08 细胞凋亡的诱导及观察

山东大学实验报告2018年5月28日

________________________________________ _________________________

姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午

科目：细胞生物学实验题目：细胞凋亡的诱导及观察学号：201600140055

一、实验目的

1.学习细胞凋亡的简史、概念和原理。

2.了解细胞凋亡的检测方法。

3.掌握诱导和形态学观察动植物细胞凋亡的基本方法。

二、实验原理

1．细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，也称细胞程序性死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

2．细胞凋亡的生理意义

1)维持生物体内环境的稳定；

2)参与防御反应；

3)胚胎发育过程中清除一些细胞。

3．细胞凋亡的检测方法

●细胞凋亡的形态学检测

●磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

●线粒体膜势能的（△Ψmt）检测

●DNA片段化检测

●TUNEL法

●Caspase-3活性的检测

●WB检测

●凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析

4．细胞凋亡的形态学检测

未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜破裂、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

5．细胞凋亡的诱导因素

物理因素：射线、热休克、冷激等。

化学因素：重金属离子、激素、毒素、活性氧、一氧化氮等。

生物因素：病毒、细菌、肿瘤坏死因子、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成抑制剂等。

6．细胞坏死

细胞坏死（necrosis）被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，后期细胞核膨大，最后细胞破裂。细胞裂解释放出内含物，并常引起炎症反应。

7．吖啶橙（AO）

吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

三、实验用品

1.实验材料：HeLa细胞，源自一位美国黑人妇女海瑞塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的宫颈癌细

胞系。

2.实验试剂：含10%小牛血清的DMEM高糖培养基，甲醇固定液，PBS，VP-16，吖啶橙染液，瑞氏染

液。

3.实验仪器：超净工作台，CO

培养箱，小型高速离心机，高压灭菌锅，荧光显微镜，普通光学显微

2

镜，倒置光学显微镜。

4.实验用具：无菌离心管，无菌滴管，酒精灯，镊子，移液器，吸头，试剂瓶，载玻片，盖玻片，

35mm细菌培养皿。

四、实验步骤

1．细胞培养和凋亡药物诱导处理（由老师完成）

1)在细胞培养室中复苏和传代培养HeLa细胞，使细胞处于对数生长期。

2)实验前2d将盖玻片放置入35mm细菌培养皿，并将细胞种植在培养皿上，分为实验组和对照组。

3)实验前1d使得细胞的底部汇合度约为60%-70%，加入VP-16至终浓度为0.1mmol/L，在37℃

培养箱中继续孵育24h。对照组加入等量的DMSO。

2．倒置显微镜下观察

在培养完成后，从培养箱中将35mm培养皿取出，在倒置显微镜下进行观察，拍照记录结果。3．吖啶橙染色后荧光显微镜观察

1)固定：将实验组和对照组培养皿中的培养液吸去，用PBS清洗1-2遍，加入适量的预冷甲醇，

冰箱中零上低温固定10min，之后取出培养皿，吸去甲醇，用PBS清洗2-3遍。

2)染色：在培养皿中加入少量吖啶橙（稍没过盖玻片即可），染色5min，之后吸去染液，用PBS

清洗2-3遍。

3)制片：取一张洁净干燥的载玻片，中央滴一滴PBS，用镊子小心地从培养皿中取出盖玻片，将

朝上的一面（长有细胞的一面）向下，盖在载玻片滴有PBS的区域，注意不要有气泡，之后用吸水纸从盖玻片边缘吸出多余PBS。

4)观察：在荧光显微镜下观察装片，并拍照记录结果，凋亡细胞在荧光显微镜下至少要选取5个

不同视野拍照，用于之后计算凋亡率。

4．瑞氏染色后倒置显微镜观察

1)固定：已在前一步进行过，此次略去。

2)染色：向已取出盖玻片的培养皿中加入适量的瑞氏染液（稍没过皿底即可），染色10-15min，

之后吸去染液，用缓冲液清洗，洗去浮色。之后倒掉缓冲液，静置干燥。

3)观察：将干燥的培养皿放在倒置显微镜下观察，拍照记录结果。

5．计算凋亡率

从拍摄的荧光显微镜下凋亡细胞的照片中选取五张，计数视野中的细胞总数和凋亡细胞数，制作成表，并按照如下公式计算凋亡率。

细胞凋亡率凋亡细胞数细胞总数

五、实验结果

1.未染色细胞观察结果

图1 未染色凋亡细胞观察结果（40×10）图2 未染色凋亡细胞局部（40×10，示凋亡小体）

图3 未染色对照组细胞观察结果（40×10）图4 未染色坏死细胞观察结果（40×10）

2.吖啶橙染色后观察结果

图5 吖啶橙染色凋亡细胞（40×10）图6 吖啶橙染色后凋亡细胞（40×10，示凋亡小体）

图7 吖啶橙染色后对照组细胞（40×10）图8 吖啶橙染色后坏死细胞（40×10）3.瑞氏染色后观察结果

图9 瑞氏染色后凋亡细胞观察结果（40×10）图10 瑞氏染色后凋亡细胞（40×10，示凋亡小体）

图11 瑞氏染色后对照组细胞（40×10）图12 瑞氏染色后坏死细胞（40×10）4.细胞凋亡率计算结果

图13 凋亡细胞视野1（40×10）图14 凋亡细胞视野2（40×10）

图15 凋亡细胞视野3（40×10）图16 凋亡细胞视野4（40×10）

图17 凋亡细胞视野5（40×10）表1 细胞凋亡率统计表

细胞凋亡率凋亡细胞数细胞总数

六、思考与讨论

1.VP-16，即足叶乙甙，又称依托泊苷，是细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于DNA拓扑异构酶Ⅱ，

形成稳定的“药物-酶-DNA”可逆性复合物，阻碍DNA修复。向实验组中加入VP-16可以诱导HeLa 细胞凋亡。

2.显微镜下观察到未染色的对照组细胞大多呈不规则多边形，贴附在培养皿底部生长；而实验组

中除存在正常的多边形贴壁细胞之外还有一些周围出现凋亡小体的典型晚期凋亡细胞，就算是多边形贴壁细胞也常出现核靠近细胞膜一侧的早期凋亡细胞特征；而坏死细胞则观察到细胞膨大，细胞核也膨大至占据细胞体积的4/5以上，且核质界限没有正常细胞清晰，核仁不明显或无核仁。

3.吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察到对照组细胞中有着清晰的绿色细胞核，核中一定数量更亮

的黄绿色核仁，胞质呈黄色；凋亡细胞也有着清晰的细胞核及亮度更高的核仁，但亮度比对照组更强，胞质呈橙色，有些凋亡细胞周围存在橙色且带有高亮度DNA碎片的小泡，即凋亡小体；

坏死细胞的核呈绿色，亮度比凋亡细胞低，核极大，占细胞体积的4/5到9/10左右，核仁少或不可见，胞质呈橙色。

4.瑞氏染液染色后，对照组细胞呈蓝紫色，胞质收缩，贴壁细胞周围细胞质以数条条带的形式呈

放射状分布，核仁隐约可见；凋亡细胞整体呈圆形，细胞质同样收缩，核仁颜色比周围细胞核

深，较为明显，一些细胞周围有被深染的小球，即凋亡小体；坏死细胞被染成紫色，细胞形态

不规则，核膜和质膜似乎破裂，核质形状同样不规则。

5.经过横向对比，总体来说，在光学显微镜下，凋亡细胞比起对照组细胞，细胞核略收缩，核仁

未消失，细胞核贴近一侧细胞膜，有时存在变形甚至碎裂，晚期凋亡细胞细胞核碎裂，经细胞膜包裹形成凋亡小体，是凋亡细胞的典型特征；坏死细胞细胞膨大，细胞核同样膨大，核质界限模糊化，核仁不明显或消失。在荧光显微镜下，凋亡细胞发出的荧光比对照组强，这是由于其DNA碎裂，结构更松散，可以结合更多的吖啶橙染料，凋亡小体中DNA残片的亮度尤其高；

坏死细胞的亮度与对照组相近或更暗，细胞核巨大，核仁不明显。

6.实验最后所计算的细胞凋亡率是按照细胞形态来判断细胞是否进入凋亡期，可凋亡细胞仅在晚

期可由于凋亡小体的存在和细胞核的形态变化以较容易的与正常细胞所区分，而早期的凋亡细胞则难以发现，所以这次试验中通过对细胞形态观察判断其是否发生细胞凋亡所得到的结果是偏小的，实际的细胞凋亡率应大于42.2%。

7.细胞凋亡的检测方法多种多样，相比之下，形态学观察的方法并不可靠，DNA片段化检测、磷脂

酰丝氨酸外翻分析、线粒体内膜势能的检测等方法都要更为可靠，现在实验室中对于细胞凋亡的检测液主要是通过其他方法而不是形态学观察的方法。