08 细胞凋亡的诱导及观察
细胞凋亡的诱导和抑制因素及其生物学机制研究
细胞凋亡的诱导和抑制因素及其生物学机制研究细胞凋亡，是一种自我毁灭性的程序性死亡过程。
在细胞凋亡发生过程中，各种生物学因素均扮演了重要的角色。
这些因素既包括细胞凋亡的诱导因子，也包括细胞凋亡的抑制因子。
一、细胞凋亡的诱导因素1. DNA 的损伤和修复过程DNA 的损伤是细胞凋亡的最主要的诱导因素之一。
DNA 损伤能够引起细胞内的一系列反应，这些反应包括细胞周期的停止、DNA 修复和细胞凋亡的引导。
其中，p53 是一种广泛存在于细胞中的转录因子，它在损伤 DNA后能够激活其他信号通路，诱导细胞凋亡。
2. 细胞因子细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、凋亡诱导因子（Apo2L/TNF-related apoptosis-inducing ligand）等，在诱导细胞凋亡中也扮演了非常重要的角色。
这些因子能够通过与其表面受体的结合而诱导凋亡途径的激活。
3. 细胞外基质细胞外基质，如血凝素、纤维连接蛋白、肝素硫酸、透明质酸等，在细胞凋亡过程中也有重要的作用。
例如，透明质酸能够通过诱导肝细胞生长因子（HGF）来促进细胞凋亡。
二、细胞凋亡的抑制因素1. Bcl-2 家族Bcl-2 家族成员常表现为细胞凋亡的抑制因子。
这些因子能够阻止受体介导的直接细胞死亡、协同细胞内的信号通路，或者通过调解线粒体外在途径来在细胞凋亡过程中起作用。
2. IAP 家族IAP 家族成员是一类高度保守的蛋白，是细胞凋亡抑制因子的另一群代表。
它们通过直接抑制 Caspase 活性并调节细胞死亡途径的其他因子来保护细胞不受凋亡的影响。
3. FasLFasL（CD95L）是一种细胞表面的细胞毒性受体分子，能够诱导细胞凋亡。
但在其作用过程中，部分的细胞凋亡被 FasL 抑制，这种抑制作用是通过活性阻遏体（FLIPs）调节 Caspase 活性所展现的。
三、生物学机制研究在细胞凋亡的诱导和抑制过程中，生物学机制起到了关键的作用。
近年来人们的研究发现，细胞凋亡和生物学机制之间有复杂的关系。
08实验八+细胞凋亡的诱导和细胞凋
（2）高浓度盐Ca2+的处理：
100nmol/L或500nmol/L的CaCl2或NaCl处理洋葱 内表皮8h左右； 48h后用改良苯酚品红染液染 色30min，清洗；镜检。
三、材料和试剂
材料：人类淋巴细胞株、洋葱内表皮 试剂：100μmol/L cyt c的水溶液、 100nmol/L或500nmol/L的CaCl2、改良苯 酚品红染液
四、实验方法与步骤
1.取样
（1）人类淋巴细胞株的培养
（2）直接撕取洋葱内表皮细胞
2.细胞调亡的诱导 （1） cyt c处理： 共做三组样品。试验组样品要先经cyt c处 理，浓度为12.5 μmol/L，时间控制在48h左右； 正对照样品不需要处理，为正常生长的细胞； 负对照样品是将正常细胞煮沸10min，使其坏死。
五、 实验结果
形态学变化 调亡率统计
四、实验报告
设计一个刺激诱导PCD的实验。
（3）不同机械刺激的处理（温和）：
冷激、热激、振荡等
3.形态学观察 在显微镜下观察细胞形态变化，比较和描述不同调
亡诱导，诱导细胞调亡形态变化的异同点并对试验
组细胞进行调亡率统计。
计算调亡率＝（调亡细胞数/总细胞数）×100％。
在光学显微镜下照相（数码互动显微镜）。
4.DNA电泳（梯状DNA）
实验八 细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的 形态特征的观察
一、实验目的
了解细胞调亡的原理；
掌握用于细胞调亡检测的常规方法。
二、实验原理
细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可 分为两种类型：细胞坏死和细胞程序性死亡 （PCD），也称细胞调亡。 细胞程序性死亡分为两类：受体介导的细胞程 序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。 调亡细胞的形态学观察：HE染色、Giemsa染色、 台盼蓝染色、改良苯酚品红染色；细胞调亡生 化特征的检测：DNA电泳、细胞膜磷脂酰丝荧光 显示、调亡细胞原位末端标记法。
细胞凋亡诱导技术的使用教程
细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。
它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。
本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。
第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。
常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。
确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。
此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。
第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。
不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。
一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。
此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。
不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。
第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。
这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。
一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。
因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。
第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。
常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。
荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。
根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。
第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。
根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。
细胞凋亡途径实验报告
细胞凋亡途径实验报告一、实验目的细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，对于维持生物体的正常发育和稳态具有关键作用。
本实验旨在探究细胞凋亡的不同途径，深入了解细胞凋亡的分子机制和调控过程。
二、实验原理细胞凋亡主要通过内源性途径（线粒体途径）和外源性途径（死亡受体途径）来实现。
内源性途径中，细胞内的应激信号，如 DNA 损伤、氧化应激等，会导致线粒体膜通透性改变，释放细胞色素C 等凋亡因子到细胞质中。
细胞色素 C 与凋亡蛋白酶激活因子 1（Apaf-1）结合，形成凋亡体，激活 caspase-9，进而激活下游的 caspase 级联反应，导致细胞凋亡。
外源性途径则是通过细胞表面的死亡受体，如肿瘤坏死因子受体（TNFR）、Fas 受体等，与相应的配体结合，招募并激活 caspase-8，启动凋亡信号传导。
三、实验材料1、细胞株：选用人肝癌细胞株 HepG2 作为实验对象。
2、试剂：细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、caspase 活性检测试剂盒、抗caspase-8、抗caspase-9 等抗体。
3、仪器：CO2 培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪、酶标仪等。
四、实验方法1、细胞培养将 HepG2 细胞接种于培养瓶中，在含有 10% FBS 的 DMEM 培养基中，置于 37°C、5% CO2 的培养箱中培养。
待细胞融合度达到 80%左右时，进行传代培养。
2、诱导细胞凋亡（1）内源性途径诱导：使用丝裂霉素 C（MMC）处理细胞，终浓度为1 μmol/L，处理 24 小时。
（2）外源性途径诱导：使用肿瘤坏死因子α（TNFα）处理细胞，终浓度为 20 ng/mL，处理 24 小时。
3、凋亡检测（1）形态学观察：通过倒置显微镜观察细胞形态的变化，如细胞皱缩、染色质凝集等。
（2）Annexin VFITC/PI 双染法：收集处理后的细胞，用 Annexin VFITC 和 PI 进行双染，然后通过流式细胞仪检测凋亡细胞的比例。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。
（2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。
（3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
细胞凋亡的检测
细胞凋亡的检测实验人：生64范泓洋2006030003 同组实验：刘婧娟实验日期：2008年5月8日1. 实验目的1.1 了解细胞凋亡的基本概念及其意义1.2 了解细胞凋亡的诱导及检测方法，学会区分凋亡不同阶段的细胞1.3 学习Hoechst33258染色方法2. 实验原理细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。
由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。
通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。
细胞凋亡有确保正常生长、发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能的作用。
凋亡过程中的细胞在形态学和很多生化指标上与正常细胞和坏死的细胞都有明显区别。
RNA结合，染色DNA时应调整染液的pH至7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存。
3. 实验材料、试剂及器械3.1 材料：Hela细胞3.2 试剂：H2O2溶液，DMEM培养基，PBS溶液，胰酶-EDTA溶液，Hoechst33258染料，甲醇3.3器械：离心机，EP管，pippet，正置荧光显微镜，盖玻片，载玻片，镊子4. 实验步骤4.1 向传代24小时后的Hela细胞系（DMEM培养液1ml，贴壁50%）中加入100μlH2O2溶液，继续培养24小时4.2收集细胞(200uL胰酶37℃消化2min后，再加入1mL 培养基)至1.5mL EP管，1000g离心5min4.3 吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇，室温固定10min4.4 1000g离心5min4.5 弃上清，加100uL PBS洗涤沉淀细胞4.6 1000g离心5min，4.7弃上清，加40uL PBS和10uL Hochest33258染液，于37℃染色10min4.8 1000g，离心5min4.9 弃上清，加100uL PBS洗涤；4.10 1000g，离心5min4.11弃上清，加15uL PBS重悬细胞4.12 取15uL悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察并选取典型凋亡阶段的细胞拍照5. 实验结果由于Hoechst33258染色法只能将细胞核染色，所以只能由核质的形态变化来推测正在凋亡的细胞处于哪一个凋亡阶段。
实验十三放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察PPT课件
• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细 胞吞噬。
8
凋亡小体
9
• 生化特征： 内源性核酸内切酶基
因的活化和表达，导致 凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解，得 到的DNA片段的长度 为200bp的倍数。
10
二、程序性细胞死亡的意义
• 1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的 正负控制以及对程序性细胞死亡的正负 控制来维持细胞总数的平衡和机体的生 命活力。
You Know, The More Powerful You Will Be
18
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
14
材料及设备：
HeLa贴壁培养细胞、250 mg/ml 放线菌素D （Actinomycin D）、吖啶橙荧光染料、 卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、10%甘 油
荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一 次性吸管、离心机、EP管、培养皿、小 烧杯等。
15实验步骤ຫໍສະໝຸດ • 1.诱导： 向处于对数生长期的Hela细胞中加入250mg/ml的放
16
• 3.细胞预固定和固定：
加入0.9毫升生理盐水，悬浮细胞， 使细胞分散，加入0.1毫升卡诺氏固定 液，混匀；离心，去上清（保留0.1毫 升生理盐水）；
加入固定液至1毫升，小心悬浮 细胞，室温下固定处理10min，离心， 去上清，加入0.1毫升固定液，小心充 分混匀细胞；
17
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
细胞凋亡的诱导和调控
细胞凋亡的诱导和调控细胞凋亡是一种程序化死亡，它在生殖、发育和人体健康中发挥着重要的作用。
细胞凋亡是一个高度调控的细胞过程，凋亡的过程可以被不同的信号诱导和调控。
在这篇文章中，我们将讨论细胞凋亡的诱导和调控机制。
一、细胞凋亡的诱导细胞凋亡的诱导通常是由内源性或外源性信号引起。
其中内源性信号包括DNA损伤、细胞周期调节紊乱和生物化学异常等。
而外源性信号包括神经递质、药物、放射线和细胞因子等。
1.DNA损伤的诱导DNA损伤是诱导细胞凋亡最常见的内源性信号。
DNA损伤会导致一系列信号通路的激活，如P53、P63和P73等。
这些蛋白质可以直接或间接诱导凋亡。
2.细胞周期调节的紊乱细胞周期调节的紊乱也会导致细胞凋亡的发生。
在生长过程中，许多基因和蛋白质都起到了调节细胞周期的作用。
这些基因和蛋白质中只要有一个出现异常，都可能导致细胞周期失控和细胞凋亡的诱导。
3.外源性信号的诱导外源性信号包括生物或非生物的刺激，例如细胞因子和放射线等。
这些信号通常会引起一系列反应，包括激活损伤信号、调节转录因子和调节各种基因表达等。
二、细胞凋亡的调控细胞凋亡的发生需要经过一系列的调控过程，包括激活和执行期等。
1.激活期激活期是指一个系列的信号通路被激活，从而导致细胞凋亡。
这个主要涉及到两个关键的蛋白质家族，即Bcl-2家族和Caspase 家族。
Bcl-2家族中的Bax和Bak蛋白质是促凋亡蛋白，当它们被激活后，会导致线粒体外膜的破损，释放出Cytochrome c，激活Caspase蛋白质，引起一个连锁反应。
2.执行期执行期是指启动了Caspase后，引起了DNA和蛋白质的降解，最终导致细胞死亡。
Caspase蛋白质能够切割或活化多种蛋白质，特别是可以分解凋亡的抑制因子XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein），释放出存在于细胞内的活性Caspase，最终导致DNA和蛋白质的降解和细胞死亡。
08课后习题参考答案毒理学
名词解释抑癌基因细胞内一类能对抗肿瘤作用的基因，在控制细胞增长、增殖等过程其负调控的作用，而在诱导细胞分化及诱导细胞凋亡的过程则发挥正向调节的作用。
填空题根据化学致癌物引起癌变的机制和模式，可将其分为遗传毒性致癌物、表观遗传毒性致癌物。
致癌的过程大致分为引发、促长、进展3个阶段。
致癌物检测方法：短期试验、哺乳动物致癌试验和流行病学调查。
问答题请简答外源化学物致癌作用的引发、促长、进展阶段的主要特征。
答：引发阶段：不可逆、需要通过细胞分裂加以固定、剂量-反应显示没有可测定的阈值，无可测定的最大反应、存在自发的引发作用、对外源性化学物质和其他化学因素敏感、引发作用必须发生在促长作用之前，“纯”引发作用在无促长时不导致肿瘤。
促长阶段：可逆性；促长剂通常是非致突变物，需要持续和反复暴露；促长剂的有效性仅出现在引发作用之后；促长细胞群的存在取决于促长剂的持续存在；内源性促长剂可起自发促长作用；剂量-反应显示有可测定的阈值，有可测定的最大效应；对饮食和激素等因素敏感；促长作用的相对效力取决于达到最大效应的时间和剂量速率。
进展阶段：不可逆、伴随生长率和侵袭性的增加出现核型异常，核型不稳定性导致细胞基因组结构的形态学改变、有可测定的和/或形态学可描述的细胞基因组的改变、进展的早期阶段对环境因素敏感、可见良性和/或恶性肿瘤、促进剂可促进细胞进入该阶段，但可能不是引发剂、可以发生自发的进展作用。
假设有一种化学物质，现在怀疑它可能是引发当地癌症高发的原因，请你设计一个实验流程，帮助判定此种物质是否为致癌物。
答：化学致癌物的判定是一项艰巨、耗时、复杂的工作。
人群流行病学调查和动物试验结果是评价化学物致癌危险性的两类主要证据。
流行病学的调查结果是确定人类致癌物的唯一手段，其可信度取决于严密的设计且研究过程受许多因素的限制和干扰。
啮齿类动物的长期致癌试验是确认动物致癌物的较可靠方法，但动物试验花费大，且周期长。
目前通用的是先使用一些体外试验进行初步筛查，因为这些试验都各有优缺点，要整合各方面的资料数据，综合分析后，做出客观判断，如果出现阳性结果再进一步实行动物试验。
细胞凋亡的诱导与检测
•
• 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
• 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用 的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
• 电子显微镜观察
(扫描电镜) 正常细胞
(扫描电镜)
(透射电镜)
凋亡细胞—凋亡小体 凋亡细胞 凋亡小体
Thanks!
细胞凋亡诱导及检测
1.概述 2.细胞凋亡的过程与机制 3.凋亡与坏死的区别 4.细胞凋亡生物学意义 5.细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或 病理条件下，受内在遗传机制的控 制自动结束生命的过程。
• 概述
悉尼· 悉尼·布雷诺尔
罗伯特· 罗伯特·霍维茨
约翰· 约翰·苏尔斯顿
增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
■参与防御反应
细胞毒T 细胞毒T细胞
凋亡过多或不足→→疾病： 肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤
细 胞 凋 亡
1、细胞凋亡的形态学检测 、
• 光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 晚期可见凋亡小体。 • 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的 染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。
七.注意事项：
1.由于荧光会发生淬灭，加入DAPI染色后要尽 量避光 操作，在显微镜下操作时，先用可见光 找到细胞再转换到紫外光，因为紫外光对荧光的 淬灭效果比可见 光强很多。 2.实验要求阴性对照，不然说明不了问题。 3.每一个步骤都要PBS溶液洗掉上一步的试剂， 避免 影响下一步。 4.EB为强染色剂，使用实应高度注意。 5.在显微镜下观察时候要操作迅速因为细胞会 变干而发生改变。
07_细胞周期_08_细胞凋亡_2011
或PEST序列（脯-谷-丝-苏），可通过定时降
解或快速转换来调节周期素的水平。
按周期素表达及作用的细胞周期阶段的不同， 可将其分为G1期（D、E）和M期（A、B）
两大类。
The Expressional Levels of Cyclins during Cell Cycle
The Relationship of Cyclin Expressional Levels with
这 类 蛋 白 在 其 N- 端 含 有 一 个 降 解 盒
（ destruction box ） ， 在 M 期 通 过 泛 素 （ubiquitin）途径降解。
① 周期素A：
包括三种亚型：A1、
A2和A3。
在细胞周期的DNA合
成之前出现，并不断 增加，与启动DNA复 制有关，主要在S期 发挥作用。
细 胞 周 期 的 调 控 机 制
Smad3/4 —— Mothers against decapentaplegic homolog 3/4 ATM —— Serine-protein kinase ATM ATR —— Serine-protein kinase ATR SKP2 —— S-phase kinase-associated protein 2 SCF —— Skip1-cullin/cdc53-F-box protein GSK3 —— Glycogen synthase kinase 3
⑤ PRb：
是由 Rb 抑癌基因编码合成的蛋白质，有低
磷酸化型和高磷酸型两种型式。
低磷酸化型的PRb可与转录因子E2F形成复
合体，抑制其转录激活作用，阻止细胞分 裂；而高磷酸化型的PRb则不能与E2F形成 复合体。
实验报告细胞凋亡的诱导与调控机制研究
实验报告细胞凋亡的诱导与调控机制研究实验报告：细胞凋亡的诱导与调控机制研究一、引言细胞凋亡是一种基本的生物学现象，对于多细胞生物的发育、稳态维持和疾病发生发展具有重要意义。
深入研究细胞凋亡的诱导与调控机制，有助于我们更好地理解生命过程，并为相关疾病的治疗提供新的思路和策略。
二、实验目的本实验旨在探究不同因素对细胞凋亡的诱导作用以及相关的调控机制。
三、实验材料与方法（一）实验材料1、细胞系：选用了人肝癌细胞系 HepG2 和人乳腺癌细胞系 MCF-7。
2、试剂：凋亡诱导剂（如阿霉素、顺铂等）、抗凋亡蛋白抑制剂（如 ZVADFMK）、细胞凋亡检测试剂盒（如 Annexin VFITC/PI 双染试剂盒）、蛋白提取试剂盒、抗体（如 cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 等）。
（二）实验方法1、细胞培养：将 HepG2 和 MCF-7 细胞分别培养在含有 10%胎牛血清、1%双抗的 DMEM 培养基中，置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养。
2、药物处理：将处于对数生长期的细胞接种于培养板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的凋亡诱导剂和抗凋亡蛋白抑制剂，处理一定时间。
3、细胞凋亡检测：采用 Annexin VFITC/PI 双染法检测细胞凋亡率。
收集处理后的细胞，用 PBS 洗涤两次，然后加入 Annexin VFITC 和 PI 染液，避光孵育 15 分钟，最后通过流式细胞仪检测。
4、蛋白表达检测：采用 Western blotting 法检测相关蛋白的表达水平。
收集处理后的细胞，提取总蛋白，进行 SDSPAGE 电泳，转膜，封闭，然后分别加入相应的一抗和二抗，最后通过化学发光法显影。
四、实验结果（一）凋亡诱导剂对细胞凋亡的影响1、阿霉素处理后，HepG2 和 MCF-7 细胞的凋亡率均呈剂量依赖性增加。
在低浓度（05 μM）时，凋亡率较低；随着浓度的增加（10、20 μM），凋亡率显著升高。
细胞凋亡的诱导和调控
细胞凋亡的诱导和调控细胞凋亡是一种自发性的细胞死亡模式，通常发生在细胞受到外界刺激或其内部发生异常时。
其过程包括凋亡信号的诱导、信号转导、执行程序和处理死亡产物等多个阶段。
细胞凋亡的诱导和调控涉及到许多细胞分子和信号通路，研究这些过程有助于揭示细胞生物学的基本机制以及开发治疗疾病的新策略。
一、细胞凋亡的信号诱导细胞凋亡的信号可以来源于多种外界或内部刺激，例如DNA损伤、细胞膜受损、氧化应激、热休克等。
这些刺激会引起一系列信号转导，从而激活凋亡途径中的关键分子如半胱氨酸蛋白酶(caspase)和凋亡诱导因子(APAF1)等。
此外，凋亡的信号诱导还受到多种细胞因子、细胞外基质成分的影响。
二、细胞凋亡途径的分类目前细胞凋亡途径主要分为内源性途径和外源性途径两大类。
内源性途径一般是由细胞内发生异常导致的，例如DNA受损、缺氧、细胞凋亡因子受体泛素化等，其信号会激活线粒体上的Bax/Bak、细胞色素C等，进而激活半胱氨酸蛋白酶级联反应，引起细胞死亡。
外源性途径一般是由细胞外因素引起的，例如免疫应答、毒物或化学物质等刺激，其信号会通过细胞凋亡因子受体，激活半胱氨酸蛋白酶级联反应，引起细胞死亡。
三、细胞凋亡的调控细胞凋亡的调控是一个复杂的过程，涉及到多个分子和通路的参与。
其中，IAP(抑制凋亡蛋白)家族、Bcl-2 家族、PI3K/Akt、MAPK、NF-κB等分子及其作用通路被广泛研究。
Bcl- 2 家族是在调控内源性途径中扮演重要角色的分子或蛋白家族,它包含许多蛋白，例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等。
它们的主要功能是控制线粒体的外膜通透性，维持线粒体内三磷酸腺苷(ATP)生成和质膜电位，从而防止线粒体释放细胞色素C。
若该家族蛋白发生缺陷，便会导致线粒体色素C释放、半胱氨酸蛋白酶级联反应增强，促使细胞发生凋亡。
IAP 家族也是调控内源性途径中的重要家族，其中最为人熟知的是 XIAP。
IAP 家族蛋白通过自身结构域与半胱氨酸蛋白酶发生相互作用，从而抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，进而防止细胞发生凋亡。
诱导细胞凋亡的实验原理
诱导细胞凋亡的实验原理细胞凋亡是一种重要的生物学过程，指的是由于内外在刺激，细胞主动启动的一系列自我毁灭过程。
这个过程在维持正常生理状态、清除受损细胞及不需要的细胞中起着重要作用。
同时，细胞凋亡的失调也与许多疾病的发生和发展密切相关。
因此，诱导细胞凋亡的实验对于研究细胞凋亡的机制和寻找相关疾病治疗方法起着重要的作用。
诱导细胞凋亡的实验原理主要基于两个方面：一是应用相关刺激物来模拟内外部环境刺激；二是在细胞途径或靶点上进行干预，激活或抑制相关的调控因子，以诱导或抑制细胞凋亡。
在实验中，有许多方法可以诱导细胞凋亡，如使用致死因子、细胞毒物、放射线、细胞因子等刺激物，或通过遗传和分子工程技术产生特定基因改变来诱发细胞凋亡。
致死因子是通过刺激死亡受体（例如TNF受体家族成员如Fas和TNFR1等）而诱导细胞凋亡的一种方法。
将外源性FasL（Fas配体）或TNF-α等因子添加到培养基中，使其与细胞膜上的Fas或TNFR1结合，并通过调控细胞内的相关信号通路（通常是CASPASE通路）来引发细胞凋亡。
细胞毒物是一类可以直接引起细胞死亡的有毒物质，如化疗药物、致突变剂等。
这些物质可以通过直接作用于细胞的DNA或蛋白质来引发一系列的激活信号级联反应，进而导致细胞凋亡。
例如，DNA损伤剂如顺铂可以与DNA结合，形成DNA附加物从而导致DNA损伤，激活ATM/ATR信号通路，最终启动细胞凋亡。
放射线是另一种常用的诱导细胞凋亡的方法。
实验中可以使用X射线、紫外线等辐射源照射细胞，从而引起细胞内一系列的DNA损伤、突变等反应，导致细胞凋亡。
辐射诱导的DNA损伤与细胞凋亡的机制通常通过ROS（活性氧物种）的产生来介导。
细胞因子也可以被用来诱导细胞凋亡。
细胞因子是一类能够在细胞之间传递信号的蛋白质，例如TGF-β、IL-1β等。
细胞因子通常与细胞膜上的受体结合，并通过调控一系列的信号通路来激活或抑制细胞凋亡。
例如，TGF-β可通过活化SMAD信号通路来诱导细胞凋亡。
实验报告细胞凋亡的诱导与调控机制研究
实验报告细胞凋亡的诱导与调控机制研究实验报告：细胞凋亡的诱导与调控机制研究引言在生物学研究领域，细胞凋亡作为一种重要的细胞死亡方式，一直受到广泛关注。
随着科技的进步，科学家们对于细胞凋亡的诱导和调控机制进行了深入研究，以期探索其在疾病治疗、细胞发育和组织变化中的潜在应用。
本实验旨在研究细胞凋亡的诱导与调控机制，以加深对其原理的理解。
材料与方法1. 细胞培养：使用XXX细胞系培养基，将细胞置于37℃、5% CO2的培养箱中。
2. 实验组设定：将细胞平均分为两组，实验组A和对照组B。
实验组A接受特定诱导剂处理，对照组B不进行任何处理。
3. 细胞凋亡检测：利用TUNEL法检测细胞凋亡程度，使用荧光显微镜观察实验组和对照组下凋亡细胞数量的差异。
4. 分子机制研究：采用Western blot和实时荧光定量PCR技术，检测关键凋亡相关蛋白的表达和基因表达水平。
结果与讨论经过实验，我们观察到以下结果：1. 细胞凋亡诱导：实验组A在接受特定诱导剂处理后，在细胞核中产生了明显的TUNEL阳性信号，表明细胞凋亡被成功诱导。
而对照组B则未出现明显的凋亡相关特征。
2. 细胞凋亡调控机制：通过Western blot检测，我们发现在实验组A中，Bax和Caspase-3蛋白的表达水平显著上调，而对照组B中这些蛋白的表达水平无显著变化。
这表明通过诱导剂的作用，Bax和Caspase-3被激活，并参与细胞凋亡的调控。
另外，实时荧光定量PCR结果显示，实验组A中凋亡相关基因的表达水平明显增加，而对照组B未见明显变化。
这进一步印证了凋亡的调控机制中基因表达的变化重要性。
综合结果分析，我们可以得出以下结论：1. 细胞凋亡可以被特定诱导剂成功激活，从而实现对细胞凋亡的处理。
2. 在细胞凋亡的调控机制中，Bax和Caspase-3等蛋白的上调发挥重要作用。
3. 细胞凋亡的调控还涉及到基因表达的改变，特定诱导剂可以引起相关基因的显著上调。
实验九 凋亡细胞的诱导及形态学观察
2、将细胞悬浮于含有维生素K3溶液中1 h。
3、将细胞液滴在载玻片上，置于光学显微镜下观察。
观察比较经过诱导的和未诱导细胞形态、大小和细胞凋
亡小体的出现，照相并记录实验结果。
4、凋亡细胞的姬姆萨染色：
(1) 细胞悬液于500 r／min离心后，去除上清液后，将细 胞重悬于0.5 ml PBS中。
实验九 凋亡细胞的诱导及形态学观察
一、实验目的
了解细胞凋亡的形态学特征；
学习研究细胞凋亡的方法。
二、实验原理
凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 细胞凋亡晚期可见凋亡小体。而坏死细胞的体积胀大，细
胞膜损坏或裂解成碎片，有时可见呈网状的染色质结构。
使用普通光学显微镜可以直接观察细胞的大小和凋亡小体， 也可用带荷的染料台盼蓝使死细胞着色、活细胞不着色， 或用染核的染料姬姆萨染色后再在光学湿微镜下进行观察。
覆盖涂片，固定1 min，晾干。
(3) 用姬姆萨染液覆盖涂片，染色5 min。 (4) 回收姬姆萨染液（直接倒入姬姆萨染液试剂瓶），剩
余染液用水轻轻洗去。
(5) 用光学显微镜观察细胞核形态。凋亡细胞的染色质浓 缩、并靠近核膜和核着边现象、核膜裂解、染色质分割成 块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
三、实验仪器、材料和试剂
器具：光学显微镜、离心机、倒置显微镜、载玻片。 鱼血红细胞 试剂：磷酸缓冲液(pH 7.2)、姬姆萨染色液、维生素K3溶液
(300 u mol/L)
四、方法与步骤
1、获取鱼血红细胞0.5 ml，在500×g离心3 min，沉淀 用0.5 ml等渗NaCl溶液洗涤细胞2次。
细胞生物学实验-细胞凋亡观察
色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小 不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。 ⑤ AO（吖啶橙）和EB（溴化乙锭）双染色：AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入 核DNA呈绿色，EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。显微镜下 观察，活细胞为荧光深浅不一的结构样特征，核染色质为绿色；凋亡细胞染色强， 亮度高，核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 或均匀一致的圆状或固缩团状结构。 ⑥ 透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形， 核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”，同时可以观察到凋亡 小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。
细胞凋亡检测
保留的细胞
不健康的细胞
细胞开 始收缩
细胞崩 溃分解 成碎片
不健康的细胞已被除去， 组织内附近的细胞进行 有丝分裂，合上缺口
细胞凋亡检测
细胞凋亡的诱导试剂：
名称 Actinomycin D
Aphidocolin A23187 Caffeine
Camptothecin Cycloheximide Dexamethasone
溶剂 甲醇 二甲亚砜 二甲亚砜 沸水 二甲亚砜
水 乙醇
水
二甲亚砜， 热水 水
二甲亚砜 二甲亚砜 磷酸盐缓冲液
甲醇
细胞凋亡检测
细胞凋亡的检测方法：
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
山东大学实验报告2018年5月28日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：细胞凋亡的诱导及观察学号：201600140055一、实验目的1.学习细胞凋亡的简史、概念和原理。
2.了解细胞凋亡的检测方法。
3.掌握诱导和形态学观察动植物细胞凋亡的基本方法。
二、实验原理1．细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，也称细胞程序性死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
2．细胞凋亡的生理意义1)维持生物体内环境的稳定；2)参与防御反应；3)胚胎发育过程中清除一些细胞。
3．细胞凋亡的检测方法●细胞凋亡的形态学检测●磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）●线粒体膜势能的（△Ψmt）检测●DNA片段化检测●TUNEL法●Caspase-3活性的检测●WB检测●凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析4．细胞凋亡的形态学检测未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜破裂、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
5．细胞凋亡的诱导因素➢物理因素：射线、热休克、冷激等。
➢化学因素：重金属离子、激素、毒素、活性氧、一氧化氮等。
➢生物因素：病毒、细菌、肿瘤坏死因子、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成抑制剂等。
6．细胞坏死细胞坏死（necrosis）被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。
坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，后期细胞核膨大，最后细胞破裂。
细胞裂解释放出内含物，并常引起炎症反应。
7．吖啶橙（AO）吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。
因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。
吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
三、实验用品1.实验材料：HeLa细胞，源自一位美国黑人妇女海瑞塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的宫颈癌细胞系。
2.实验试剂：含10%小牛血清的DMEM高糖培养基，甲醇固定液，PBS，VP-16，吖啶橙染液，瑞氏染液。
3.实验仪器：超净工作台，CO培养箱，小型高速离心机，高压灭菌锅，荧光显微镜，普通光学显微2镜，倒置光学显微镜。
4.实验用具：无菌离心管，无菌滴管，酒精灯，镊子，移液器，吸头，试剂瓶，载玻片，盖玻片，35mm细菌培养皿。
四、实验步骤1．细胞培养和凋亡药物诱导处理（由老师完成）1)在细胞培养室中复苏和传代培养HeLa细胞，使细胞处于对数生长期。
2)实验前2d将盖玻片放置入35mm细菌培养皿，并将细胞种植在培养皿上，分为实验组和对照组。
3)实验前1d使得细胞的底部汇合度约为60%-70%，加入VP-16至终浓度为0.1mmol/L，在37℃培养箱中继续孵育24h。
对照组加入等量的DMSO。
2．倒置显微镜下观察在培养完成后，从培养箱中将35mm培养皿取出，在倒置显微镜下进行观察，拍照记录结果。
3．吖啶橙染色后荧光显微镜观察1)固定：将实验组和对照组培养皿中的培养液吸去，用PBS清洗1-2遍，加入适量的预冷甲醇，冰箱中零上低温固定10min，之后取出培养皿，吸去甲醇，用PBS清洗2-3遍。
2)染色：在培养皿中加入少量吖啶橙（稍没过盖玻片即可），染色5min，之后吸去染液，用PBS清洗2-3遍。
3)制片：取一张洁净干燥的载玻片，中央滴一滴PBS，用镊子小心地从培养皿中取出盖玻片，将朝上的一面（长有细胞的一面）向下，盖在载玻片滴有PBS的区域，注意不要有气泡，之后用吸水纸从盖玻片边缘吸出多余PBS。
4)观察：在荧光显微镜下观察装片，并拍照记录结果，凋亡细胞在荧光显微镜下至少要选取5个不同视野拍照，用于之后计算凋亡率。
4．瑞氏染色后倒置显微镜观察1)固定：已在前一步进行过，此次略去。
2)染色：向已取出盖玻片的培养皿中加入适量的瑞氏染液（稍没过皿底即可），染色10-15min，之后吸去染液，用缓冲液清洗，洗去浮色。
之后倒掉缓冲液，静置干燥。
3)观察：将干燥的培养皿放在倒置显微镜下观察，拍照记录结果。
5．计算凋亡率从拍摄的荧光显微镜下凋亡细胞的照片中选取五张，计数视野中的细胞总数和凋亡细胞数，制作成表，并按照如下公式计算凋亡率。
细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数细胞总数×100%五、实验结果1.未染色细胞观察结果图1 未染色凋亡细胞观察结果（40×10）图2 未染色凋亡细胞局部（40×10，示凋亡小体）图3 未染色对照组细胞观察结果（40×10）图4 未染色坏死细胞观察结果（40×10）2.吖啶橙染色后观察结果图5 吖啶橙染色凋亡细胞（40×10）图6 吖啶橙染色后凋亡细胞（40×10，示凋亡小体）图7 吖啶橙染色后对照组细胞（40×10）图8 吖啶橙染色后坏死细胞（40×10）3.瑞氏染色后观察结果图9 瑞氏染色后凋亡细胞观察结果（40×10）图10 瑞氏染色后凋亡细胞（40×10，示凋亡小体）图11 瑞氏染色后对照组细胞（40×10）图12 瑞氏染色后坏死细胞（40×10）4.细胞凋亡率计算结果图13 凋亡细胞视野1（40×10）图14 凋亡细胞视野2（40×10）图15 凋亡细胞视野3（40×10）图16 凋亡细胞视野4（40×10）图17 凋亡细胞视野5（40×10）表1 细胞凋亡率统计表细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数细胞总数×100%=76180×100%=42.2%六、 思考与讨论1. VP-16，即足叶乙甙，又称依托泊苷，是细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于DNA 拓扑异构酶Ⅱ，形成稳定的“药物-酶-DNA ”可逆性复合物，阻碍DNA 修复。
向实验组中加入VP-16可以诱导HeLa 细胞凋亡。
2. 显微镜下观察到未染色的对照组细胞大多呈不规则多边形，贴附在培养皿底部生长；而实验组中除存在正常的多边形贴壁细胞之外还有一些周围出现凋亡小体的典型晚期凋亡细胞，就算是多边形贴壁细胞也常出现核靠近细胞膜一侧的早期凋亡细胞特征；而坏死细胞则观察到细胞膨大，细胞核也膨大至占据细胞体积的4/5以上，且核质界限没有正常细胞清晰，核仁不明显或无核仁。
3. 吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察到对照组细胞中有着清晰的绿色细胞核，核中一定数量更亮的黄绿色核仁，胞质呈黄色；凋亡细胞也有着清晰的细胞核及亮度更高的核仁，但亮度比对照组更强，胞质呈橙色，有些凋亡细胞周围存在橙色且带有高亮度DNA 碎片的小泡，即凋亡小体；坏死细胞的核呈绿色，亮度比凋亡细胞低，核极大，占细胞体积的4/5到9/10左右，核仁少或不可见，胞质呈橙色。
4. 瑞氏染液染色后，对照组细胞呈蓝紫色，胞质收缩，贴壁细胞周围细胞质以数条条带的形式呈放射状分布，核仁隐约可见；凋亡细胞整体呈圆形，细胞质同样收缩，核仁颜色比周围细胞核深，较为明显，一些细胞周围有被深染的小球，即凋亡小体；坏死细胞被染成紫色，细胞形态视野编号总细胞数凋亡细胞数凋亡率1492040.8%2311238.7%3261453.8%4421638.1%5321443.8%合计1807642.2%不规则，核膜和质膜似乎破裂，核质形状同样不规则。
5.经过横向对比，总体来说，在光学显微镜下，凋亡细胞比起对照组细胞，细胞核略收缩，核仁未消失，细胞核贴近一侧细胞膜，有时存在变形甚至碎裂，晚期凋亡细胞细胞核碎裂，经细胞膜包裹形成凋亡小体，是凋亡细胞的典型特征；坏死细胞细胞膨大，细胞核同样膨大，核质界限模糊化，核仁不明显或消失。
在荧光显微镜下，凋亡细胞发出的荧光比对照组强，这是由于其DNA碎裂，结构更松散，可以结合更多的吖啶橙染料，凋亡小体中DNA残片的亮度尤其高；坏死细胞的亮度与对照组相近或更暗，细胞核巨大，核仁不明显。
6.实验最后所计算的细胞凋亡率是按照细胞形态来判断细胞是否进入凋亡期，可凋亡细胞仅在晚期可由于凋亡小体的存在和细胞核的形态变化以较容易的与正常细胞所区分，而早期的凋亡细胞则难以发现，所以这次试验中通过对细胞形态观察判断其是否发生细胞凋亡所得到的结果是偏小的，实际的细胞凋亡率应大于42.2%。
7.细胞凋亡的检测方法多种多样，相比之下，形态学观察的方法并不可靠，DNA片段化检测、磷脂酰丝氨酸外翻分析、线粒体内膜势能的检测等方法都要更为可靠，现在实验室中对于细胞凋亡的检测液主要是通过其他方法而不是形态学观察的方法。