酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量

酶联免疫法（ELISA ）测定植物激素含量

姓名：李希东 专业：植物学 学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：

一、实验目的：

掌握间接法测定植物激素的原理和方法； 了解逆境对玉米根系ABA 和IAA 含量的影响。

二、实验原理：

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay ，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。ELISA 把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。

间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。图A 表示间接酶联免疫方法的基本原理：

A.间接酶联免疫原理示意图

示反应板（固相载体）

示激素特异抗体（一抗）

示激素（抗原） 示非特异二抗

示蛋白质·激素复合物 示标记酶

本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:

Ab 十H 十HP=AbH 十AbHP

其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，RF结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP 的多少，就可以确定游离H量的多少。

三、实验器皿：

1、材料：正常条件和NaCl处理下的玉米种子

2、仪器:

天平、研钵、离心管（5mL）、离心机、青霉素小瓶、封口膜、培养箱、反应板、解剖盘、纱布、移液枪（1000μL、100μL、50μL）、滤纸、酶联免疫测定仪

3、试剂:

包被缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)，样品稀释液，底物缓冲液，洗涤液，终止液，提取液。（缓冲液均放入4℃冰箱储存）

四、实验步骤：

1. 样品中激素的提取（计量）

称取1g 左右材料，加2ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆(一定要磨细)，转入5ml离心管，再用2ml 提取液分次冲洗研钵并转入离心管中，摇匀。

在4℃下提取4h，3000~4000rpm 离心15~20min，取上清液，沉淀中加1ml 提取液，摇匀，置4℃下再提取1hr,离心，合并上清液。记录体积，残渣弃去。

将一定体积的上清液转入青霉素小瓶中，吹干（低温保存），用样品稀释液定容(一般1g 样品用1ml样品稀释液定容)，摇匀后再用于测定。

2. 样品测定

（1）包被：向反应板中每孔加100μL IAA抗原，将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，37℃保温3h。

（2）洗板室温下平衡，洗涤液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。

（3）竞争:

a、配标样：IAA 稀释成一系列浓度(2000 ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250、125、62.5、

31.25、0) 8个。

b、加标样及样品：每个浓度加2孔，每孔50μL，每个样品重复2孔，每孔50μL，边缘孔不加。

c、加抗体：每孔加50μL，将酶标板放入湿盒内开始竞争。37℃0.5h

（4）洗板

（5）加底物显色：每孔加100μL (在暗处操作)，然后放入湿盒内，当显色适当后，即0 ng/ml 孔OD490nm为1.2~1.5，而本底即完全抑制孔不超过0.1~0.2，( 两者之差为1左右) 。每孔加入50μL 2~3 mol/L硫酸终止反应。15-20min

比色：用标准曲线最高浓度孔调0，测定OD490nm

五、实验记录

1. 酶标板加样记录

表1 酶标板加样图

2. 测定标准曲线

表2 不同浓度标样激素测定值

2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0

0 0 0.42

0.45

0.36

0.47

0.60

0.62

0.75

0.71

0.92

0.87

0.82

0.98

0.98

0.98

4. 实验结果记录

表3 样品测定结果

5. 实验结果

ABA含量（ng/ml）对照玉米盐胁迫玉米

玉米根部1 玉米根部2 平均值363.937

583.571

363.937

697.229

583.571

638.756

玉米茎尖1 玉米茎尖2 平均值583.571

824.976

697.229

1252.317

583.571

871.045

实验结果对照玉米盐胁迫玉米

玉米根部1 玉米根部2 平均值0.78

0.78

0.78

0.68

0.71

0.695

玉米茎尖1 玉米茎尖2 平均值0.71

0.57

0.64

0.65

0.71

0.68