微生物工程

（2）生长繁殖快，代谢能力强
大肠杆菌（Escherichia coli）在适宜的条件下，每
20分钟即繁殖一代，24小时即可繁殖72代，由一个菌 细胞可繁殖到47×1022个，如果将这些新生菌体排列 起来，可绕地球一周有余； 生理基础:因为微生物的代谢能力很强, 由于微生物个 体微小，单位体积的表面积相对很大，有利于细胞内 外的物质交换，细胞内的代谢反应较快。 极大的物质资源:正因为微生物具有生长快、代谢能力 强的特点，才使得微生物能够成为发酵工业的产业大 军，在工、农、医等战线上发挥巨大作用； 在物质转化中的作用:如果没有微生物，自古以来的动 、植物尸体不能分解腐烂，早已是动、植物尸体堆积 如山，布满全球。
7.琥珀酰CO A
6.-酮戊二酸脱氢酶
按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：
㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸； ㈡丙酮酸族
包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；
㈢天冬氨酸族（早酰乙酸族）
包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；
㈣磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；
源为原料； ③过程反应以生命体的自动调节方式进行； ④能合成复杂的化合物如酶、光学活性体等； ⑤能进行一些特殊反应，如官能团导入； ⑥生产产品的生物体本身也是产物，含有多种物
质； ⑦生产过程中，需要防止杂菌污染； ⑧菌种性能被改变，从而获得新的反应性能或提
高生产率。
2.微生物工业的范围
⑴酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等） ⑵食品工业（酱、醋等） ⑶有机溶剂发酵工业（酒精等） ⑷抗生素工业（青霉素、链霉素、土霉素等） ⑸有机酸发酵工业（柠檬酸、醋酸、乳酸等） ⑹酶制剂工（淀粉酶、蛋白酶等） ⑺氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） ⑻核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸等） ⑼维生素发酵工业（维生素B族等） ⑽生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等） ⑾微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、SCP等） ⑿微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等） ⒀生物能工业（沼气、纤维等发酵生产酒精、乙烯等物质） ⒁微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等）
微生物工程
2020年5月24日星期日
本章主要内容
一．微生物工程的概念 二．常见的工业微生物 三．微生物育种技术 四．微生物的营养和生长 五．发酵工业的生产流程 六．生物反应器和反应动力学 七．微生物发酵产品 八．资源和能源领域中的微生物工程
（一） 微生物工程概念
微生物工程：就是研究利用微生物的新陈代谢作用生产 一定的产品或达到其他社会目的的工程科学。
（2） 细胞壁的分类
革兰氏阳性菌 (G+)
① 肽聚糖
② 磷壁酸
革兰氏阴性菌(G-) ① 脂多糖 ② 磷脂 ③ 脂蛋白 ④ 肽聚糖
（3）革兰氏染色
由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立
细菌固定 结晶紫初染
结果: 阳性菌G+—紫色 阴性菌G-—红色
碘液媒染 乙醇脱色
番红复染
Gram stain of G+ Staphylococcus cells.
Gram stain of G- E. coli cells
（三）放线菌
1 放线菌的形态构造 细胞呈分枝丝状，介于细
菌和真核生物之间；与 细菌相似 ▪ 细胞壁主要为肽聚糖 ▪ 革兰氏染色阳性 ▪ 原核 ▪ 单细胞、多核 ▪ 菌丝直径与细菌相仿
分布 只要有有机物就有霉菌的踪迹 有机分解者：纤维素和木质素
2霉菌的细胞形态与构造
霉菌营养体的基本单位是 菌丝，其直径通常为3－ 10mm，与酵母菌相似
菌丝的分类（菌丝中是否 有隔膜） 无隔菌丝：毛霉、根霉 有隔菌丝：曲霉、青霉
4 繁殖
5 霉菌与生产和生活的关系
工业产品：有机酸、酶制剂、抗生素、 维生素、生物碱、生物活性物质、药物 食品的生产制造：酱油、干酪 工农业产品的霉变 植物病原菌 疾病：真菌毒素、黄曲霉毒素
二 常见的工业微生物
（一）微生物的基础知识 （二）细菌 （三）放线菌 （四）酵母 （五）霉菌
（一）微生物的基础知识
1.什么是微生物：
微生物（microorganism, microbe）是一类个体微 小、结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的 统称。
2.主要微生物类群：
这个微小生物类群十分庞杂，它包括小到没有细 胞结构的病毒（virus），单细胞原核的细菌（ bacteria）、放线菌（actinomyces）、支原体（ mycoplasma）、立克次氏体（rickettsia）、衣原体 （chlamydia）等和属于真菌的酵母菌（yeast），霉 菌（molde）等和原生动物（protozoa）等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3 酵母菌细胞结构
4 繁殖方式
5 酵母菌与生产和生活的关系
酵母菌与人类的关系
① 酒类的生产 ② 面包的制作 ③ 乙醇甘油发酵 ④ 石油及油品脱蜡 ⑤ 饲用药用 ⑥ 单细胞蛋白生产SCP ⑦ 活性物质提取 ⑧ 微生物学研究 ⑨ 真核表达系统 ⑩ 人类疾病
（五）霉菌
1 霉菌：菌丝体发达而又不产生大型肉质 子实体的丝状真菌
细胞内存在两种S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶
SAM1：其基因的转录在高浓度蛋氨酸存在 下受到抑制
SAM2：转录不受蛋氨酸的抑制
据此，可大大提高SAM2在DNA的拷贝， 或者
10.苹果酸脱氢酶 9.延胡索酸酶
8.琥珀酸脱氢酶
1.丙酮酸脱氢酶复合体
2.柠檬酸合成酶
3.顺乌头酸酶
4.顺乌头酸酶
5.异柠檬酸脱氢酶
按照对细胞生长是否需要氧气，发酵过程可分为
好氧发酵：以氧作为电子受体。如动植物细胞培 养，微生物发酵生产抗生素、有机酸、氨基酸 等
厌氧发酵：一般以有机物作为电子受体。如酒精 发酵和乳酸发酵、丙酮和丁醇等及其沼气发酵 等。
发酵产品的生产特点：
①一般操作条件比较温和； ②以淀粉、糖蜜等为主，辅以少量有机、无机氮
③ 螺旋形 宽×长 0.5～1×1～50um
④ 其它形状：丝状、三角形、方形等
⑤ 异常形态
⑥ 畸形：由于化学或物理因素刺激，阻碍了细 胞的发育，从而引起了异常的形态。
⑦ 衰颓形：由于培养时间过长，营养缺乏，代 谢排泄物浓度积累过高等使细胞衰老而引起 的异常形态
2 细菌的基本结构
一般结构
细胞壁 细胞膜 核区 细胞质
特殊结构
荚膜 芽孢 鞭毛
3 革兰氏染色
（1）细菌细胞壁 细胞壁：位于细胞最外层的一层厚实、坚韧的外被，主
要成分是肽聚糖，具有固定细胞外形和保护细胞不受 损伤等生理功能。 细胞壁的生理功能 ① 提高机械强度、固定细胞外形、保护细胞不受损伤 ② 为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需 ③ 一定的屏障作用（阻碍有害大分子的进入） ④ 与细菌抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关
2 菌丝 基内菌丝（一级菌丝、营养菌丝） 气生菌丝（二级菌丝） 孢子丝（繁殖菌丝）
（四）酵母
酵母菌：泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌 1 特点 ① 单细胞状态 ② 出芽繁殖 ③ 发酵糖类产能 ④ 细胞壁含甘露聚糖 ⑤ 含糖量高、酸度较大的水生环境
2 酵母的形态
酵母细胞的形态与构 造 细胞大小：细菌的10 倍 细胞形态：球状、卵 圆状、柱状、香肠状
（3）遗传稳定性差，容易发生变异
微生物个体微小，对外界环境很敏感，抗逆性较差，很 容易受到各种不良外界环境的影响；另外，微生物的结 构简单，缺乏免疫监控系统, 很容易变异。
微生物的遗传不稳定性，是相对高等生物而言的，实际 上在自然条件下，微生物的自发突变频率为10-6左右。
微生物的遗传稳定性差，给微生物菌种保藏工作带来一 定不便。
其二、在SAEC抗性突变菌株基础上再进一步筛选出L-丙氨酸营 养缺陷型菌株。
其三，在SAEC抗性突变菌株基础上，选育对SAEC、γ-甲基L-丙氨酸（L-丙氨酸类似物）和α-氯代己内酰氨（L-亮氨 酸的结构类似物）具有多重抗性的L-丙氨酸营养缺陷型菌株 ，则L-赖氨酸产量会提高更多
通过上述步骤，赖氨酸的产量变化如下：
三 微生物育种技术
（一）为什么要发展微生物育种技术 微生物育种：是以提高微生物菌株生产 性能为目标，人为改造微生物菌株的遗 传性能的过程
（二）主要的维生素育种技术介绍 1 诱变育种技术 2 代谢工程育种技术
3 DNA重排育种
1 诱变育种技术
（1）基本原理
利用一些物理和化学的因素处理微生物细胞，使其遗传性状发 生随机的突变，得到大量性状各异的突变株，然后再从众多突变 菌株中以一定的方法筛选出生产性能改善的个体。
代谢工程：又称代谢途径或途径工程， 是基于代谢流分析和基因重组技术改善 菌种遗传性状的一种先进技术的工程技 术。 优点：方向性强、目标明确、效率高、技 术手段先进、过程可控性和重现性好等 缺点：需要掌握相应的微生物的代谢和遗 传机理知识，以及基因操作工具。
举例：S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）
SAM：是甲硫氨酸 (Met)的活性形式。 在动植物体内广泛存 在，它是由底物L-甲 硫氨酸和ATP经S-腺 苷甲硫氨酸合成酶酶 促合成的。
B育种过程：
第一步是在含有SAEC（硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物） 的培养基上筛选出SAEC抗性的突变株，使菌株的天冬氨酸 激酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸不敏感。为了进一步的提高产量 ，接下来还有多种选择
其一、在SAEC抗性调节突变菌株基础上进一步筛选L-亮氨酸缺 陷型突变株，解除L-亮氨酸的2，3-二氢二羧酸合成酶的抑制 。
3 微生物的生物学特点与作用
（1）种类繁多、分布广泛 （2）生长繁殖快，代谢能力强 （3）遗传稳定性差，容易发生变异
（1）种类繁多、分布广泛
微生物的多样性已在全球范围内对人类产生巨大 影响。
土壤中微生物的种类繁多，几乎所有的微生物都能 从土壤中分离筛选得到，要分离筛选某中微生物， 多数情况都是从土壤采取样品。 首先微生物为人类创造了巨大的物质财富，目前所 使用的抗生素药物，绝大多数是微生物发酵产生的 ，以微生物为劳动者的发酵工业，为工、农、医等 领域提供各种产品。 另外微生物也为人类带来巨大危害，如疫病的传播 ，并且引起疫病传播的新微生物种类总不断出现。
一般的，微生物工程又可称为发酵工程，但严格来说， 发酵（微生物培养）只是微生物工程的一部分，而不 是全部，但是其核心内容。
通常，微生物工程分为两大部分：
▪ 发酵部分：主要是通过一系列的环节，提供条件，使 菌体生长繁殖，并产生发酵所要的目的产物（代谢产 物）。
▪ 提纯部分：这部分是通过一些物理的、化学的手段、 方法，将代谢产物从发酵醪中提纯出来，获得最终产 品。
另一方面，正因为微生物的遗传稳定性差，其遗传的保 守性低，使得微生物菌种培育相对容易得多。通过育种 工作，可大幅度地提高菌种的生产性能，其产量性状提 高幅度是高等动、植物所难以实现的。
（二）细菌
1 细菌的基本形态 ① 球形 球菌：直径
0.5×2um
② 杆形 宽×长 0.5～1×1～5um ③ 大肠杆菌：0.5×2um
㈤芳香族
包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；
另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。
(5)举例
L-赖氨酸 合成步骤 三羧酸循环、天冬氨酸的生物合成、细菌和植物
合成L-赖氨酸、苏氨酸的生物合成
天冬氨酸激酶
2，3-二氢二羧酸合成酶
从上图可以看出，影响L-赖氨酸产量的因素 表现在3个方面：
一、L-赖氨酸和L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸 激酶
二、L-亮氨酸会抑制2，3-二氢二羧酸合成酶
三、赖氨酸合成需要消耗大量的丙酮酸，而 丙酮酸也是丙氨酸、亮氨酸等多种氨基酸 的共同前体，因此丙氨酸等生成可减少赖 氨酸的合成。
注：SAEC是硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物，SAECr表示是SAEC抗性 Leu 表示亮氨酸 Leu-表示此此菌株是亮氨酸缺陷型菌株 Ala表示丙氨酸， Ala-表示此此菌株是丙氨酸缺陷型菌株 MA是γ-甲基-L-丙氨酸，系L-丙氨酸类似物
CCL 是α-氯代己内酰氨，系L-亮氨酸的结构类似物
2 代谢工程育种技术
（2）诱变剂：用于处理微生物以使其发生突变的物理或化学因素 。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两种
以选育高产突变株为例
(3) 诱变育种的步骤
原始菌种 原菌种特性鉴定
纯化
斜面/肉汤培养
单孢子/单细胞悬液
诱变剂处理
计算存活率
平板分离 观察形态变异，挑单 菌落
移至斜面
复筛
小试 良种保藏
初筛
中试
（4）分离和筛选