细菌脱氢酶活性的测定

细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定

摘要休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，是测定细菌脱氢酶活性的良好材料。本实验用E.coli cVcc249菌株作为实验材料，制备其休止细胞，再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的α-酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度，研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。在本次实验中，所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑盐还原法，噻唑盐宜与反应生成的还原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，可溶解于二甲亚砜中，再根据其颜色变化的深浅，用分光光度计测其OD510nm值，即可表示细菌脱氢酶的活性。

Abstract

The resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration, the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, α-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of α-ketoglutaric acid and sodium citrate perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purple crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.

关键词休止细胞脱氢酶活性α-酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐

1.引言

1.1 休止细胞

1.1.1 休止细胞的定义及特性

休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。

它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长，多数可以在低温保存一定时间而不失活。另外休止细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制，是研究无细胞制剂等的好材料。

1.1.2 休止细胞的制备及注意事项

制备：

a.培养细胞，以固体或液体培养，收获比较年轻的细胞，制成细胞悬液；

b.洗涤细胞，以适量洗涤液洗涤细胞，4000rmp离心10min，保留沉淀细胞，重复2次；洗涤的目的是为了洗掉细胞表面的营养物质。

c.悬浮细胞，以适量洗涤液将细胞悬浮起来，即得休止细胞悬浮；

d.保存细胞，将细胞悬浮液保存在普通冰箱中，1~2周不会失活。

注意事项：

a.保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活动和显示其原有的代谢和生长性能。因此，保藏菌种的活化必须使用保藏菌种时所使用的相同的培养基和培养条件，或使用以保藏菌种生长和代谢最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和生理特性。以便接下来制备休止细胞。

b.洗涤细胞时，菌落一般在培养基表面粘附不紧密，用生理盐水可以轻易洗涤下来。倘若有部分菌落仍未脱落，可用接种环轻轻刮擦，注意尽量不要碰触培养基而使其进入洗涤液中。

c.在液体中静置培养和振荡培养时，一般用离心机来收集菌体。离心机收集细胞的条件一般随微生物的种类而不同，细菌一般用5000rmp，10min或者9000rmp，5min就做够了。然后洗涤以出去所收集细胞中的培养基，离心沉淀的细胞在加入洗涤液后，用玻璃棒小心搅拌使成均一的悬浊液，再离心分离。洗涤后，一般再悬浮在洗涤液中保存，有时也可直接保存除去上清液的沉淀细胞。

1.1.3 休止细胞的应用

a.休止细胞是制备无细胞制剂及其材料的原料。由于休止细胞的制备比较容易标准化，所以可用它定量地进行生理生化或代谢过程的研究。例如本实验中应用E.coli cVcc249的休止细胞测定酶活。