第六章 生物合成技术

生物合成技术

生物技术,又称生物工程或生物工程技术,就是生物科学与工程技术相结合而形成的新学科。生物技术主要包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程与发酵工程。基因工程又称为重组DNA技术,就是通过人工操作,在分子水平上进行基因重组、改造与转移,以获得具有新的遗传特性的细胞,合成人们所需物质的技术过程。酶工程就是酶的生产与应用的技术过程。即就是通过人工操作,获得人们所需的酶,并通过各种方法使酶发挥其催化功能的技术过程。细胞工程就是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。发酵工程又称为微生物工程,就是在人工控制的条件下,通过微生物的生命活动而获得人们所需物质的技术过程。发酵方式主要分为固体发酵与液体发酵两大类。生物技术可以定向改造生物、加工生物材料,有目的地利用生命过程,广泛应用于医药、农林牧渔、生态、轻工食品、化工、能源、材料、海洋开发及环境保护等领域,涉及面广,促进传统产业的改造与新型产业的形成。

实验1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

一、实验目的

1、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2、学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

二、实验原理

转化就是将异源DNA分子引入另一细胞品系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,它就是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

转化过程所用的受体细胞一般就是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶与甲基化酶的突变株。受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过感受态细胞。在一定条件下,将外源DNA分子与感受态细胞混合保温,使外源DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体。

本实验以E、coli DH 5α菌株为受体细胞,用氯化钙处理受体菌使其处于感受态,然后在一定条件下与pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素与抗四环素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌也具有抗氨苄青霉素与抗四环素的特性,常用Amp r,Tet r符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适当稀释后,在含有氨苄青霉素抗四环素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素与四环素的能力都被杀死,所有带有抗药基因的质粒DNA能使受体菌从对抗菌素敏感(Amp s,Tet s)转变为具有抗药性(Amp r,Tet r),即表

明了该质粒具有生物活性。这种转化活性就是检查质粒DNA生物活性的重要指标。

转化体经过进一步纯化扩增后,再将转入的质粒DNA分离提取出来,可进行重复转化、电泳、电镜观察及做限制性内切酶酶解图谱、分子杂交、DNA测序等实验鉴定。

为提高转化率,实验中要注意以下几个重要因素:

(1)细胞生长状态与密度:不要用已经过多次转接及贮存在4℃或室温的培养菌液;细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为最佳(可通过测定培养液A600nm控制),密度不足或过高均会使转化率下降。

(2)转化的质粒DNA的质量与浓度:用于转化的质粒DNA应主要就是共价闭环DNA(即cccDNA,又称超螺旋DNA),转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时则会使转化率下降。

(3)试剂的质量:所用的试剂,如氯化钙等,应就是高质量的,且最好分装保存于干燥的暗处。

(4)防止杂菌与其它外源DNA的污染:所有器皿,如离心管、分装用的Eppendorf管等,一定要干净,最好就是新的。整个实验过程中要注意无菌操作。

氯化钙转化法由Cohen等首创。其转化率一般能达到每1 μg超螺质粒DNA 产生5×106~2×107个转化体,足以满足常规基因克隆试验的需要。该法具有简单、快速、稳定、重复性好、菌株适用范围广等优点而被广泛采用。

三、仪器、材料与试剂

材料:E、coli DH 5α受体菌(Amp s,Tet s),pBR322质粒

试剂:含抗菌素的LB平板培养基:将配好的LB固体培养基高温灭菌20 min 后,冷却至60℃左右,加入氨苄青霉素与四环素贮存液,使终浓度分别为50 μg/mL 与12、5 μg/mL,摇匀后铺板。

LB液体培养基:胰蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,氯化钠10 g/L,用氢氧化钠调节至pH 7、5。120℃高温灭菌20 min。

氨苄青霉素与四环素贮存液:用50%乙醇配制。

0、1 mol/L 氯化钙溶液:每100 mL溶液中含无水氯化钙1、10 g,用无菌重蒸水配制,灭菌处理。

仪器:恒温摇床、电热恒温培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴箱、分光光度计、台式离心机、带盖离心管、吸量管或自动加样器、Eppendorf管等。

四、实验内容

1、感受态细胞的制备

(1)从新活化的E、coli DH 5α菌平板上挑取一单菌落,接种于3 mL LB液体培养基中,37℃振荡培养12 h左右至对数生长期。将该菌悬浮液以1:100接种量

转接于100 mL LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30 min测一次A600nm,至A600nm≤0、7停止培养。

(2)培养液转入离心管中,在冰上冷却片刻后,于0~4℃,4000 r/min离心10 min。倒出上清培养液,并将离心管倒置在滤纸片上1 min,使残留的培养液流尽。用10 mL冰冷的0、1 mol/L 氯化钙溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~30 min。于0~4℃,4000 r/min离心10 min。弃去上清液,加入2 mL冰冷的0、1 mol/L 氯化钙溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后即制成了感受态细胞悬液。

(3)以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24 h后直接用于转化实验,也可加入等体积30%灭菌甘油,混匀后,分装于0、5 mLEppendorf管中,每管含100~200 μL感受态细胞悬液,置于-70℃条件下保存半年至一年。

2、转化

(1)取100 μL摇匀后的感受态细胞悬液(如就是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面操作),加入pBR322质粒DNA溶液2 μL(含量不超过50 ng,体积不超过10 μL),此管为转化实验组。

同时做两个对照管。

受体菌对照组:100 μL感受态细胞悬液+2 μL无菌重蒸水。

质粒DNA对照组:100 μL 0、1 mol/L 氯化钙溶液+2 μLpBR322质粒溶液。

(2)将以上各样品轻轻摇匀,冰上放置30 min后,于42℃水浴中保温1、5 min,然后迅速在冰上冷却3~5 min。

(3)上述各管中分别加入100 μL LB液体培养基,则总体积为0、2 mL,该溶液称为转化反应原液。混匀,于37℃水浴中温浴45 min(欲获得更高的转化率,此步也可恒温摇动培养),使受体菌恢复正常生长状态,并使转化体产生抗药性(Amp r,Tet r)。

3、稀释与平板培养

(1)将上述经培养的转化反应原液摇匀后,进行梯度稀释,方法见表1、

表1 转化反应原液梯度稀释表

(2)分别取适当稀释度的各样品培养液0、1 mL,接种于两种(含抗菌素与不含