噬菌体展示技术

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噬菌体展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬 菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。
Smith GP. Science 1985; 228:1315-7
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phagemid vectors
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噬菌体质粒－方便克隆、增强遗传稳定性
Phage display with phagemid vectors
噬菌体质粒特征： 携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基 因，没有其他噬菌体基因。 有质粒复制起点(322 ori)和噬菌体复制 起点(f1 ori－用于合成ssDNA)。 有包装序列信号（packing signal）。 有供筛选的抗生素标记基因。 Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成 ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（f1 ori defect)。 包装后的噬菌体包含有两种不同来源的成份：噬菌体质粒和Helper phage。
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噬菌体展示的应用
蛋白质－蛋白质相互作用
噬菌体cDNA文库与芯片相结合 (a)合成噬菌体cDNA文库。 (b)生物淘选。 (c)铺板，挑克隆入微孔板， 为制备芯片做准备。
General selection scheme for cDNA expression-products displayed on phage surface. Konthur et al 2003 TARGETS Vol. 2, No.6 261-270.
为 了 确 定 FLAG 抗 原 决 定 簇 序 列 DYKDDDDK中哪一个氨基酸是抗体结合 所必需的，将单克隆抗体包被于96孔 板，对Ph.D.-7展示文库进行三轮淘 选。 对每轮淘选所得到的克隆测序，结果 清晰地显示核心抗原决定簇是DYKXXD, 其中X可以是任意氨基酸。
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次要衣壳蛋白pIII
BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS. VOL 1. NO 2. 189–203. JULY 2002
406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。 由三个功能区组成： N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白； 穿膜区： 与噬菌体的入侵有关。 N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 区： CT 疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌 疏水区： 体组装终止有关。 G1、G2: 甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个 功能域之间的灵活性。
噬菌体展示系统 Phage on display
• • • 噬菌体展示原理 噬菌体展示应用 商业化噬菌体展示系统
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噬菌体展示的应用
• • • • 抗原表位分析 制备特异性抗体 制备疫苗、多价疫苗 构建新型的生物催化剂 如Ren et al (1997)将T4 DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的 融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。 有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工 的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一 个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。
淘选的方法－亲和淘选
• 直接包被法淘选法： • 优点：简单直接。 优点： • 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 缺点： • 可能是由于分子的立体封阻 • 或者是靶分子表面的部分变性而引起
• 液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬 液相法： 菌体 - 靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包 被的表面。
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淘选
Finding the needle in the haystack: Screening phage display libraries
建立 噬菌体展示库
淘选 噬菌体展示库
分析克隆
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改进 helper phage
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展示cDNA文库
Selection from cDNA libraries
Carmeri et al. Gene 1993
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pJuFo噬菌质粒中加入了Jun and Fos Leu Zipper基因 两个基因都以 PelB 作为signal sequence，以lac作为promoter/operator。 NH2- pelB + Jun Leu zipper + C-terminal domain pIII-COOH NH2- pelB + Fos Leu zipper + cDNA-product –COOH Jun和Fos通过二硫键形成异源二聚体
丝状噬菌体：M13、f1和fd 。 单链DNA病毒,6407 bp。 基因组编码11种蛋白质，其中5 种为结构蛋白质。 与展示密切相关的有两种结构蛋 白质。 DNA在细菌内滚环复制，细菌不 被裂解，但生长速度减慢，并且 分泌大量噬菌体颗粒。
Schematic representation of M13 Phage
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True phage
多价展示 筛选到的分子亲和力相对低 极少或无未展示的噬菌体 高拷贝数增加了抗原性 可能会影响噬菌体的组装和增殖
Phagemid
单价展示 亲和力高 大部分是未展示的噬菌体*
易克隆，遗传稳定性好
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Infection of E.coli by Ff baceriophage
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主要衣壳蛋白pVIII
每个病毒子含约2700个拷贝，约10% 能有效地融合外源多肽或蛋白。 以pIII融合子方式表达的多肽是低 价的，而以pVIII融合子方式表达的 多肽则是高价的（每个病毒子~200 个拷贝）。 这种高价pVIII展示所增加的亲和力 有利于筛选到亲和力非常低的配体， 而低价pIII展示则将筛选限制在具 有较高亲和力的配体上。 所有Ph.D.文库都是pIII融合方式 （每个病毒子展示5个拷贝的外源多 肽）。
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噬菌体展示的应用
筛选酶抑制剂 是寻找抑制酶活性肽段的 理想工具。 Dennis从肽库中筛选到非 竞争性地抑制 F VIIa 活 性的肽段。
Coagulation Cascade. A current simplified view of the coagulation cascade initiated by the TF•FVIIa complex is shown.
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噬菌体展示系统 Phage on display
Of Needles and Haystacks
Exponential growth in publications referring to phage display. The number of Medline citations containing the terms ‘phage’ and ‘display’ are plotted against the year of publication. TIBTECH NOVEMBER 1999 (VOL 17).
是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 外源多肽或蛋白 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于 DNA 病毒粒子内。 使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分 子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
表型——基因型 展示肽——编码基因
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噬菌体肽库淘选示意图： 亲和筛选
噬菌体肽库与靶分子相互作用
洗涤去未结合的或非特异性结合 的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘选后，克隆测序
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测定抗FLAG M2单克隆抗体的 抗原决定簇
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多价展示？单价展示？
Polyvalent or monovalent display?
展示价位（Display valency)：噬 菌体表面展示的多肽的拷贝数。 展示价位不同所筛选的分子亲和力 就会不同。 用噬菌体质粒时，以pIII展示为例： <10%病毒展示为单价，非常少量的 展示为两个拷贝，绝大多数只展示 野生型pIII。 The major displaying species is monovalent, but most particles do not display at all.
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NEB 完美品质 成就科学梦想
报告人：杨毅 MD PhD
Email: support@neb-china.com
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展示系统 Display System
Phage Display Cell Based Cell Surface Display
Cell Free
Ribosome Display mRNA Display
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噬菌体展示系统的分类
Classification of phage display systems
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Life Cycle of M13
pIII蛋白结合于 E.Coli 的F 纤毛; 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的衣壳蛋白，转运至胞浆 （再用）; 病毒ssDNA进入细菌的胞浆合 成dsDNA； 以dsDNA为模版合成所有的病 毒蛋白，且通过滚环复制合成 组装病毒所需的ssDNA。 第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37oC）。 感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。
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噬菌体展示系统 Phage on display
• 噬菌体展示原理 – 噬菌体展示定义、分类来自百度文库– 简介噬菌体及淘选过程 噬菌体展示应用 商业化噬菌体展示系统
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什么是噬菌体展示
根据噬菌体不同 根据噬菌体不同 根据载体不同 根据载体不同 根据文库不同 根据文库不同
Phage Phage M13, f1, fd T7, T4, lamda
Vector Vector True Phage Phagemid
Library Library 随机肽库 cDNA文库 抗体文库 蛋白质文库
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Types of phage display system
pVIII 展示的多肽比较小，如 果太大会影响噬菌体壳蛋白的 组装。 pIII只要不影响感染，可以展 示300 aa的多肽。 噬菌质粒能展示的蛋白已经达 到86 kDa。
Smith et al. (1997) Chem. Rev. 97, 391-410
Schematic representation of M13 Phage Schematic representation of T7 Phage
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M13噬菌体的组成和结构
Structure of M13 filamentous phage