_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用

第9卷第18期·总第122期

2011年09月·下半月刊

87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※

陈亮1陈跃平1,2*

摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。

关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述

doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03

骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。

1 骨髓间充质干细胞多向分化特性

多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。

1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。

1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。

1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。

※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011）

2 南方医科大学在读博士（南宁530011）

*通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法

骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。

3 BMSC的表面标志及鉴定

3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。

3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸

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性磷酸酶及苏丹黑阴性；流式细胞分析方法，鉴定BMSC 这种细胞群的同源性或者纯度，Haynesworth 的研究小组进行流式细胞分析显示，原代培养细胞同源性可达到95%～98%，第2代以后可达100%[10]。除了采用以上联合方法鉴定外，Martinez 等[11]通过逆转录2聚合酶链反应检测神经节苷脂GD 2（neural ganglioside ，GD 2）合酶表达的方法证实，在新分离的骨髓和体外扩增培养的骨髓中，BMSC 是惟一表达GD 2的细胞，因此，GD 2成为可以区分MSC 和其它骨髓细胞的特异性标志物。Gang 等[12]也发现，阶段特异性胚胎干细胞抗原4 也可以用来鉴定BMSC ，这也为提高BMSC 的分离鉴定的效率和特异性提供了一条新的途径。

4 骨髓间充质干细胞在骨科中的应用

4.1 治疗骨缺损 已有不少学者报道采用向骨折和骨缺损局部直接注射骨髓的方法来治疗骨缺损，效果良好，但存在细胞流失、不能形成有效的细胞浓度梯度等问题。随着组织工程兴起，将干细胞复合支架材料植入能有效防止流失，支架材料还能提供细胞粘附及生长微环境[13]多种细胞因子有高效成骨活性，用于直接注射或复合载体材料回植修复骨缺损可加强干细胞的修复作用，已有动物实验研究报道获得了很好的效果。祝联等[14]BMP 7转染的骨髓基质干细胞与珊瑚复合，经地塞米松、β磷酸甘油钠等体外诱导培养，回植修复羊股骨缺损结果显示促进骨再生效果满意。Partridge 等[15]研究BMP 2基因转染的骨髓基质细胞复合骨组织工程载体聚乳酸-羟基乙酸和聚乳酸支架诱导成骨，电镜、组织学和X 射线检测均证实细胞能附着于载体并在其上增殖，在体内外成骨良好。

4.2 治疗股骨头坏死 近期研究发现，股骨头缺血坏死发病机制可能与成骨细胞及BMSC 的功能下降有关。髓芯减压术是治疗股骨头缺血坏死前期的常用方法之一，但修复效果有限，其中一个重要制约因素就是BMSC 太少。BMSC 含有包括成骨细胞在内的许多充质细胞，联合髓芯减压术可以直接补充减少的细胞并发挥其活性。Hemigou 等[16]髓芯减压加自体骨髓移植治疗股骨头坏死的一项前瞻性研究表明经过5～10年的随访，对早期股骨头坏死疗效良好。Gangji 等[17]比较了髓芯减压术加BMSC 移植与单纯髓芯减压术治疗的疗效，发现髓芯减压术加BMSC 移植治疗早期股骨头坏死的疗效明显优于单纯髓芯减压术。章建华等[18]用髓芯减压加自体多能干细胞、脱钙骨基质植入治疗早期股骨头坏死取得较好疗效。以上实验表明，应用髓芯减压术联合BMSC 移植与单纯髓芯减压术相比疗效显着改善。

4.3 治疗骨不连 骨折延迟愈合与骨不连是骨科常见问题，目前延迟愈合与骨不连尚无法截然分清。治疗可分两大类：开放手术与闭合治疗。开放手术加自体骨移植疗效确切，可尽早恢复肢体功能，因此是治疗金标准。但手术创伤大、严重并发症、供区疼痛，尤其局部条件不具备则治疗更加棘手，使其临床应用受到制约。利用BMSC 的成骨功能的闭合治疗，可有效绕开这些难题，已被应用到实际工作中。袁进国等[19]通过密度梯度离心法分离纯化自体BMSC ，经皮移植治疗肱骨干及胫骨干骨折骨不连，并与自体髂骨移植进行疗效比较，结果显

示经皮自体BMSC 移植取得良好疗效，比传统植骨治疗有明显优势。

4.4 修复软骨缺损 已有学者采用明胶海绵、海藻酸盐载体等负载自体BMSC 移植于关节软骨损伤区，可促进软骨缺损的快速修复，恢复关节软骨的结构和功能。最近，韩志军[20]BMSC 作为种子细胞，转化生长因子β1为诱导因子，以聚羟基乙酸为三维支架，经过8～10周的体内培养，支架材料基本降解，成功构建了具有一定弹性、韧性的组织工程化软骨组织，并得到组织学证实。姚剑平等[21]将BMP 2以400μg/L 溶于透明质酸后，与第三代骨髓基质细胞构建支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下，术后12周对修复组织行大体、组织学及免疫组化染色观察显示形成大量融合成片的细胞外基质，可见胞浆和胞外大量糖胺多糖沉积，Ⅱ型胶原免疫组化染色呈强阳性，可见胞浆及细胞周围大量棕黄色染色，形成大量成熟的软骨细胞。采用小鼠骨髓间充质干细胞作为种子细胞来源，加入地塞米松、维生素C 、胰岛素和不同浓度的BMP 13体外诱导2周，可促进小鼠骨髓基质细胞向软骨细胞表型分化。RT-PCR 和免疫细胞化学法检测不同时期Ⅱ型胶原、SOX 9表达，阿尔辛蓝染色检测蛋白多糖。结果表明细胞形态由梭形变为多片形，阿尔辛蓝染色成蓝色，Ⅱ型胶原、SOX 9 mRNA 的蛋白阳性表达在第4天开始出现并不断升高；阿尔辛蓝染色结果显示BMP 13诱导细胞分泌蛋白多糖基质[22]。这表明BMP 13可以定向诱导小鼠骨髓干细胞的软骨分化并具有分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖基质的功能。可见BMSC 移植技术治疗软骨损伤具有良好的应用前景。 4.5 修复脊髓及神经损伤 有研究表明脑源性神经营养因子基因修饰BMSC 对周围神经损伤后再通及功能恢复有促进作用，而且BMSC 与脑源性神经营养因子有协同作用，可望成为治疗周围神经损伤的有效方法[23]。对于脊髓损伤，实施椎板减压术后将BMSC 注射在受损脊髓处运动和感觉功能均有不同程度恢复，表明将BMSC 移植应用于脊髓损伤也能取得令人鼓舞的结果，并认为BMSC 移植至少在3个方面促进脊髓修复：①提供新的神经细胞，补充缺失的神经细胞，促进再神经化；②填充损伤区防止瘢痕组织和胶质细胞过度增生；③移植细胞自身分泌及促进周围神经细胞分泌神经营养因子，帮助神经修复。

5 临床意义及应用展望

BMSC 取材方便、副作用小、无排斥反应，具有公认的多向分化潜能，在某种药物或细胞因子诱导下可定向分化为骨、软骨、肌腱等组织，鉴于BMSC 具有很强的可塑性，使得其成为组织工程中种子细胞的最佳选择。目前，BMSC 已经用于骨及软骨疾病[24,25]，心脏疾病[26]，肝脏疾病[27]，伤口及肢体缺血治疗中[28]。 参考文献

[1] Ouyang HW, Cao T, Zou XH, et al. Mesenchymal stem cell sheetsrevitalize

nonviable dense grafts: imp lications for repair of large2bone and tendon defects [J]. Transp lantation, 2006,82(2):170-174.

[2] 舒朝锋,崔磊,刘伟,等.人骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验

研究[J].中华创伤骨科杂志,2004,6(2):194-198.