植物的病毒检测技术

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植物病毒鉴定方法有

植物病毒鉴定方法有

植物病毒鉴定方法有
植物病毒鉴定是一种诊断学技术,用于识别植物病毒,鉴定植物病毒是防治植物病害的关键。

目前,植物病毒鉴定在植物病理研究、病原鉴定和其他生物技术领域都得到了很高的应用价值。

植物病毒鉴定可分为微生物学分析、化学分析、生物学分析和分子生物学分析4个方面,以尽可能准确地评估病毒引起的病害发生可能性。

1. 微生物学分析:主要检测病原体的传播性的分布特征,以及病原物的特异性和症状,如植物病理学、扫描电镜网织菌病毒鉴定等。

2. 化学分析:检测病原体的化学物质,如叶绿窿面农物质、唾液核酸酶鉴定等。

3. 生物学分析:采用分子大小分离技术,如集群分析、放射致性等,检测病原体的细胞结构特征。

4. 分子生物学分析:采用分子分析来识别和鉴定不同种类的病毒,如质粒克隆鉴定(PCR)、单克隆抗体试验、DNA杂交等。

植物病毒鉴定可以有效地准确定位病原,及早识别病原体,起到重要的防治作用。

因此,正确无误地使用植物病毒鉴定技术对植物病害的防治至关重要。

植物病毒的鉴别和检测方法研究

植物病毒的鉴别和检测方法研究

植物病毒的鉴别和检测方法研究植物病毒是影响植物健康和产量的主要因素之一。

对于农业和园艺领域,发现和鉴别植物病毒是至关重要的。

然而,由于病毒的微小尺寸、繁殖速度快且具有高度变异性和适应性等特性,在不加以特殊处理的情况下很难鉴别和检测。

因此,开发高效的植物病毒鉴别和检测方法已成为当前研究热点之一。

一、植物病毒的鉴别方法1. 细菌性斑点病法(Bacterial Spot Test)该方法通过施加细菌性斑点病感染物质,并观察植物叶片上斑点的形成来确定是否感染病毒。

该方法操作简单、直观易懂,但只能用于一些植物病毒的初步鉴定,无法确定所感染的具体类型和种类。

2. 酶联免疫吸附检测法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)该方法通过利用特定的抗体与病毒抗原反应,形成免疫复合物,再用酶作为信号反应物进行检测。

该方法的优点在于检测灵敏度高、精准度高、直观易懂,同时适用于多种植物病毒的鉴别。

但是,该方法对于一些种类不太熟悉的病毒,需要提前准备特定的抗体和病毒抗原,且操作过程比较繁琐。

3. 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)该方法通过利用特定引物和酶,扩增目标病毒基因序列,并通过凝胶电泳等方式进行验证和鉴别。

该方法优点在于操作快速、准确度高、适用范围广,可以扩增低浓度的病毒Ap发现,同时还可以检测多个病毒基因序列,具有一定的实用性。

但是该方法的缺点在于设备成本高,且无法确定扩增物中病毒成分的比例。

二、植物病毒的检测方法1. 病毒杂交法(Virus Hybridization)该方法通过利用核酸探针与目标病毒中特定序列的杂交,形成稳定的杂交产物,并通过凝胶电泳等方式进行检测。

该方法优点在于具有较高的检测敏感性和特异性,同时可以定量分析病毒的含量,而且不受病毒变异性的影响。

该方法的局限性在于需要提前准备特定的核酸探针,对于多个病毒的检测需要分别合成多个核酸探针,操作较为繁琐。

植物病毒病检测方法

植物病毒病检测方法

植物病毒病检测方法植物病毒病是农业生产上一种重要病害,严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂,对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。

植物病毒学历经近百年的发展,植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。

常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。

1.4.1侵染力测定法侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上,根据侵染力的大小定量。

它的灵敏度在所有定量法中是比较高的,而且是其他定量法的基础。

设计一种新的定量法,如果不经过侵染力的验证,将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。

侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉-碘斑法、系统感染率的测定法等。

侵染力测定多用粗汁液来接种,为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围,须用缓冲液稀释接种物。

局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟(Nicotiana glutinosa)接种叶片上引起局部坏死斑点,在一定的病毒浓度范围内,所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。

这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础(田波,1987)。

所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法,但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。

一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外,还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。

淀粉-碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时,采用此法。

Holmes(1931)发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块,但不能用于计数。

将这种接种叶用95%乙醇加热到80℃固定,然后用I2和KI混合液(10克I2,30克KI,1500毫升H2O)染色时,则侵染点处出现淀粉-碘的蓝色反应。

当下午采摘叶片,褪色过夜,然后用碘液染色,则侵染点较周围组织着色浅;当采摘叶片前,植株先在黑暗中放几个小时,再用碘液染色,则侵染点组织着色深。

这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成,也降低碳水化合物从光合组织中的运出。

植物检疫一些重要检验方法的原理和优缺点

植物检疫一些重要检验方法的原理和优缺点

植物检疫一些重要检验方法的原理和优缺点植物检疫是农业生产中非常重要的一个环节,它可以有效地防止病虫害的传播,保障农作物的健康成长。

而在植物检疫过程中,一些重要的检验方法也是必不可少的。

那么,这些检验方法到底是怎样工作的呢?它们各自又有哪些优缺点呢?下面就让我们一起来了解一下吧!我们来了解一下植物病原菌检测的方法。

这种方法主要是通过观察植物的生长状况、叶片颜色、茎干硬度等特征来判断是否感染了病原菌。

这种方法的优点是操作简单、成本低廉,而且可以在现场进行快速检测。

但是,它的缺点也比较明显,那就是只能对表面症状进行初步判断,无法深入了解病原菌的内部情况,因此可能会漏检或误判。

接下来,我们再来了解一下植物真菌毒素检测的方法。

这种方法主要是通过采集植物样品后进行实验室分析,从而判断是否含有真菌毒素。

这种方法的优点是可以准确地检测出真菌毒素的存在与否,对于保护消费者健康具有重要意义。

但是,它的缺点也比较明显,那就是需要较长时间的实验室处理过程,且成本较高。

我们再来了解一下植物疫病病毒检测的方法。

这种方法主要是通过观察植物的生长状况、叶片颜色、茎干硬度等特征以及对植物组织进行切片染色等方式来判断是否感染了疫病病毒。

这种方法的优点是可以深入了解病原体的内部情况,对于诊断和治疗具有重要意义。

但是,它的缺点也比较明显,那就是操作复杂、成本较高,且需要较长时间的实验室处理过程。

不同的植物检疫检验方法各有优缺点。

在实际应用中,我们需要根据具体情况选择合适的方法进行检测,以确保植物检疫工作的顺利进行。

我们也需要不断地探索和创新新的检验方法和技术,以提高植物检疫的效率和准确性。

只有这样,我们才能够更好地保障农作物的健康成长和人们的食品安全。

植物病害的快速检测

植物病害的快速检测

植物病害的快速检测植物是人类生活中不可或缺的一部分,它们不仅是我们的食物来源,更是环境中的重要组成部分。

然而,植物在生长过程中也会遭受各种病害的威胁。

植物病害不仅使得产量降低,还可能对环境造成危害。

因此,快速检测并及时识别植物病害变得尤为重要。

目前,植物病害的快速检测技术已经有了很大的发展。

以下会根据不同的检测方法进行分章介绍。

一、生物学检测方法生物学检测方法是利用生物学技术的手段,通过对植物病原菌的生理生化特性、形态学特征等进行研究,以达到快速检测的目的。

其中,酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的生物学检测方法。

ELISA技术可以在病原菌分泌的外膜蛋白、产生的抗原等生物学产物中迅速检测出相应的抗体。

该方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点。

因此,ELISA技术已经成为工业化生产中检测病原菌的常用技术。

二、分子生物学检测方法分子生物学检测方法主要是利用分子生物学技术手段,对植物病原菌的基因组进行检测。

其中,聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR技术是常用的分子生物学检测方法。

PCR技术是一种利用酶扩增DNA的产物的方法,它可以在一个反应体系中扩增大量的DNA。

PCR技术的快速检测特点是适用于少量DNA标本,而且检测速度快,灵敏度高,可以检测到微量量的目标序列。

PCR技术在生物检测和医学检测等领域得到了广泛应用。

实时荧光定量PCR技术是一种利用荧光探针来检测PCR反应产物的方法。

该技术通过对PCR反应体系中的荧光信号进行实时监测,可以快速、准确地检测植物病原菌。

实时荧光定量PCR技术具有检测速度快、灵敏度高、准确度高等优点,因此在疫情监测、病原检测等领域得到了广泛应用。

三、纳米技术检测方法纳米技术检测方法是指利用纳米技术通过制备纳米结构来检测植物病原菌,其中,纳米结构材料可以是纳米粒子、纳米管和纳米线等。

纳米技术检测方法具有高效、快速、便携等优点,已经成为植物病原菌检测领域的重要技术。

植物病毒检测技术研究进展详解

植物病毒检测技术研究进展详解

植物病毒检测技术研究进展刘茂炎摘要:随着现代技术的发展特别是分子技术的发展,鉴定和检测病毒的方法越来越多,也越来越精确快速。

以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定,其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的;于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。

不论怎样的方法技术,都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。

在此基础上,甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。

本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。

关键词:植物病毒;检测技术;PCR病毒在生物学上特征(如病毒的理化性质,包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等)以及在寄主上的反应(如寄主范围、症状表现、传播方式等)是对病毒最直观的认识。

常规的对植物病毒的鉴定检测方法有:生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。

生物学测定依据病毒的侵染性,观察寄主植株或其它生物的症状表现;血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础;电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同;分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。

1.生物学鉴定最直接的方法是目测法,直接观察病毒对植物的病害症状。

如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV),病害症状为叶上出现花叶症状,生长陷于不良状态,叶常呈畸形;玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。

目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。

1929年美国病毒学家霍姆斯(Holmes)用感病的植物叶片粗提液接种指示植物,2~3天后接种叶片出现圆形枯斑,枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比,能测出病毒的相对侵染力,对病毒的定性有着重要的意义,这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。

国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus,RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物,该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella),玉米是灰飞虱的桥梁寄主而非最适寄主[2],以玉米作为指示植物可以良好地鉴定RBSDV。

植物体内病原生物的检测技术

植物体内病原生物的检测技术

植物体内病原生物的检测技术随着农业发展的不断深入,植物病害的问题也日益突出。

病原菌、病毒、真菌等病原生物是导致植物病害的主要原因之一,如何及早发现和准确检测这些病原生物,对于及时防控植物病害、保障农业生产和粮食安全具有重要意义。

本文旨在介绍植物体内病原生物的检测技术。

一、PCR技术PCR技术作为一种高灵敏度、高特异性的检测技术,已经广泛应用于植物体内病原生物的检测中。

该技术通过特异引物与待检测的病原生物DNA结合,利用聚合酶链反应技术扩增出特异的DNA片段,从而判断待检测样品中是否存在病原生物。

PCR技术的优点是具有高灵敏度、高特异性、检测速度快等特点,缺点是需要经过特殊培养基种植样品,对于检测样品的纯度要求较高。

二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的检测技术,可以用于同时检测多种植物体内病原生物。

该技术通过将大量的特异性蛋白质固定在芯片上,与待检测的样品中特异性结合的蛋白质相互作用,从而检测样品中是否存在病原生物。

蛋白质芯片技术的优点是具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点,缺点是价格昂贵,需要专业的设备和技术支持。

三、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是一种直接检测待检测样品中未知细菌和真菌等病原生物存在性的方法。

该技术通过将特异性DNA探针标准荧光染料,与待检测样品中的细胞核酸结合,从而识别待检测的病原生物。

这种方法在细胞级别上确定病原生物的变化,可以快速、高效地检测特定病原体。

但是,由于该技术需要采集样品后,进行特殊的处理过程,操作较为复杂,需要一定的技术支持。

四、免疫学检测技术免疫学检测技术是一种检测植物体内病原生物的重要方法之一,基于病原生物和植物之间的免疫反应原理,通过对待检测样品中特定抗体或抗原的结合反应来检测植物体内病原生物的存在。

该技术具有操作方便、灵敏度高、检测速度快等优点,但是该方法容易出现交叉反应的情况。

结语对于检测植物体内病原生物,不同的技术具有各自特点,根据不同的需要选择不同的检测技术来进行检测。

植物病毒病检测及防治的研究进展

植物病毒病检测及防治的研究进展

植物病毒病检测及防治的研究进展摘要:植物病毒病又称植物癌,给农作物及经济作物带来了严重危害,降低了农作物产量和质量,每年仅在我国因病毒感染农作物造成的损失就可达200亿美元,植物病毒病造成的损失是世界人口生存的威胁之一。

关键词:植物病毒病;检测;防治一、植物病毒病的检测技术病毒有两种,以DNA为遗传物质的病毒称为DNA病毒,以RNA为遗传物质的病毒称为RNA病毒,90%的植物病毒是RNA病毒。

早期RNA植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法(指示植物检测法),即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式,将待测带毒植株汁液接种到一株或多株指示植物上,从而观察其在指示植物上的症状。

指示植物是对某一种或某几种病毒和类病毒敏感的植物,感染后可迅速出现明显症状。

传统生物学方法鉴定谱广,操作简单,但需培育大量指示植物,检测速度慢,易受外界环境影响。

随着电子显微镜的出现,病毒的真实形态才得以展现。

电子显微镜观察结果直观、准确,还能观察病毒引起的寄主细胞病变及内含体特征,是深入研究病毒病机理的重要手段之一。

但仪器设备昂贵,制片及操作技术复杂,难以掌握,对操作人员技术水平要求高。

由于每一种植物病毒产生的抗血清各有特性,人们研发一种利用抗原抗体外特异性免疫反应检测植物病毒的方法。

酶联免疫吸附法(ELISA)是通过酶催化颜色反应将抗原抗体结合起来的一种方法,其具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、成本低等优点,可用于大规模样品检测,是血清学中应用最广泛的方法,已成为检测植物病毒的关键技术。

随着生物体遗传物质研究的逐步深入,人们发现通过核酸能准确、快速地鉴定植物、动物和微生物的物种和种群。

基于核酸检测的分子生物学方法比血清学方法具有更宽的检测范围、更高的灵敏度、更强的特异性,适用于大批量样本检测,在植物病毒检测中得到了迅速而广泛的应用。

包括核酸杂交技术(Nucleic acid hybridiza-tion)、反转录PCR技术(RT-PCR)、荧光定量PCR技术(real-timePCR)、DNA微阵列技术(DNA microarray)。

植物病毒的鉴定

植物病毒的鉴定

植物病毒的鉴定植物病毒的鉴定00知识窗2010-12-27 09:24:38阅读5评论0 字号:大中小订阅植物病毒病的识别、诊断及病源鉴定往往比真菌和细菌病害复杂的多。

因为非侵染性病害、遗传生理病害、要害以及植原体引起的病害都与病毒病症状相似。

植物病毒病的诊断包括两个方面:一是对病植物标样作初步检查与判断,确定植物发生的病害是否是病毒病;二是对确信是病毒病的样本作进一步的实验诊断,必要时还须作进一步的病原鉴定。

因此,植物病毒病的诊断通常要依据症状、发生条件、寄主范围、植物生境、光学与电子显微镜观察、传染方式、血清学反应和分子生物学鉴定。

一、病害初步识别首先要区分非轻染性病害于侵染性病害。

要点有:①病毒病有发病中心或中心病株,早期病株点片分布,而非侵染性病害大多同时大面积发生;②发生病毒病的植株多为系统感染,症状分布不均一,新叶新梢上症状最明显,而生理性病害大多比较均一;③病毒病有传染性,非传染性病害物传染扩散的过程;④病毒病害症状往往表现为花叶、黄化、萎缩、丛生等,少数有脉带、环斑、耳突、斑驳、蚀纹等特征性症状。

此外,随着气温的变化,特别是在高温条件下,植物病毒病市场发生隐症现象。

病毒病与其他原生物引起的传染性病害的主要区别是①病毒病害在植物表面绝对无病症,而区别于线虫虫体、细菌菌浓、真菌的子实体等病症的出现;②系统侵染病毒病的症状在新展幼叶上更重,而其它病害大多在老叶上症状更明显。

二、试验室诊断难以识别的病毒病害需要进行试验室辅助诊断,利用不同病毒间生物学特性的差异,如治病症状类型、传播方式、寄主范围等实验结合文献资料,可对常见、多发病还做出诊断;而对于疑难或新病害则需要结合病毒鉴定进行诊断。

实验室诊断常用的方法有鉴别寄主、传染实验、显微镜(光学、电子)观察、血清学检测和核酸杂交等。

(一)鉴别寄主诊断鉴别寄主(indicator)是用来鉴别病毒或其株系的具有特定反应的植物。

凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可作为鉴别寄主。

植物病害检测技术研究

植物病害检测技术研究

植物病害检测技术研究近年来,植物病害成为困扰农业生产的一个难题,特别是由于紫外线、臭氧、二氧化碳等环境问题导致的植物病害加速了病害的蔓延。

如何有效地发现和检测植物病害,保障农产品的质量和安全已经成为了一个重要问题。

因此,研究植物病害检测技术成为了农业科学的一个热点。

分子生物学技术检测分子生物学技术是当前最常用的植物病害检测技术之一,这一技术通过分离DNA、RNA和蛋白质等分子生物学方法找出植物病原体,从而诊断出植物病害。

如PCR技术即聚合酶链式反应是一种分子检测技术,在许多植物病害诊断中获得了广泛的应用。

这一技术可以通过扩增DNA、RNA的方法,让低浓度的病原体产生大约数百倍的扩增,从而方便了检测。

PCR技术的应用范围非常广泛,已经抢占了许多检测领域,非常适用于需求高灵敏度、高特异性和高检测速度的场合。

光谱技术检测光谱技术,或称光谱分析技术,是应用电磁波辐射与物质作用的学科,它以电磁波谱为信息源,结合数据处理方法,达到物质的成分分析和特性研究的目的。

当前,光谱技术广泛应用于农业、食品、环境保护等领域。

光谱技术的检测原理是把被检测物质辐射的光,通过光谱仪记录下来,并通过相关的数学方法分析光谱图像,从而确定样品内所含的化学物质成分和结构。

光谱技术在植物病害的检测中也有广泛的应用,其优势在于非接触性和快速检测的优势。

如,可见光和红外光等不同波长的光谱可以用来判别不同病菌引起的植物病害,通过反光谱或者拉曼光谱,可以得到微小样品中的化学成分信息,实现快速、精准的检测。

生物传感器检测生物传感器是一种无线传感器网络技术的发展,是通过生物元件、微电子器件、光电子学和丰富的技术手段组成的先进检测技术,可应用于环境、食品、医学和农业等领域的检测。

生物传感器检测技术的原理是基于生物传感器对不同检测物质的敏感性,将被测物质所产生的信号转化成可量化或可定性的信息。

传感器的核心部分为生物分子,通过与检测样品发生反应,使信号输出部分产生相应信号。

植物病害的快速检测与诊断方法

植物病害的快速检测与诊断方法

植物病害的快速检测与诊断方法植物病害是植物生长过程中常见的问题之一,严重影响了农作物的产量和质量。

因此,快速检测和准确诊断植物病害的方法对于及时采取有效的控制措施至关重要。

本文将介绍几种常用的植物病害快速检测与诊断方法。

一、外部观察法外部观察法是最直观和简单的一种植物病害检测方法。

通过观察植物的叶片、茎、根等部位的形态、颜色、质地和病斑的分布情况等,可以初步判断植物是否受到病害侵袭。

例如,如果叶片出现黄化、褪绿、萎缩、斑点或腐烂等现象,可能是病害导致的。

然而,外部观察法只能提供一种初步的判断,并无法确定具体的病原。

二、免疫学方法免疫学方法是一种常用的快速检测植物病害的技术。

该方法基于植物与病原微生物之间的免疫反应,通过检测病原微生物特异性蛋白质或核酸分子与植物的互相作用来识别和鉴定病原。

常用的免疫学方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法(Western blot)和聚合酶链式反应(PCR)等。

这些方法具有高度的灵敏性和特异性,并可以快速检测出植物病害的病原。

三、基因组学方法随着基因组学技术的不断发展,基因组学方法在植物病害的快速检测与诊断上发挥着越来越重要的作用。

该方法通过对病原微生物基因组的测序和分析,可以鉴定病原微生物的存在和种类,以及其与植物的相互作用。

例如,通过对病原微生物的DNA或RNA进行测序和比对,可以准确地确定病原的种类,并进一步了解其与植物之间的互作关系。

四、图像处理技术图像处理技术是一种新兴的植物病害检测方法。

该方法利用计算机视觉和图像处理算法对植物叶片、茎、根等部位的图像进行分析和识别,从而实现快速检测和诊断植物病害的目的。

例如,通过对受病害侵袭部位的图像进行纹理特征分析和模式识别,可以判断病害的严重程度和类型。

图像处理技术具有非常高的自动化程度和准确性,可以大大提高植物病害的检测效率。

综上所述,植物病害的快速检测与诊断方法多种多样,每种方法都具有其特定的优点和适用范围。

植物的病毒检测技术

植物的病毒检测技术

植物的病毒检测技术植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。

种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。

因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。

最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。

目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。

1 血清学检测方法1.1 酶联免疫吸附测定(ELISA)酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。

该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部,加入欲测试的含病毒的样品,病毒与抗体结合,病毒颗粒被固定,再加入标记的特异抗体和酶的底物,酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比,用此方法可测定出病毒的浓度。

ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。

在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。

1.2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。

所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。

植物病毒分子检测方法概述

植物病毒分子检测方法概述

植物病毒分子检测方法概述邵碧英(福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。

CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。

广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。

1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。

血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。

111 酶联免疫吸附反应(EL ISA)EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。

酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。

该方法已被用于各种植物病毒检测。

后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。

几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。

EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。

112 斑点免疫吸附法20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。

也已用于各种病毒检测。

斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。

113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。

改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。

鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。

病毒植物的鉴定方法有哪些

病毒植物的鉴定方法有哪些

病毒植物的鉴定方法有哪些病毒在植物界中是一种常见病害,能够给农作物的产量和质量带来严重影响。

因此,及早准确地鉴定病毒植物是一项重要的工作。

下面将介绍几种常用的病毒植物鉴定方法。

观察症状法观察病变症状是最常见的病毒鉴定方法之一。

通过观察植物叶片、茎部或果实出现的病变症状,如叶片弯曲、颜色改变、疮痂等,可以初步判断植物是否感染了病毒。

但这种方法只能做出初步判断,不能确定具体的病毒种类。

检测病毒RNA法利用分子生物学技术,如逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和多重逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR),可以检测植物体内是否存在病毒RNA。

通过比对已知的病毒序列,可以确定感染的具体病毒种类,这种方法准确性较高。

酶联免疫吸附试验法酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的病毒鉴定方法。

该方法通过使用特异性的抗体来检测植物体内的病毒抗原,从而确定是否感染了特定的病毒。

ELISA 方法快速、简便,广泛应用于病毒鉴定领域。

电子显微镜观察法电子显微镜观察是一种直接观察病毒颗粒的方法,通过该方法可以清晰地观察到病毒在植物细胞内的形态特征,从而确定植物是否感染了病毒。

虽然这种方法需要昂贵的设备和专业的技术,但是对于一些病毒形态较为特殊的情况非常有效。

检测病毒蛋白法有些病毒感染植物后会在其体内表达一些病毒特异性的蛋白,利用这些蛋白可以进行病毒的鉴定。

常用的方法包括Western blot和免疫荧光法等。

这些方法对于特定的病毒鉴定具有很高的准确性。

综上所述,病毒植物的鉴定方法包括观察症状法、检测病毒RNA法、酶联免疫吸附试验法、电子显微镜观察法和检测病毒蛋白法等多种方式。

在实际工作中,可以根据情况选择合适的鉴定方法,以确保病毒植物的及时诊断和治疗。

植物病毒的识别与防治技术

植物病毒的识别与防治技术

植物病毒的识别与防治技术一、植物病毒的识别技术1.1 基本原理植物病毒的识别主要基于病毒的形态、生物学特性和分子遗传学的方法,其中最常见的方法是通过显微镜观察病毒的形态特征。

1.2 光学显微镜观察光学显微镜可以观察到直径在20-300nm之间的病毒粒子,可以根据病毒的形状、大小和外观特征来初步识别病毒类型。

1.3 电子显微镜观察电子显微镜可以观察到直径小于20nm的病毒粒子,对于一些较小的病毒或病毒颗粒的形态细节较为清晰,因此能够更准确地识别病毒。

1.4 ELISA(酶联免疫吸附试验)ELISA可以通过检测病毒抗原或抗体来进行病毒的识别,该方法具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点,在植物病毒的诊断与鉴定中被广泛应用。

1.5 聚合酶链反应(PCR)PCR是一种通过扩增病毒的核酸片段来进行病毒的检测与识别的技术,其具有高灵敏度和高特异性的优点,尤其适用于对低病毒含量的样品进行检测。

二、植物病毒的防治技术2.1 防治措施2.1.1 防治病毒传播途径病毒主要通过介体、种子、锄耕工具、昆虫等传播途径进行传播,因此可以通过限制病毒的传播途径来防治病毒病害。

2.1.2 育种选育抗病品种通过育种选育抗病品种是一种重要的植物病毒防治方法,通过培育具有病毒抵抗力的品种来控制病毒的传播和病害的发生。

2.1.3 消毒灭菌通过对种子、苗木、工具等进行消毒灭菌,可以有效地防止病毒传播。

2.2 防治技术2.2.1 化学防治化学防治是通过使用化学农药来控制病毒病害,但由于病毒的复杂性和变异性,化学防治并非常见的病毒防治方法。

2.2.2 生物防治通过利用天敌、寄生菌等生物控制剂来防治植物病毒病害,具有环境友好、无污染等优点。

2.2.3 身体隔离将患病植物隔离于健康植物之外,以防止病毒的传播。

2.2.4 栽培管理通过加强植物的养分供应、施肥调节、缓解环境压力等栽培管理措施,能够增强植物的抵抗力,减轻病毒病害的发生。

2.2.5 屏蔽技术通过种植防护网等屏蔽技术,可以减少病毒传播途径,从而有效地防治病毒病害。

植物病毒的主要检测方法

植物病毒的主要检测方法

植物病毒的主要检测方法植物病毒是一种对农作物和植物造成严重危害的病原体,因此及时准确地检测植物病毒对于保障农作物生产的健康至关重要。

现代生物技术的发展为植物病毒的检测提供了更多更精准的方法。

以下将介绍几种主要的植物病毒检测方法:1. 核酸检测法核酸检测法是目前应用最广泛的植物病毒检测方法之一。

通过提取植物组织中的核酸,利用PCR(聚合酶链式反应)技术扩增目标病毒的特定序列,然后进行电泳分析或基因测序,从而确定是否存在目标病毒。

核酸检测法具有高灵敏度和特异性,能够准确快速地对植物病毒进行检测。

2. ELISA法ELISA(酶联免疫吸附试验)是一种常用的免疫学检测方法,也被广泛应用于植物病毒的检测。

ELISA法通过将植物提取物或纯化的病毒蛋白等与特定抗体结合,再通过酶标记的二抗对检测结果进行信号增强,最终通过颜色变化等方式进行病毒的检测和鉴定。

ELISA法操作简便,且可以同时检测多个病毒。

3. 样品接种法样品接种法是一种传统的植物病毒检测方法,通常用于对植物病毒进行初步筛选或确认。

将待检测样品接种在对病毒易感染的植物上,观察接种植物是否出现症状,并通过传统的病毒学鉴定方法确认病毒的存在。

虽然样品接种法操作简单,但对病毒的检测灵敏度相对较低。

4. 蛋白质检测法蛋白质检测法通过检测植物组织中的病毒蛋白来确定病毒的存在与否。

常用的蛋白质检测方法包括免疫印迹法(Western blot)和质谱法等。

这些方法通过检测植物组织或病毒颗粒中特定的蛋白质结构来准确鉴定植物病毒的种类和数量。

结语植物病毒的及时检测对于预防和控制病毒病害具有重要意义。

以上介绍的几种主要植物病毒检测方法各有优势和局限性,可以根据具体的实验需求选择合适的方法进行检测。

未来随着科技的不断发展,植物病毒的检测方法也将不断更新和完善,为植物病毒防控工作提供更多更好的技术支持。

利用培育技术进行各种动植物的病毒检测方法

利用培育技术进行各种动植物的病毒检测方法

利用培育技术进行各种动植物的病毒检测方法对于动植物的病毒检测方法,近年来,人们广泛使用培育技术来加强检测的准确性和效率。

培育技术是一种将待测样品在特定条件下进行培养和繁殖的方法,通过观察培养物的变化和生长情况,可以快速检测出可能存在的病毒。

本文将探讨利用培育技术进行各种动植物的病毒检测方法,并讨论其优势和不足之处。

一、细胞培养法细胞培养法是一种常见的动植物病毒检测方法。

该方法首先从待测样品中提取细胞,并将其培养在含有适当营养物的培养基中。

经过一段时间的培养,如细胞出现异常变化,例如颜色变化、病斑等,就可以判断样品可能存在病毒。

此外,可以使用荧光染料或特定抗体进行标记,以便更准确地观察和鉴定病毒。

细胞培养法的优势在于其对病毒的敏感性较高,能够检测出数量较少的病毒。

此外,该方法还可以提供病毒的纯化和分离,为进一步的研究提供了便利。

然而,细胞培养法也存在一些限制。

首先,培养细胞需要耗费大量时间和资源。

其次,不同的病毒可能需要不同的培养条件,这增加了病毒检测的复杂性和难度。

此外,某些病毒可能无法在体外培养条件下生长,从而导致检测结果的不准确。

二、分子生物学方法分子生物学方法是一种利用DNA或RNA技术进行病毒检测的方法。

其中,PCR(聚合酶链式反应)和RT-PCR(逆向转录聚合酶链式反应)是常用的技术。

通过提取待测样品中的DNA或RNA,并利用特异性引物和聚合酶进行扩增,可以快速、准确地检测出病毒。

PCR和RT-PCR的优势在于其高度特异性和灵敏性。

相较于传统的培养方法,这些分子生物学方法可以更快速、更准确地检测出病毒。

此外,PCR还可以进行定量分析,了解病毒的浓度和变化趋势,对于防控病毒传播具有重要意义。

然而,分子生物学方法也存在一些限制。

首先,这些方法对实验操作技术要求较高,对实验条件的控制也较为苛刻。

其次,PCR和RT-PCR有可能发生假阳性或假阴性结果,需要经过进一步的验证。

此外,这些方法需要在实验室中进行,不具备现场快速检测的能力。

植物病毒的诊断与防治技术研究

植物病毒的诊断与防治技术研究

植物病毒的诊断与防治技术研究植物病毒是一种常见的病害,它可以影响作物的生长和产量。

为了保障作物的安全和高质量生产,科学家们一直致力于研究和发展植物病毒的诊断和防治技术。

一、植物病毒的诊断技术对于植物病毒的诊断,传统的方法主要是通过观察病叶的外部表现来判断是否感染了病毒。

这种方法虽然简单方便,但是结果受到环境和病害本身的影响,易受误判。

因此,现代植物病毒的诊断技术主要包括分子生物学和免疫学两种技术。

其中,分子生物学的技术主要是基于病毒核酸的检测,包括PCR和实时荧光PCR技术等。

这些技术能够准确地检测出感染植物的具体病毒类型和数量,具有快速、灵敏、特异性高的优点。

而免疫学的技术则是基于病毒抗原的检测,包括ELISA和电泳等。

这些技术虽然灵敏度低于PCR,对复杂的样品处理较为困难,但是适用于大规模样品的检测。

二、植物病毒的防治技术除了诊断技术,植物病毒的防治技术也是植物保护的重要方向。

1. 常规防治技术传统的植物病毒防治技术主要是利用化学农药灭杀害虫和病毒。

这种方法虽然比较简单易行,并且在病毒感染初期能够有效控制病害,但是长期使用会导致环境污染和农产品重金属残留,对人体健康产生潜在风险。

2. 新型防治技术随着科技的进步和人们对环保健康意识不断提高,研究人员也在不断探索新型的植物病毒防治技术,如:(1)遗传改良通过利用基因编辑技术和转基因技术,能够改良作物自身的基因,使其对于植物病毒产生抵抗能力。

(2)生物农药与传统的化学农药不同,生物农药是一种生物制剂,可以利用微生物、真菌、昆虫等天然生物原料制成,用于控制害虫和病毒。

生物农药具有无毒性、无污染、安全性高等特点,越来越受到广大农民的欢迎。

(3)物理防治利用灯光、温度、红外线等物理手段来杀灭植物病毒和害虫,无污染、环保等特点,可以作为植物病毒防治的新型选择。

总之,研究和发展植物病毒的诊断和防治技术已经成为农业发展的重要方向。

我们期待科技的不断进步和创新,能够为高品质的农作物生产提供更好的保障。

什么是植物病毒检测

什么是植物病毒检测

什么是植物病毒检测
植物病毒检测是一项重要的农业技术,用于检测植物是否受到了病毒感染。

病毒是一种微生物,能够侵入并破坏植物细胞,导致植物生长发育异常、产量下降甚至死亡。

因此,及早发现和诊断植物病毒感染对于保障农作物的产量和品质至关重要。

植物病毒检测的方法主要包括生物学检测和分子生物学检测两种。

生物学检测通常通过观察植物外部表现(如叶片颜色、形态变化等)来初步判断是否受到病毒感染,但这种方法有时存在主观性和不确定性。

而分子生物学检测则是通过检测植物组织或体液中的病毒核酸来确定是否感染了特定的病毒,具有更加准确和可靠的优势。

常用的分子生物学检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等。

这些方法可以快速、准确地检测出植物是否感染了特定的病毒,并且能够帮助农民采取相应的防控措施,避免病毒进一步传播和危害农作物。

在现代农业中,植物病毒检测已经成为一项不可或缺的技术,可以帮助农民及时发现、诊断和防控病毒病害,保障农作物的产量和质量,实现农业的可持续发展和食品安全。

通过不断改进和应用检测技术,我们可以更好地保护植物生长,提高农作物的产量和质量,为人类的生存和发展做出贡献。

因此,植物病毒检测是一项重要的技术,对于维护农产品安全、农业生产稳定和环境可持续发展具有重要意义。

我们应该高度重视植物病毒检测工作,加强技术创新和人才培养,不断提高检测水平,为建设美丽乡村、促进农业现代化作出更大的贡献。

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植物的病毒检测技术植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。

种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。

因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。

最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。

目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。

1 血清学检测方法1.1 酶联免疫吸附测定(ELISA)酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。

该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部,加入欲测试的含病毒的样品,病毒与抗体结合,病毒颗粒被固定,再加入标记的特异抗体和酶的底物,酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比,用此方法可测定出病毒的浓度。

ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。

在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。

1.2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。

所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。

RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达5ng/ml~50ng/ml 。

1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say)免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。

其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。

胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。

通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。

金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。

随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。

自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。

20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。

在此基础上,又建立了更为简易快速的胶体金免疫层析试验( Gold immuno-chromatography assay) ,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔膜的毛细管作用,使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗透移动,在移动的过程中,抗体抗原发生反应,并通过免疫金的颜色显示出来。

上述两种快速检测技术的优点是简便、快速、直接,不需要酶促反应底物,除试剂外不需任何特殊仪器设备,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。

但不能准确定量,灵敏度与酶联相当。

魏梅生等[5~6]应用该技术成功地进行烟草环斑病毒的检测。

1.4 免疫毛细管区带电泳( Immuno-capillary zone electrophoresis , I-CZE) 毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。

在外加电压作用下,通过电泳迁移和电渗流的作用,样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。

I-CZE将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来,实时检测抗原- 抗体复合体Eun[7 ]等应用I-CZE检测到10fg 建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。

I-CZE 灵敏度高,且可快速分析多个样品,因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥巨大作用,有广阔的应用前景。

1.5 免疫PCR近年来出现的免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术,与酶联检测技术相比,免疫PCR 是先用抗体来捕获抗原,提取核酸后,再用PCR 扩增DNA 片段,从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。

Sharman[8]建立的复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提液中的香蕉苞叶花叶病毒、黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒。

1.6 沉淀法在电解质存在时,抗体与同源抗原相互结合形成沉淀,不同病毒类型形成沉淀也不同。

如杆状、线状病毒形成絮状沉淀,球形病毒多形成颗粒状沉淀,通过稀释终点法,就是利用稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点,来测定病毒溶度。

1.7 补体结合测定法血清中有一种对热不稳定的成分,它能在抗体存在的条件下,溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌,这种成分称为补体。

它的一个重要特性是一旦抗体与抗原结合,则补体也与之结合,通过补体的酶作用可以溶解红细胞。

2 以病毒核酸为基础的检测方法2.1 多聚酶链式反应(PCR)PCR 是Mullis 等在1985 年发明的一种特异性DNA 体外扩增技术。

其基本原理是:以待扩增的DNA 样品为模板,两个分别与待扩增DNA 片断正链和负链互补的DNA 片断为引物,在DNA 聚合酶的催化下,快速体外扩增特异DNA 序列。

在反应过程中,前一轮扩增得到的DNA 又作为后一轮反应的模板,因此DNA 的量迅速增加,一般经过大约30次循环反应,DNA 的量可扩增100 万倍以上。

对于DNA 病毒可以直接进行扩增,而对于大多数的RNA 病毒,则需先将RNA反转录成cDNA 再进行PCR 扩增, 此方法称RT2PCR(Reverse transcription-PCR) 。

用PCR 检测植物病毒所需时间短,灵敏度特别高。

用RT2PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg[10]。

近年来,在此基础上又发展了多种方法用于植物病毒检测。

如复合PT2PCR 是在同一RT-PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段;PCR-ELISA 是用ELISA代替琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,灵敏度高。

Olmos 等[12]用PCR2ELISA 方法检测李痘病毒的灵敏度比免疫PCR 高100 倍。

2.2 分子信标(Molecular beacon)分子信标[13 ] 是具有茎环结构的一段单链核酸分子,5′- 端和3′- 端序列互补形成“茎”,与目标序列互补的探针序列为“环”,在5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分。

反应开始时先将反应液加热到80 ℃,这时分子信标变性,无茎环结构,不管有无目标序列均有荧光。

当温度逐渐降到20 ℃时,连续检测其荧光强度。

如果反应中产生与分子信标互补的目标序列,当温度降到解链温度时,分子信标和目标序列杂交,荧光部分从猝灭部分移开,从而发出荧光。

如果反应中没有目标序列,分子信标的两臂相遇形成茎环结构,不会产生荧光。

由于只有与互补序列杂交后分子信标才发出荧光,未杂交的信标不发荧光,因此不需要从反应混合物中除去未杂交的分子信标,可实时定量检测,灵敏度高。

2.3 TaqMan实时定量PCR ( Real-time RT-PCR)TaqMan实时定量PCR 是将RT-PCR和荧光检测相结合,利用Taq DNA 聚合酶的5′-端核酸酶活性来切割在扩增过程中与目标序列退火的荧光探针。

探针5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分,当探针完整时,无荧光出现。

在PCR 过程中,荧光探针(也称TaqMan探针) 专化性地与两引物扩增产物间的一段序列退火后被Taq DNA 聚合酶切割,荧光组分与猝灭组分分开,产生荧光信号,荧光信号的强度与目标序列浓度或拷贝数成比例。

在每一循环中,都会有更多的分子被切割下来,荧光强度呈指数增长。

TaqMan实时RT-PCR不仅可避免假阳性的出现、提高检测灵敏度、实时定量检测,并且可在一个反应管内完成,减少了污染,反应自动完成, 易定量。

应用该技术, Roberts等[14]成功检测少至500fg 的番茄斑萎病毒,Eun 等[15]同时检测少至5fg 的建兰花叶病毒和齿兰环班病毒。

2.4 核酸杂交技术(Nucleic acid hybridization)核酸杂交是两段具有一定的同源性、来源不同的核酸分子在去掉变性条件后,互补的区段退火形成异质双链分子的过程。

核酸杂交是先将待测核酸固定在膜上,然后用核酸探针与其进行杂交,使杂交体带上标记而被显示出来。

一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒,直接把病毒核酸点到NC 膜上再使之与探针杂交;也有的直接把病毒样品点到NC膜上。

检测的专化性程度取决于探针与病毒核酸序列的互补程度。

核酸杂交技术适用于DNA 病毒、RNA 病毒及类病毒的检测,灵敏度高、特异性强,可检测到1pg 的DNA。

朱水芳等[16]、李尉民等[17]分别应用核酸杂交成功检测了番茄环斑病毒和南方菜豆花叶病毒。

核酸杂交还可和RT-PCR 结合使用,Bertolini 等[18] 采用复合RT-PCR 同时检测侵染橄揽树的6 种RNA 病毒,随后用这6 种病毒的特异Dig(地高辛) 标记的探针对PCR 产物进行检测。

Dig 标记的cRNA 探针检测马铃薯卷叶病毒的灵敏度可达1pg/ml 。

2.5 双链RNA分析(Double-stranded RNA ,dsRNA)RNA 病毒、类病毒以及卫星RNA 在基因组复制过程中要形成双链的复制型或复制中间体,因此寄主植物体内存在其dsRNA ,且每一种RNA 病毒、类病毒、卫星RNA 形成的dsRNA 都是特异的,有各自的迁移率、分子量、片段数。

但正常的植物组织中无大分子的dsRNA ,因而可以利用dsRNA进行RNA 病毒、类病毒和卫星RNA 的诊断与检测。

dsRNA分析不需要贵重的仪器设备,在一般实验室即可进行。

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