色。

鉴定结核分枝杆菌的抗酸染色，也有基于生化反应的方法，如平板考察肠道细菌对于乳糖分解能力的不同以确定致病菌株，运用了整合了四个生化反应的实验鉴定了不同的肠道杆菌的方法虽然这些方法被视作经费的保留下来再医学上广泛和大量的应用但是手工操作存在效率偏低的疫病。

而随着工业化的推进和科学技术的不断发展，其中很多方法被系统化集成化标准化，许多手工作业被自动化仪器所取代，这样便催生了自动化鉴定技术，手工鉴定和自动化鉴定技术可以说相同原理在不同技术条件下的不同形式，但不可否认无论效率的高低它们都是基于相同的经典微生物学理论。

虽然在高技术条件下的今天，许多手工操作的方法已经濒临淘汰，但是在一些基础条件欠发达的地区，在一些经验性诊断已经相当成熟的疾病面前，经典的手工操作方法以及低技术要求，低成本的独特魅力在高科技的加分中仍然取得了一席之地，上图中为我们展示了几种比较经典的手工操作方法，让我们先来看最左边的一张，这张图片给我们展现给我们的是平板划线分离的方法，将含有多种细菌的菌液图铺在同一个题板上，经过一段时间的培养，可以根据菌落的特性辨别出不同的细菌，在图中我们可以看出两种明显不同的菌落，一种菌落较大，明显来源于不同的菌种，经验丰富的实验者往往能直接通过菌落的颜色、光泽、干湿、外形的信息做出初步的诊断，同时这种方法也是自动化细菌检定仪的第一道工序中间农业的格兰染色，在图中所指区域，可以找到大量格兰阴性的球菌集合。

病人不检性生活史、尿急尿痛的尿道刺激征，我们很容易做到林秋菌性尿道炎的诊断，而无需进一步的微生物学检查；第三张图展示的是甲乙丙的三种链球菌在血滴板上不同溶血快的特征，在１２点中方向是不溶血的典型溶血性球菌，在五点中方向生长的是完全溶血的的隐形溶血的，在7点溶血的是不完全溶血的甲型溶血性链球菌，链球菌是常见的人体的致命菌，菌落特征很难区别只有通过溶血的特点才能完全区别，因此血平板的培养的也是不错的区别不同细菌的方法。

以上我们讲解的比较经典的手工操作的方法但是我们知道手工操作存在人为影响因素多主观因素强这样可以控制效率工作的缺点及检查以及很难想象是如今对于医疗条件的要求，由于工业化和标准化的问题自动化鉴定技术也意义而深了我们知道一个菌种面对不同的反应物有不同的反应结果，一个菌种也会产生不同的结果；将这些反应结果建立不同的数据库就是我通常所说的反应库，那么其中针对细菌的特点就会有特定的反应组合，将待检细菌的结果与反应比对，就能得出相应的鉴定结果，这就是自动化鉴定的基本原理。

虽然和手工操作一样自动化鉴定技术在相似的原理之上，但是将信息标准化集成化使得很大成功提高了检测效率；同时操作的程序化也减少了人为因素的影响，使整个结果更加可靠。

自动化鉴定技术的系统反应表中展示的应用与自动化鉴定仪各种反应系统，通过反应系统将手工操作的方法跟其结果反应的本质进行分类，比如有些跟菌可以分解特定糖类产生酸。

导致培养环境ＰＨ值发生改变。

而有些细菌无法分特定糖类则不产生酸。

类似于手工操作的中的发酵试验，又如有些细菌含有特定的酶类，如螺旋杆菌和尿素酶可以分解尿素产生的胺类物质。

有些镁可以使适当的体物显色，通过检测不同细菌的酶类，可以达到检测和诊断的目的。

综上所述，我们可以通过不同的反应与体系，建立不同的反应数据库与待测菌株进行比对。

可供比对的信息越多反应结果越准确。

（二）基于物理特性和生化反应方法的局限性虽然以生物学性状与生化反应为基础的方法是如今临床实验的主流方法但其本身具有的局限性也是不容回避的。

首先，单一的生物学性状与单一的与性状直接可能在一种一对多多对一的情况因此只有增加不同的反应通过不同的反应组合与达到反应特异性的目的其次当细菌要表示特有的生物学性状和生化需要一定的数量作为保证，而从临床标准中直接提取的细菌量是无法达到的检测的预知的。

因此，培养的步骤往往无法避免，通过适量的扩增才能达到反应的要求而培养的的步骤是比增加检测的时间成本。

最后，由于培养依赖性一些难培养或者体外无法培养的细菌就很难达到数量上扩增的要求，也很难检测这就造成假音性结果，这对于病情是一种低估或误诊。

二、基于免疫学特征（一）ELISA的原理有些病原体如异样性病都离开人体很难通过培养性依赖检测但是我们知道很多病原体在人体的感染程度会遗留下某些证据，比如病原体的一些抗原，或是这些抗原激发人体产生的抗体这些抗原和抗体就通过免疫学的方法检测出来，简言之免疫学手段就是通过人工方法以知的抗原抗体利用免疫学结合的原理检测病原体位置的抗原和抗体。

并将这种结合可视化来达到鉴定的目的，免疫学鉴定的方法和反应介质分类分为物象测定和液相测定，在病原体的诊断中主要依赖于固相免疫测定，其中以酶来镁为代表性，也就是我们说的实验。

实验是雇佣名才定方法，虽然针对其也有不同的策略，但是大致的原理是一致的。

在设计过程中，有一种非常重要的酶标抗体，这种抗体在不影响其抗议性结合的情况下与某种酶工贾结合，而酶本身的活性不受抗体的影响，这种酶可以喝特异性的地物反应并显色，在实验中先将已知的抗原和抗体包在载体表面，然后再临床标本在与其反应，反应后洗未反应的物质，待显标准中可结合物越多，则残留在表面可抗原抗体残留物越多，在加入酶抗体与之结合洗脱后如果结合越多则酶含量越高，最后加入特异的地物显色，颜色的深浅与酶多少相关，将颜色深浅量化之后得出样品中含有多少抗原或抗体物质结果，这就是实验。

通过上图可以看到实验结果，由下向上讲解，最下方是一条横线代表固相载体，上面的是小三角是足量的包被的已知抗原，与之结合的是病人的血型在抗体的上方时能识别人免疫球蛋白的抗体。

酶工价结合成酶标抗体，在反应中我们可以看到病人的血清是担任重要的角色，而与包被抗原之间是不能形成免疫复合物，只有当血清中含有真正抗原的酶标抗体才能避免被洗脱，然后保留下来。

因此，显示可以看到形成图中所示的复合物才最终显色，如果病人血清中没有包被的抗体那么反应物没有显色形成阴性结果。

（二）ELISA的主要策略当然实验也有不同的策略和类别。

针对不同检测对象根据２抗的不同和检测对象的不同，可以分为直接法间接法和夹心法；直接法是固相载体表面包被已知抗原然后和未知抗体与之结合。

酶标抗体和未知抗体是同一个抗体没有２抗出现。

所以每次实验都必须进行过程，这就无形中增加时间成本，且待测样本中待测的量通常是未知的因此不宜大规模的生产，这就直接导入了直接法在临床检验中不常用的结果，间接法运用的是酶标和镁表２抗其原理是我们先前讲到的图示。

由于其包被在固体个表面，与之抗原检测病人标准中的位置抗体，而且比较单一。

；可以预先标记大规模生产以此检验中间接法广泛运用，。

这种方法的酶标抗体是针对某种抗原的已知抗体包被在固体表面的也是某种抗原的抗体，在反应中标准中两个抗体家在其中。

因此叫夹心法；用于检测病人血清中或ｉ其他标本中的抗体在我们临床使用中根据不同选择适宜的方法。

（三）ELISA间接法的实验过程上图展示的是实验过程，他检测的是病人体内的未知抗体。

首先我们将已知抗原同过化学方法在固相载体表面。

然后加入不同病人血清；让我们将左右两张图含有大量的两个多重抗体，在左边的病人血清中还有包被的对应的抗体经过洗脱的过程，只有特异性抗体保留下来；其余的也被洗脱而右边的不合这种抗体因此当２抗加入１抗相结合，而右边的标本因此２抗也就无法结合；在下一步就是加入酶的地物酶没有２抗没有酶存在，颜色浅色、颜色与酶多少有关；通过酶标量化出来，计算血清量价。

（四）基于免疫特征的方法存在的优缺点首先，在大部分的情况下免疫学方法所坚持的标准是人的血清和尿液；来样比较方便而且不用等待病原体生化反应，通常不需要培养的过程了。

这就节省了时间成本和经济成本对于那些和难培养的病原体不受培养的干扰；但是有局限性依赖性优于病原的限制，可以体外的是非常有限的；因此通过免疫学方法接受病原体的数量是有限的；二、特定抗原物种直接存在交叉性。

对我们有有利的一面和不利的一面，对于难以得到的可以用其他物种之间代为坚持我们用意得到的用于检测感染，反过来不利的因素是假阳性的结果，只有一个是明显的增高进行明确的诊断。

三、以基因型为基础的方法（一）概述基于表现型的方法要针对不同的病原体的不同特性，因此有众多的方法，就像我们前面所提到的不同的反应，而且我们的表格中只是涉及其中的一小部分，而基于基因组的方法，由于针对的是细菌或者病毒的DNA，无论病原体的本身性质如何，基于DNA性质差异并不大。