生化技术实验指导书(20学时)

生化技术实验指导书

湖北工业大学生物工程学院

二0一0年三月修订

实验一酵母RNA的提取及其组分的鉴定

一、实验目的

1.了解稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的基本原理；

2. 掌握稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的具体操作方法。

二、实验原理

酵母中RNA的含量比较丰富（2.67%~10%），而DNA的含量相对地较少（据资料报道，酵母DNA的含量低于RNA的20%），因此从酵母中提取RNA比较方便。RNA溶于碱性溶液，碱性溶液使蛋白质带负电荷，促进RNA(带负电荷)与蛋白质的分离，碱性溶液可使酵母细胞壁变性，同时进行加热，可增加细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。因此，酵母粉用稀碱液加热抽提时，可将其中的RNA抽提出来。当碱性抽提液中和后，加入2倍体积的95%乙醇时，可以使抽提物沉淀出来。抽提物的主要成分是RNA的钠盐，并带有少量的蛋白质。用碱抽提时，RNA会有不同程度的降解。

地衣酚（3，5-二羟基甲苯）是比较灵敏的测定戊糖的试剂，常用于测定RNA。核糖与地衣酚试剂反应呈现鲜绿色。地衣酚试剂反应灵敏，也易被其他物质干扰。DNA中的脱氧核糖也可与地衣酚反应，因此，单靠地衣酚显色实验不能作为RNA 与DNA鉴别依据。

二苯胺试剂是常用于测定DNA中脱氧核糖的试剂，脱氧核糖与二苯胺试剂反应产生蓝色物质，而RNA中的核糖一般不与苯胺起反应。

嘌呤碱可与硝酸银反应生成白色的嘌呤银化合物的沉淀。

双缩脲反应是检验蛋白质常用的颜色反应。双缩脲或含有两个以上肽键的化合物（蛋白质、肽等）在碱性条件下与硫酸铜反应生成紫红色的配合物。如果蛋白质含量很低时，此颜色反应不易观察到。

三、试剂与器材

1. 试剂：

（1）酵母粉（药用）；（2）0.5%NaOH溶液；

（3）乙酸；（4）10%硫酸溶液；

（5）氨水；（6）5%硝酸银溶液；

（7）95%乙醇；

（8）地衣酚试剂（硫酸铁铵1.35g，地衣酚2g，用蒸馏水配成50mL作为母液，保存于冰箱中。使用前，取母液2.5mL，加浓盐酸41.5mL再加蒸馏水60mL）；

（9）二苯胺试剂（1.5g二苯胺溶于100mL高纯度的冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸）；

（10）10%氢氧化钠溶液；（11）1%硫酸铜溶液。

2. 器材：

（1）离心机3000转/分以上

（2）100mL离心管4支

（3）100mL烧杯1支

（4）试管5支

（5）50mL量筒1只

（6）水浴锅1只

（7）电炉1台

（8）台式天平1架

四、实验操作

1．提取

取酵母粉4g，放入100mL烧杯中，加0.5%氢氧化钠溶液30mL，将烧杯置沸水浴上加热半小时，并不时搅拌。加热完毕，加入乙酸约4~5滴使溶液呈微酸性

（pH6），然后倒入离心管中离心15分钟（3000转/分）。取上清液于100mL的烧杯中，加入2倍体积的95%的乙醇，边加边搅拌，最后静置待其沉淀完全。进行过滤，滤渣先用15mL95%乙醇分2次洗涤。继用15mL无水乙醇分2次洗涤，洗涤时可用玻璃棒轻轻地把滤渣搅动，以免下层滤渣洗涤不到，待乙醇滤干后完成成分的鉴定。

2. 组成成分的鉴定

（1）将上述提取到的沉淀物刮到100mL烧杯中后，溶于10mL 10% 的硫酸溶液中，直接在电炉上加热，煮沸1~2分钟进行水解；

（2）取水解液0.5mL，加入地衣酚试剂1mL，直接加热，煮沸1分钟，观察颜色变化；

（3）取2mL 水解液，加入氨水2mL及5%硝酸银1mL，摇匀后观察是否产生絮状的沉淀物（如不出现，放置10min再观察）；

（4）取1mL 水解液，加10% NaOH 10滴，摇匀后再加1%硫酸铜溶液2滴，静置一会儿观察有无紫玫瑰色出现；

（5）取1mL 水解液加2mL二苯胺试剂，摇匀后，沸水浴中加热10分钟，观察颜色变化；

试从上述（2）~（5）四个反应的情况，说明从酵母中提出的物质是不是RNA。

五. 注意事项

1. 乙醇试剂易燃，应远离火源；

2. 用烧杯加热反应时，防止溶液外溅伤人；

3. 离心时一定要将离心管和内容物在天平上称平衡后再对称放入离心机中离心，否则会损坏离心机并发生事故；

4. 过滤前滤纸用乙醇湿润，不能用水湿润，因为RNA溶于水；

5. 滤下来的乙醇应回收使用。

六、思考题

1.本实验是根据RNA的哪些性质设计的？其设计思想如何？

2.在提取RNA过程中所用试剂及加热的作用是什么？

3.在进行组分鉴定前为什么RNA溶于10%的硫酸中进行水解？

4.稀碱法提取RNA为什么先不破壁？

5.提取RNA有哪些方法？如果提取具有活性的RNA最好采用哪一种方法？还应注意些什么？

6.提取DNA又有哪些方法？如果提取具有活性的DNA最好采用哪种方法？

7.试分析RNA水解液进行组分鉴定的现象并解释其现象产生的原因。

8.试分析本实验操作关键和注意事项，为什么？

实验二地衣酚显色法测定RNA含量

一、实验目的

学习和掌握测定RNA含量的方法—地衣酚显色法的原理和操作方法。

二、实验原理

在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色复合物，其吸收高峰在670nm处。当核糖核酸浓度在10~100ug/mL范围内，吸光度与其浓度呈线性关系。

三、试剂与材料

（1）标准RNA母液：准确称取RNA10.0mg，用少量蒸馏水溶解（如不溶，可滴加浓氨水，调pH7.0），定容至10.0mL，此溶液每ml含RNA1mg。

（2）标准RNA溶液：取母液1.0mL，置10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液为100ugRNA/mL。

（3）样品溶液：将一定量的RNA粗品（用上次实验所提取的RNA代替）用蒸馏水溶解到一定浓度。

（4）地衣酚—三氯化铁试剂：将100mg地衣酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.H2O（催化剂），临用时配置。此配法与我们以前用稀碱法提取RNA的地衣酚（苔黑酚）试剂不同。

四、实验操作

1. 标准曲线的制作

分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL RNA标准溶液，用蒸馏水补充至2.0mL，各加入2.0mL地衣酚试剂，混匀，于沸水浴中加热45min。自来水冷却后，测定OD670。以RNA的量为横坐标，OD670为纵坐标，绘制标准曲线或求出回归方程。