谈有关HPLC柱效的问题
在使用液相色谱法作检测时-z柱效的影响因素
影响液相色谱柱效的因素
/bbs/shtml/20090727/2025391/
另外：
液相增加柱效、提高灵敏度的小窍门：
1、提高柱温；
2、减小柱内径；
3、缩短检测器响应时间；
4、减小柱外体积；
5、使用超纯硅胶；
6、使用高能量氘灯；
7、使用中孔透光氘灯；
8、改变流动相pH ；
9、改变有机相% ；
10、改变键合相；
11、改变有机添加剂；
12、改变流动相配比方式。
在使用液相色谱法作检测时，其柱效往往会直接影响到测定结果。
有的时候，可能只要稍微改变一下色谱操作条件，你就会得到较好的色谱图或能明显提高检测灵敏度。
以下是我的一点体会。
老多_小多
柱温升到90度？太高了吧，是不是用aiglent的rrlc做的？agilent的rrlc主要就是通过增加柱温来提高分离速度的。
普通液相柱温不能设这么高的吧？
可能是知识太浅了，请各位版友给点意见，呵呵。
chenliuhua26
“柱温升到90度？太高了吧，是不是用aiglent的rrlc做的？agilent的rrlc主要就是通过增加柱温来提高分离速度的。
普通液相柱温不能设这么高的吧？
可能是知识太浅了，请各位版友给点意见，呵呵。
”
是呀90度的温度有几根柱子受得了呀！买来的柱子，粒径也改变不好，其他的
说得挺好的！
天天开心。
HPLC技术讲座系列之色谱柱的日常维护及应用解决方案
为什么反相色谱应用如此广泛?
它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。 适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。 保留机制可以用分子的疏水性进行描述和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。 选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离
3
N = 6854, Tf = 1.78
4
5
1) 尿嘧啶 2) 心得安 3) 去甲替林 4) 丙咪嗪 5) 阿米替林
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
min
mAU
2
125
3
100
Welch UltimateTM XB-C18
75
1
50
25
4 5 N = 7256, Tf = 1.05
色谱柱: 4.6 x 100 mm, 5 µm
Peak tailed
2) 2,2’-联吡啶
20
2
3
3) 1,2-二羟基萘
0
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
min
硅胶粒径
粒径 5 µm
3 – 3.5 µm < 2 µm
7 – 10 µm 10 – 20 µm
作用和效能
目前应用最广泛，可以满足从分析到 半制备的分离
常用于分析柱上的快速分离，色谱柱 短，节省溶剂
3) 去甲替林 4) 丙咪嗪 5) 阿米替林
0
0
2
4
6
影响到色谱柱的性能的因素及操作规程
影响到色谱柱的性能的因素及操作规程影响到色谱柱的性能的因素色谱柱是指装填有固定相用以分别混合组分的柱管。
由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等构成。
在使用过程中，会有一些因素影响到色谱柱的性能，下面简单介绍五种常见的影响因素。
1.色谱柱断裂熔融石英色谱柱的聚酰亚胺涂层如有少许分裂它就会断裂。
聚酰亚胺涂层可保护易碎的熔融石英管线。
柱温箱持续的加热或冷却、柱温箱风扇的震动以及把色谱柱绕在圆形柱架上均会对管线造成压力。
最后在薄弱处发生断裂。
通过轻划或磨损聚酰亚胺涂层会造成显现薄弱处。
通常锋利的尖或边划管线时会造成划痕。
直径较大的色谱柱更简单断裂。
也就是说在处理.45—0.53 mm 内径的管线时要比处理0.18—0.32 mm 内径的管线更加谨慎以防断裂。
已断裂的色谱柱并非不能用。
假如已断裂的色谱柱保持在高温下连续运行或运行多个温度程序，则将特别简单损坏。
已断裂色谱柱的后半段暴露在高温的氧中会快速损坏固定相。
而色谱柱的前半段因有载气通过仍会保持完好。
假如已断裂的色谱柱未经加热而是仅在高温或含氧的环境下暴露很短时间，则后半段将不会受到任何严重损坏。
可以通过安装接头来接上已断裂的色谱柱。
2.热损坏超杰出谱柱的温度上限会造成固定相和管表面的加速损坏。
这样会造成色谱柱的过分流失，活性组分形成拖尾，以及/或降低柱效（分别度）。
幸好热损坏是一个很慢的过程，因此，在色谱柱严重损坏之前还有一段很长的时间可在高于温度极限的条件下使用。
当有氧存在时会大大加速热损坏。
对有泄漏或载气中氧含量较高的色谱柱进行过度加热可快速并永久地损坏该柱。
将GC 的柱温箱温度设定为色谱柱温度极限或稍高于该温度极限是防止热损坏的较佳方法。
这样可避开色谱柱意外的过热。
即使色谱柱受到热损坏，仍旧可使用。
把色谱柱从检测器上卸下来。
在色谱柱的恒温温度极限下，将其加热8—16 小时。
把色谱柱接到检测器的一端截去10—15 cm。
按正常情况安装色谱柱并进行老化。
液相色谱柱使用疑难问题解析
液相色谱柱使用疑难问题解析内容提纲：一、液相色谱柱的安装、启用和维护中的重点注意事项1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配2、溶剂的匹配转换3、新柱使用前的平衡和老化4、pH使用范围5、色谱柱的保存二、柱压问题1、填料破碎和使用后，有填料粉末生成2、颗粒物堵塞引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除3、化学污染物引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除三、峰形问题1、峰后拖2、峰前延3、其他峰形问题四、保留时间问题1、保留时间的重现性2、保留时间漂移3、柱与柱之间的重现性4、批与批之间的重现性五、寿命问题六、其他疑难的色谱技术问题一.安装、启用和维护中重点注意事项色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。
如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。
另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。
1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。
上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。
接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。
2. 溶剂的匹配转换色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。
特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。
正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。
3. 新柱使用前的平衡和老化厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。
最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。
色谱柱柱效降低的表现
色谱柱柱效降低的表现
色谱柱柱效是指分离某一混合物时，不同成分经过色谱柱后分离效果的好坏程度。
当某些因素影响到色谱柱的分离效果时，就会出现色谱柱柱效降低的表现。
色谱柱柱效降低的表现主要有以下几种：
1. 分离峰形变：分离峰的峰形变得模糊或分离峰出现分裂。
2. 分离效果下降：分离效果不佳，混合物中的成分难以分离。
3. 峰宽增加：某些因素会导致分离峰的宽度增加，这会降低柱效。
4. 保留时间发生改变：某些因素会导致样品的保留时间发生改变，这会影响柱效。
5. 柱寿命缩短：某些因素会缩短色谱柱的使用寿命，需要更频繁地更换色谱柱。
色谱柱柱效降低的原因有很多，包括样品组成、流速过快、柱温过高、柱强度不足、柱填充不均匀等等。
因此，在使用色谱柱时，需要仔细考虑某些因素，以确保色谱柱的分离效果和寿命。
- 1 -。
柱效
液相色谱柱柱效的提高和测算液相色谱柱柱效的提高和测算摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。
关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数一、提高液相色谱柱柱效的方法我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。
要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
(3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
(4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。
二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。
其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。
因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。
对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。
不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。
这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。
尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。
hplc柱效计算公式
hplc柱效计算公式
高效液相色谱（HPLC）柱效应是一种现象，它指的是分
子在柱上的分离过程中出现的浓度不均匀性。
它也称为柱压力或柱负荷，是指在一段时间内，分子浓度在柱内从输入端到输出端的变化。
这种不均匀的性质可能会影响HPLC柱的分离
性能，因此计算柱效应是必不可少的。
HPLC柱效应的计算公式为：N（t）= N0 * e^-k*t，其中
N（t）是时间t时，HPLC柱中溶质浓度，N0表示柱入口处溶质浓度，k为柱效应常数，与柱的长度、内径、温度和柱内表
面积有关。
通过计算柱效应，可以更好地了解柱效应的影响情况，和柱内溶质浓度的变化，从而提高HPLC柱的分离效率。
此外，柱效应的计算也可以帮助调整柱的温度和流速，以便更好地控制HPLC柱的分离性能。
此外，HPLC柱效应的计算还可以帮助确定各种溶质的柱
反应时间，从而帮助用户在柱上进行分离操作。
由于柱效应的计算可以帮助HPLC柱的有效利用，因此柱效应的计算是HPLC柱使用过程中必不可少的一部分。
总之，HPLC柱效应计算公式是：N（t）= N0 * e^-k*t，
它是用来衡量柱内溶质浓度变化的一种方法，可以帮助用户更好地控制HPLC柱的分离性能，从而提高分离效率。
此外，
柱效应的计算也可以帮助用户确定溶质的柱反应时间，从而获得更好的分离结果。
液相柱效下降的原因
液相柱效下降的原因
液相柱效下降的原因可能有以下几个方面：
1. 柱材质损坏或老化：柱材质受到物理或化学因素的损害或老化，导致柱效下降。
常见的因素包括溶剂浸润、机械磨损、化学腐蚀等。
2. 柱填充物失活：柱填充物表面上的活性基团出现损坏、污染或失活现象，导致柱分离效果下降。
常见的原因包括样品污染、化学反应、高温等。
3. 柱回收不当：柱按照正常操作要求进行回收和保养，是保持柱效稳定的关键。
如果回收不当，如未正确关闭、储存环境不合适等，可能导致柱效下降。
4. 柱使用条件不合理：液相柱性能与使用条件密切相关，包括流速、温度、溶剂等。
若使用条件不合理，如流速过高、温度过高、溶剂选择不当等，均可能导致柱效下降。
5. 样品干扰：一些样品中的杂质可能与柱填充物发生反应，导致柱效下降。
常见的杂质包括盐、杂质、离子等。
6. 柱连接部位问题：柱连接部位若存在渗漏或没有正确连接，会导致样品在柱中漏失或干扰，从而导致柱效下降。
需要定期检查和维护液相柱，避免以上因素的影响，保持柱效的稳定和良好的分离效果。
高效液相色谱使用中常见问题及对策
高效液相色谱使用中常见问题及对策
高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分
析技术。
在使用HPLC的过程中，可能会遇到一些常见问题，以下是一些可能的问题及对策：
1. 峰形不对称或分离不良：可能是由于柱问题引起的。
可以尝试更换柱，确保柱的性能良好，
并尽量避免超出柱的最大推荐压力。
2. 峰形峭度低：这可能意味着分离不充分。
可以尝试调整流动相的组成、pH值或流速来改善
分离。
3. 噪音较大：可能是由于进样器或检测器的问题引起的。
可以检查进样器和检测器的状态，并
确保它们正常运行。
4. 色谱柱寿命较短：这可能是由于样品中的杂质或试剂导致的。
可以尝试优化样品的准备方法，如前处理或过滤样品，以减少对柱的损害。
5. 流动相配制错误：这可能导致峰错位或分离不良。
可以仔细检查流动相的配制方法和溶剂的
纯度，确保配制正确。
6. 峰定量不准确：可能是由于进样量不准确或方法参数设置不合适引起的。
可以检查进样量的
准确性，并根据实际情况调整仪器参数。
7. 泵压过高：可能是由于管路堵塞或柱封堵引起的。
可以检查管路是否通畅，并根据需要更换
柱或清洗柱。
8. 柱渗漏：可能是由于柱端部密封不良或柱老化引起的。
可以检查柱端部的密封情况，并确保
柱处于良好状态。
针对以上问题，及时检查、调整和维护HPLC设备，并根据具体情况进行修复或更换，可以提
高HPLC分析的效果和结果的准确性。
HPLC柱效测定
HPLC柱效测定
以第一主数据为例
n=)2=2=201.881
柱长25cm
H===0.001238
思考题
1、高效液相液相色谱采用3~10微米的固定相有何优点?同时它又给实验带来什么问题?如何克服？
答：这个是从色谱理论H-u曲线推导出来的结果.在100kg压力左右,5微米的柱效最高.但随加工制造技术的提高,更高压力的泵如400kg,也能够大量的普及.而在400kg左右,1-3微米的固定相柱效更高,所以在HPLC的基础上又有UPLC仪器了.
2、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物,为什么?
答：不是理由有2 ，第一是并不是所有的有机物都有强的特征紫外吸收，只有特定的集团会有这样的情况。
第二是有频率相近的吸收峰的物质很多，不能完全区分开来。
3、若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件色谱柱？
答：色谱柱使用时间长了，柱效会降低，会影响到分离度的，改善方法是更换新的色谱柱。
如果已经是新的色谱柱了，分离度还不好，那可以采用更长一些的色谱柱，也会增加分离度；流动相的调节，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，分离效率会不一样，这要针对要检测的成分具体情况进行分析确定；改变柱温，相同条件下升高柱温，会增大色谱柱的分离能力而提高分离度。
提高柱效的关键是什么？填料与填装！
提高柱效的关键是什么？填料与填装！色谱柱的关键内容是制备出高效的填料，这些填料制成的色谱柱既要有好的选择性，又要有高的柱效，要提高柱效是现代高效液相色谱的又一关键问题，所以填料和装柱技术是关键问题。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，其分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。
但是色谱填料的选择范围很宽，分别为聚合物填料、硅胶基质填料和其它无机填料。
要选择合适的色谱填料，必须对此有一定的认识和了解。
色谱填料的选择1、硅胶基质填料硅胶是HPLC填料最普遍的基质。
除了具有无机物基质共有的高强度，还提供了一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合范围很广的配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱。
硅胶基质填料适用广泛的溶剂，从极性到非极性。
其缺点是在水溶性碱性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
（1）正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其它具有极性官能团,如胺基团(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(Methylene Chloride)等。
（2）反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
2、聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其优点是在PH值为1～14均可使用。
高效液相色谱（HPLC）柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(Y1/2＋Y1/2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； Y1/2 与Y1/为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件出峰次序样品组成1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：苯基柱，柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器(二极管阵列检测器)；检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
柱效测定以及影响因素
4.检测系统的滞留体积（系统死体积） 外体积（Vext）应尽量保持足够的低。这一体积指的是上游体积（从上样点到柱体之间）和下游体积（从
柱底到检测器）之和。与扩大样品体积的效果类似，不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱效柱效。因此用于
、
检测的管路应尽可能的短，并且内径应最小且不会造成过大压降。 作为一个普遍的经验法则，一个生物过程层析使用的典型层析柱的柱效检测应保证外体积小于柱体积的 5%，
在层析柱中保留时间缩短，根据范德姆特方程中 C 代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加。值得一提的是图中的
峰的对称性随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性。允许标准
h≤ 3 保证了合适液流速度，从而可以得到最佳的理论柱效柱效。颗粒大小（扩散的特征长度）是决定最佳流速的
、
停留时间（停留体积）
折合的塔板高度
h=HETP/d/P
对称性 As
**达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对
应的停留时间（停留体积）。
相对峰宽通常用理论塔板（N），理论塔板 数（HETP）或折合为塔板高度（h）来迚行 描述：
() σ
σ ()
对称因子 As 描述了与理想高斯峰形状的偏 差，通过对 10%峰高处的峰宽迚行计算得到：
柱效测定以及影响因素
柱效（column efficiency ）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素(操作参数)所决 定的分离效能。通常用理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等表示。 柱效 是衡量色谱柱性能的一项主要指标，柱效越高，分离能力越强。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
示踪物质浓度
半峰高峰宽 Wh 时间（洗脱体积 V）
如想获得最佳柱效则需使外体积小于 3%。在测定柱效前最好测定系统外体积。此外，还需要对柱效检测中的保留 体积迚行记录，以便和填充床以及柱本身的标称保留体积迚行比较。若保留体积进大于预期，则提示检测物和层析 介质之间可能存在相互作用，以及柱外检测系统存在滞留体积。当检测设置一经确立，层析柱安装完毕，需要迚行 连续三次检测以确认该方法的可重复性。
精华HPLC最实用的30个常见问题及对策(二)
鉴于HPLC在全行业运用越来越广泛，每一个实验室分析人员都应该熟练掌握并应用HPLC，为此，小编整理了约30条常见HPLC故障及对策分析方案，分为三天推送，今天是第二篇。
昨日帖子有误故而删除，为您造成不便，敬请连接。
本文针对HPLC使用常见故障进行了较全面的分析,如输液泵中的单向阀、泵垫圈、色谱柱、检测器的常见故障,并结合日常工作实际,提出了一些可参考的做法和解决对策。
以便使用者能及时注意所述问题,做到有问题及时解决,这样既能大大延长仪器的使用寿命,又能使仪器的性能得到最大限度的发挥。
HPLC常见故障因素不规则的基线噪音产生原因①漏液。
②流动相污染、变质或由低质溶剂配成③流动相各溶剂不相溶④检测器/记录仪电子元件的问题⑤系统内有气泡⑥检测器内有气泡⑦流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。
）⑧检测器灯能量不足⑨色谱柱填料流失或阻塞⑩流动相混合不均匀或混合器工作不正常以上相应解决方法①检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要，更换密封。
检查流通池是否漏液。
②检查流动相的组成。
③选择互溶的流动相④断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
⑤用强极性溶液清洗系统⑥清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池⑧更换灯⑨更换色谱柱⑩维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置保留时间漂移的故障排除保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。
前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。
将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。
如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。
事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。
保留时间漂移的几种最常见的原因如下：一、色谱柱平衡如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。
色谱小讲堂013-影响液相柱柱效测试结果的因素
色谱小讲堂013-影响液相柱柱效测试结果的因素校测试方法可以根据每根色谱柱附带的测试报告（Performance Report）提供的方法条件进行试验。
通常实际测试结果比色谱柱所附的测试报告结果偏低是正常的。
因为Agilent测试塔板数的HPLC系统是专门设计的，整个系统扩散体积非常小。
如果测试结果与报告中有很大不同，很大可能是由于色谱系统配置以及死体积等因素的影响。
通常需要考虑的因素有以下几方面：1.不同柱外体积的影响柱外体积是指“额外”或“外部”（相对于色谱柱）体积，是系统的一部分，尤其是各LC 部件、色谱柱之间的连接管线体积、进样体积和流通池体积。
下面的例子就显示了柱外体积的影响（图一）。
当使用4.6×30mm短柱时，10µL的柱外体积可以得到良好的分离结果，当加上一段管线形成50µL的柱外体积，色谱峰变宽、分离度降低。
在向系统中添加体积不明的管线时，这种情况经常发生。
添加一段太长的管线，或内径较大的短管时，会使高柱效色谱柱的分离度变差。
图二展示了不同内径的管线对色谱峰展宽的影响。
管线内径越大，样品谱带在管线内发生的扩散也就越大，色谱峰展宽也就越严重。
原则上，系统的最大柱外体积（管线体积、进样体积和检测器体积）不应超过柱体积的10%。
图二2.管线和色谱柱连接的接头是否合适图三您需要使用与色谱柱匹配并连接恰当的管线和接头。
如图三所示，连接不恰当的接头，会造成色谱峰的展宽。
比如，如果密封圈位置不正确，管线从密封圈伸出过长，会使密封圈与色谱柱入口螺纹产生空隙而发生漏夜；管线从密封圈伸出过短，将产生一段死体积，形成混合腔，导致柱外体积增加，使色谱峰展宽。
故一定要使用正确的接头，并保证色谱柱末端接头位置正确。
上篇讲述的在液相柱柱效测试过程中，不同柱外体积以及管线和色谱柱连接的接头是否合适两大因素对结果的影响，接下来，在下篇中会继续分析在测试过程中通常需要考虑的其他因素。
HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈
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HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈(zhuan)HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。
对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。
清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。
更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四) 出现肩峰或分*1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 同前(四)45.同前(四)3 5.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
液相色谱法柱效
液相色谱法柱效
液相色谱法（HPLC）是一种高效的分离和分析技术，它可以通过改变柱效、流动相和检测方式等多种因素来实现高分离度、高分辨率和高灵敏度的分析。
柱效是指分离柱的性能，包括填充物的性质和尺寸、管径、长度和形状等因素。
柱效的选择应根据分析需要和样品特性来确定，以实现最优的分离效果。
柱效的改变会影响到分离的分离度、分辨率和流速等因素，因此应进行综合考虑和优化。
液相色谱法的柱效选择和优化是保证分析结果准确性和可靠性的重要因素之一。
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色谱柱柱效降低怎么办？看完这篇文章你就知道怎么解决了!
色谱柱柱效降低怎么办？看完这篇文章你就知道怎么解决了！色谱柱的柱效能是评价色谱性能的一项重要指标，混合物能否在色谱柱中得到分离，除取决于选择合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填状况等因素有关。
在一定的色谱操作条件下，色谱柱的柱效可用理论塔板数或理论塔板高度来衡量。
一般说来塔板数愈多，或塔板高度愈小，色谱柱的分离效能愈好。
如何提高HPLC柱效要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
以下介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。
1、提高液相色谱柱柱效的方法要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
（1）降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
（2）减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
（3）减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
（4）选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
（5）适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
（6）尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算，对自己分析方法不断的研究和实践，才能找到最佳的工作条件。
2、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题我们也应记住柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能，对大多数色谱工作者来说，柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力，而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。
不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。
这些参数包括：洗脱液的成分和粘度及其线流速，测定塔板数所用的溶质、温度、柱长、填料装填方式、颗粒度、还有所选用的测量和计算方法。
而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。
3、几种测量和计算柱效值的方法因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。
因此计算柱效（以理论塔板数n为单位）的公式习惯上定义为:式中tR为色谱峰的保留时间；σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差；a是和峰高（从测峰宽的基线量起）有关的常数；ωb是峰宽，表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。
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谈有关HPLC柱效的问题
作者：赖俊雄
作者单位：海南省药品检验所,海口,570102
刊名：
海南医学
英文刊名：HAINAN MEDICAL JOURNAL
年，卷(期)：2002,13(3)
被引用次数：1次
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本文链接：/Periodical_hainanyx200203065.aspx。