蛋白质和酶的分离与纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定

蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。

目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。

一、质分离纯化的一般原则

1. 原料的选择

原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。

蛋白分布：体液、组织、细胞定位

2. 破碎方法：

(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。

如：捣碎法、研磨、匀桨法

(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

如：反复冻融、渗透压、超声破碎

(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.

如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）

(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等

3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法

4. 先粗后细，分级分离

粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。

精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。

5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）

二、常用的蛋白质的分离纯化技术

可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。

（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离

1. 蛋白质盐析

蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。

大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称为蛋白质的盐溶现象，而盐浓度达到一定以后，蛋白质水化膜被破坏，电荷被中和，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出，这就是盐析现象。

由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

常用的中性盐：硫酸铵、醋酸钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中最常用的是硫酸铵，它的优点是温度系数小，溶解度高（25℃时的饱和度为4.1mol/L，即767g/L；0℃时的饱和度为3.9mol/L，即676g/L）；在这一溶解度范围内，许多蛋白都可以盐析出来；另外，硫酸铵不容易引起蛋白质变性；不同浓度硫酸铵pH在4.5-5.5之间，可以结合等电点进行分离纯化，沉淀效果更好。

影响盐析的因素：①温度：②pH：③蛋白质浓度：

盐析的缺点是蛋白质沉淀后要除盐，否则会影响后续的电泳或离子交换等相关实验。2. 等电点沉淀法

蛋白质在等电点时，也就是静电荷为零时，蛋白质颗粒之间的静电排斥力减小，蛋白的溶解度下降，容易发生沉淀，因此，可以调节溶液的pH，使其达到目的蛋白的等电点，使之沉淀而分离。但是，此方法很少单独应用，一般与盐析法或后述的有机溶剂沉淀法联合应用效果更好。

3. 有机溶剂沉淀法

有机溶剂可使溶液的介电常数降低，蛋白之间的静电引力增大，互相吸引而易于集聚；

也可使水化膜破坏，蛋白的溶解度降低。

优点：易于进一步的分离，不用脱盐

缺点：易引起蛋白的变性，所以沉淀后要尽快的分离

常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。

（二）根据蛋白质分子大小进行分离

1. 透析与超滤

透析就是利用透析膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤是利用压力和离心力，促使大小不等的分子通过滤过膜，两者都是根据化合物的分子量进行分离的一种方法，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。

2.凝胶过滤法

是以各种多孔凝胶为固定相，对不同分子量的组分进行分离的一种层析方法。也叫凝胶

过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。 常用的凝胶材料:

① 葡聚糖凝胶（Sephadex)：是由葡聚糖交联而成，具有良好的化学稳定性，耐高温（>120℃）, 型号多，可用于各种物质的分离和纯化。

② 琼脂糖凝胶（Sepharose)：是一种天然多孔凝胶，孔径大，适用于大分子量分子的分离。

③ 聚丙烯酰胺凝胶：是人工合成的凝胶，交联度不同，孔径不同，可用于各种蛋白的分离。缺点是强酸会使凝胶的酰胺键破坏。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离 1. 电泳法

各种蛋白质在同一pH 条件下，因为分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而彼此分离。 2. 离子交换层析法

是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。

离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不溶性高分子化合物，这些基团能与溶液中的其它阳离子或阴离子进行可逆的交换。

按活性基团性质不同：阳离子交换剂 阴离子交换剂

按母体物质种类不同：离子交换树脂：小分子量蛋白质分离 离子交换凝胶：各种分子量蛋白质分离

离子交换纤维素：各种分子量蛋白质分离

① 阳离子交换

阳离子交换剂中含有酸性基团，能解离出氢离子，与样品溶液中的阳离子进行交换。 强酸型阳离子交换剂：磺酸（R-SO 3-H ）

弱酸型阳离子交换剂：磷酸（R-HPO 3

-H ）

羧酸（R-COO-H ） 酚羟基（R-O-H ）

② 阴离子交换

阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离子，与样品溶液中的阴离子进行交换。 强碱型阴离子交换剂：季胺 [R-N +(CH 3)3-OH -] 弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N +HH 2-OH -)

R-SO -3-H ++Na +R-SO -3-Na ++H +

H +H +H

+

基架活性基团