分子生物学答案

分子生物学答案

一、名词

1、鸟枪法（Shotgun method）：使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方法。使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段，再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中，并使其表达。

2、色氨酸操纵子（tryptophane operon）：负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。

3、酶切图谱（Macrorestriction Map）：描述限制性内切酶的酶切点的位置和距离信息的图谱。

4、原位杂交（in situ hybridization）：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

5、结构域（domain）：是构成蛋白质三级结构的基本单元，是指生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，是蛋白质生理功能的结构基础，这种相对独立的区域性结构就称为结构域。

6、DNA杂交（Southern blotting）：又称为Southern杂交，即用放射性标记的探针与靶DNA进行杂交的技术。

7、基因组文库（genomic library）：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库（短答案：是指采用基因组克隆的方法，克隆的一套基因组DNA片段。）

8、粘性末端（cos site-carring plasmid）：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸，叫做粘性末端。

9、一致序列（又称保守序列：conserved sequence）：遗传物质里的片段极少发生突变而且在不同生物中广泛存在。（长答案：在几种不同类型生物体中非常相似的DNA序列。科学家认为这些跨物种的相似性证明了某个特殊的基因完成了一些许多生命形式所必须的基本功能，因此在进化过程中保留了这些序列，而很少发生突变。）

10、序列位置标签（Sequence Tagged Site，STS）：一段短的DNA序列（200-500个碱基对），这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR反应中可以检测出STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA 的方向和特定序列的相对位置。

二、问答题

一、在分子克隆实验中为提高转化效率需注意哪些因素的影响？

答：1、受体细胞的生长状态和密度。2、质粒的质量和浓度，主要是浓度比例要合适，才能最大限度的与目的基因结合，达到最佳的转化效率。3、试剂的质量，主要是指用于转化试剂的质量，各个厂家、一个厂家不同批次的试剂质量都可能存在很大的差异。

4、防止DNA污染和其他杂菌，主要是指实验所用的仪器设备都要注意彻底消毒灭菌。

二、什么是同裂酶与同尾酶？及其在基因克隆中有何用途？

答：同列酶：是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同；同尾酶：即能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端.

三、简述PKA的特性，cAMP-PKA途径的组成与机制及对基因表达调节作用？

答案：蛋白激酶 A (protein kinase A，PKA)又称依赖于cAMP的蛋白激酶A，是一种结构最简单、生化特性最清楚的蛋白激酶。PKA全酶分子是由四个亚基组成的四聚体, 其中两个是调节亚基，简称R 亚基，另两个是催化亚基，简称 C 亚基。R亚基的相对分子质量为49-55kDa, C亚基的相对分子质量为40kDa,总相对分子质量约为180kDa；全酶没有活性。在大多数哺乳类细胞中, 至少有两类蛋白激A, 一类存在于胞质溶胶, 另一类结合在质膜、核膜和微管上。激酶是激发底物磷酸化的酶,所以蛋白激酶A的功能是将ATP上的磷酸基团转移到特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上进行磷酸化, 被蛋白激酶磷酸化了的蛋白质可以调节靶蛋白的活性。一般认为, 真核细胞内几乎所有的cAMP的作用都是通过活化PKA,从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的。

蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）：由两个催化亚基和两个调节亚基组成（图8-15），在没有cAMP时，以钝化复合体形式存在。cAMP与调节亚基结合，改变调节亚基构象，使调节亚基和催化亚基解离，释放出催化亚基。活化的蛋白激酶A催化亚基可使细胞内某些蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，于是改变这些蛋白的活性，进一步影响到相关基因的表达。

cAMP-PKA途径：

四、简述真核基因在原核细胞表达的一般原理？

答案：1、采用的主要表达方式有三种即（1）融合表达，（2）非融合表达，（3）及分泌型表达。

（1）融合表达：是真核基因在大肠杆菌中使其表达融合的一部分及融合蛋白的氨基端是真核序列，羧基端是原核序列。

（2）非融合表达：是指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的A.U.G为起始，在氨基端不含任何原核蛋白序列。融合与不融合表达需要不同的载体。

（3）分泌型表达：是将外源基因整合到编码原核蛋白信号肽序列基因的下游来实现的，当蛋白分泌到细菌周质时，信号肽被切除。

五、简述hnRNA、snoRNA、snRNA和antisenseRNA四个名词的含义及其一级结构的特点？

答案：1、hnRNA：在真核细胞核内可以分离到一类含量很高，分子量很大但不稳定的RNA，称为核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA），其平均分子长度为8-10kb，长度变化的范围从2kb左右到14kb左右。比mRNA的平均长度（1.8-2kb）要大4-5倍。估计hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。（短答案：Hn RNA真核细胞核内一组转换极快、大小不一、分子量多超过107kb的RNA称为不均一核RNA，包括基因转录的直接产物和部分加工产物。）

hnRNA的结构有以下特点：

(1) 5′端有帽结构；

(2) 3′端有poly（A）尾巴；

(3) 帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；

(4) 有重复序列，位于寡聚U区后面；

(5) 有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；

(6) 非重复序列中有内含子区。

2、snoRNA：是位于细胞核仁中一类小分子非编码RNA，在rRNA生物合成中起着重要作用，是近来生物学研究的热点。已证明有多种功能，反义snoRNA指导rRNA核糖甲基化。核仁小RNA与其它RNA的处理和修饰有关，如核糖体和剪接体核小RNA、gRNA等。核仁小RNA是一个与特性化的非编码RNA相关的大家族。（短答案：是一类小型RNA分子，可引导核糖体RNA（rRNA）或其他RNA的化学修饰（如甲基化）作用。）

3、snRNA：它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。

4、antisenseRNA即反义RNA，是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其他RNA 互补的RNA分子，由于核糖体不能翻译双联的RNA，所以反义RNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早在E.coli的大肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验zhengming 在真核生物中也存在反义RNA。近几年来通过人工合成反义RNA的基因，并将其导入细胞内转录成反义RNA，即能抑制某特定基因的表达，阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。细胞中反义RNA的来源有两种途径：第一是反向转录的产物，即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产物，如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，起反义基因是MICFZE 则为另一基因。

六、简述cDNA探针和cDNA文库的概念及在分子克隆中的用途？

答案：cDNA探针：cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经一