蛋白质电泳技术介绍

的一部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率
比前者高一个数量级。
载体两性电解质（CA）应具备的条件
(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力 (2)在等电点必需有足够高的电导 (3)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用 透析或凝胶过滤法分开。 (4)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。 (5)应不与分离物质反应或使之变性。
操作流程
制胶 装管 装槽，电泳 剥胶 固定 测定pH梯度
具体步骤
1. 配胶 2. 装管
每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆
盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂
直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根
玻璃管的容量约为1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm处，用 注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱 顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水 封下的折光面。
5. 固定
取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没
过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的 白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度 “L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长 度“L’”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计
上用280nm或238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的
3 在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝
胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面）
4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连 续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟
上样
按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板
间隙厚度不同，选择加入样品量。 电泳 打开电源将电压调到80v（一般15min左右），待样品跑过压 缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。
染色 将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝 ），用摇床摇2－3h
脱色
待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉
，可以用Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、
估算蛋白浓度。
等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF)
基本原理
优缺点
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自 由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等电点 而且能将不同等电点的混合生物大分子进行分离 和鉴定 。
缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解 或发生变性的蛋白。
双向电泳Fra Baidu bibliotek
（2-D electrophoresis）
基本原理
第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离 （将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合， 在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯 酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等电点； 随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。
2 蛋白质加样
4 蛋白质移动到它 们各自的等电点， 不同等电点的蛋 白质被分开
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+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
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pH梯度构建
载体两性电解质pH梯度 (Carrier ampholytes pH gradients， CA):在电场中通过两性缓冲离子建立的pH梯度。 固相pH梯度（immobilized pH gradients， IPG） 将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质
测量和计算。
6. 测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH 胶条的长度“L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和
小刀依次将胶条切成10mm长的小段，分别置于小试管中，
加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的 带细长pH复合电极的pH计测出每管浸出液的pH值。
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图解
第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS-PAGE
水平方向：反映出蛋白在pI上的差异 垂直方向：反映出它们在分子量上的差别
2D电泳操作流程
样品制备
分离
染色
图谱分析
挖点 酶解 点靶
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向
第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
4.胶条的平衡 4.1冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。
4.2配制胶条平衡缓冲液 I 。
4.3吸去胶条上的矿物油及多余的样品。
4.4第一次平衡。振荡15分钟。
4.5配制胶条平衡缓冲液 II 。
4.6第二次平衡 ，振荡15分钟。 4.7吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
4.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓
4. 剥胶 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻 轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端
注入H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻
挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极
端为“尾”，若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为正，
碱 性端为负。
冲液。
5.第二向SDS-PAGE电泳
6.凝胶的染色及检测 7.PDQuest软件分析 8.质谱鉴定
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电泳技术介绍
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE
(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)
基本原理
1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二
级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二
硫键断裂。
2.蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理，可解聚
等电聚焦电泳 ，是利用有pH梯度的介质分离
等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨
率可到达0.01pH单位，因此特别适合于分离分
子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
适用: 1.研究蛋白质微观不均一性
2.测定蛋白质等电点
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3 形成电场
1 用电流在凝 胶溶液中建 立一个稳定 的PH梯度
3. 装槽和电泳 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端 向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度
，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入
500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹没各 管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正 极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时 ，至电流近于零不再降低时，停止电泳。
蛋白鉴定
具体步骤
1.样品制备
2.固相预制胶条的水化
3.第一向等电聚焦 3.1. 衡。 3.2. 3.3. 在聚焦盘或水化盘中加入样品。 去除预制IPG胶条上的保护层 。 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温平
3.4. 3.5. 3.6. 3.7.
将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中 。 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 对好正、负极，盖上盖子。 设置等电聚焦程序。
成亚基,加入SDS，改变了蛋白质的构象。
3.各种SDS-蛋白质复合物均带相同密度的负电荷，
其荷电超过了原蛋白质，消除了不同蛋白质的荷
电差异。
图解
混合大分子 电泳
多孔凝胶
操作流程
制胶 上样 电泳 染色 脱色
具体步骤
制胶 1将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好
2 按照配方制备分离胶，TEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶