动物明胶中3种DNA提取方法的比较研究
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针对以上难点 ,本研究采用 3 种不同的 DNA 提 取方法对明胶中 DNA 的提取效率 、提取质量进行比 较 ,以期获得快速 、高效的适合明胶 DNA 的提取方 法 ,为最终建立简便 、准确 、灵敏度高的明胶中动物成 分来源种类鉴别检测方法奠定基础 。
1 材料与方法
111 材 料 11111 实验样品
方法 2 (蛋白沉淀法) :称取的样品种类和数量同 方法 1 ,并加入到 115 mL 离心管中 ,在管中加入 1 mL 自配的 核 酸 裂 解 液 , 置 65 ℃恒 温 箱 中 温 育 20 min ,在 65 ℃条件下加入 600μL 自配的蛋白沉淀液 , 室温下 12 000 r/ min 离心 10 min ,小心转移上清液至 一新 115 mL 离心管中 ,再加入 018 倍体积的异丙醇 混匀 ,室温放置 2 h 左右 ,12 000 r/ min 离心 10 min , 弃上清液 ,加入 600μL 70 %乙醇洗涤 1 次 ,12 000 r/ min 离心 5 min ,弃上清液 。DNA 溶于 10 μL 水中 , 合并 10 管 DNA 溶液 , - 20 ℃保存 ,备用 。
但目前对动物明胶的来源检测却缺乏相应的检 测手段 。国内对动物胶的检测 ,多集中在对鹿胶 、龟 胶和阿胶的真伪鉴别上 。韩继武等[1 ] 采用理化显色 反应 ,利用不同浓度凝胶的凝胶温度检测鉴别真伪鹿 角胶 ;山东阿胶集团和海洋大学[2 ]利用分子标记技术 检测阿胶原料 ———驴皮的真伪 ,以此确定阿胶的真 伪 ;最近有关于用 SDS 不连续电泳检测鹿胶 、龟胶和 阿胶的报道[3 ] ,通过电泳谱带来区分 3 种不同的胶 , 但该方法对样品处理的要求较高 ,否则难以得到较准 确的结果 。
皮 、牛皮和牛骨的明胶 DNA ,并利用分光光度计对提 取的 DNA 进行 DNA 浓度和纯度测定 。
检测结果表明 :方法 2 对 4 种样品所提取 DNA 的 OD260/ OD280 比值分别为 116801 , 118033 , 116033 和 113089 , 除 1 种 猪 皮 明 胶 外 , 其 余 3 种 样 品 的 OD260/ OD280的比值均低于 118 ,说明所提取的 DNA 纯度不够 , 存在蛋白质污染 ; 方法 2 所提取的样品 DNA 的 OD260/ OD280 比 值 分 别 为 513254 , 413117 , 219319 和 518956 ,远远在双链 DNA 有效纯度 118 的 范围之外 ; 而方法 3 所提取的所有 样 品 DNA 的 OD260/ OD280比值分别为 118366 , 117514 , 210388 和 117728 ,均在 118 ～210 左右 (表 1) ,因此方法 3 的 DNA 提取效果较其它 2 种更好 ,更适合于作为明胶 中的 DNA 提取方法 。
42 2006 V ol . 32 N o . 4 (To t a l 220)
生 工 公 司 ; 核 酸 裂 解 液 ( 10 mmol/ L Tris2HCl ,
400mmol/ L NaCl , 2mmoL Na2 ED TA , 2 % SDS , p H812) ,蛋白沉淀液 (312 mol/ L NaAc ,p H 418) 均为 实验室配制 。 11113 主要仪器设备
称取 1 g 琼脂糖 ,于 50 mL 电泳缓冲液中加热 , 充分溶化 ,加入溴化乙锭至终浓度为 1μg/ mL ,制胶 。 将 5～8μL PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混 合 ,点样 。90 V/ cm 恒压 ,电泳 10～20 min ,凝胶成像 仪观察结果 。
2 实验结果
211 明胶中 D NA 提取质量和效率的比较 用 3 种不同的 DNA 提取方法分别提取来自猪
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
动物明胶中 3 种 D NA 提取方法的比较研究 3
陈 颖 王 晶 吴亚君 钱增敏 徐宝梁
(中国检验检疫科学研究院 ,北京 ,100025)
摘 要 基于 DNA 水平的分子生物学检测方法 ,因其高特异性 、高灵敏度且简便快速等优点 ,成为明胶动物来 源鉴别检测的有效方法 。但明胶的特殊加工工艺给 DNA 的提取带来了一定的困难 。研究中选取了牛皮明胶 、 牛骨明胶和猪皮明胶等不同动物品种和不同动物组织来源的明胶产品 ,采用了试剂盒法 、蛋白沉淀法和裂解抽 提法等 3 种 DNA 提取方法 ,从 DNA 提取质量 、提取效率及明胶动物种类来源 PCR 扩增等方面对 3 种方法进行 了比较 。研究结果表明 ,裂解抽提法所提取的明胶中的 DNA 质量优于前 2 种方法 ,且适合于进一步的 PCR 扩 增检测 ,是适合于明胶 DNA 提取的有效方法 。 关键词 动物明胶 , DNA 提取 , 生物学检测
skin , Gelatin f rom porcine skin , 100 % Type A pork skin Gelatin 及 100 % Type Lime bone Gelatin 四种样 品各 400 mg (每种样品做 3 个重复) ,分 10 管提取 , 每管 40 mg ,加入到 115 mL 离心管中 ,再加入 600μL 核酸裂解液 ,以下步骤按试剂盒说明书进行 。DNA 溶于 10μL 水中 ,合并 10 管 DNA 溶液 , - 20 ℃保存 , 备用 。
扩增反应在 25 μL 的反应体系中进行 。反应成 分为 : 10 ×PCR 缓冲液 215μL , 215 mmol/ L dN TPs 015μL , 10 μmol/ L 上 下 游 引 物 各 015 μL ; Taq 酶 1U ,DNA 模板 5μL ,补足水至 25μL 。
牛源性成分 PCR 扩增反应条件为 :94 ℃预变性 2 min ,94 ℃变性 1 min ,58 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 30 s ,30 个循环 ,72 ℃延伸 5 min ;猪源性成分 PCR 扩增 反应条件为 : 94 ℃预变性 5 min ,94 ℃变性 30s ,59 ℃ 退火 30s ,72 ℃延伸 30s ,30 个循环 ,72 ℃延伸 5 min 。 11213 扩增结果的检测
牛皮明胶 ( Gelatin f rom bovine skin) 和猪皮明胶 ( Gelatin f rom porcine skin) ,购自美国 Sigma 公司 ;猪 皮明胶 (100 % Type A pork skin Gelatin) 和牛骨明胶 (100 %Type Lime bone Gelatin) ,购自罗赛洛 (广东) 明胶有限公司 。 11112 主要试剂
核酸蛋白分析仪 (Beckman DU640) ,恒温箱 ,低 温冷冻高速离心机 ( Eppendorf 5804R) ,微量移液器 , PCR 仪 ( Gene AM P PCR System 9700) ,电泳仪 ,凝胶 成像仪 。 112 实验方法 11211 DNA 提取方法
方法 1 ( 试 剂 盒 法) : 称 取 Gelatin f rom bovine
生产与科研经验
为确定 3 种 DNA 提取方法的优劣 ,对所提取的 明胶样品分别进行牛和猪源性成分的检测 ,扩增所采 用的引物分别来自文献报道 ,其中牛源性成分的扩增 的 上 下 游 引 物 分 别 为 5 ’2CACAA TCCA GAACT2 GACAC23’和 5 ’2GA T GGCT T GGGAA TA GTAC GA2 3’,扩增片段长度为 147bp [4 ] ; 猪源性成分的扩增的 上 下 游 引 物 分 别 为 5 ’2GCCTAAA TCTCCC2 CTCAA T GCTA23 和 5 ’2A T GAAA GA GGCAAA2 TA GA T T T TC G23’,扩增片段长度为 212 bp [5 ] 。
引物由上海博亚生物技术公司合成 ; Wizard Ge2 nomic DNA purification 试剂盒购自美国 Promega 公 司 ; Taq 酶 、dN TPs、PCR 缓冲液 、溴化乙锭 、分子量 Marker (100～600bp) 均购自大连宝生物公司 ;琼脂糖 (电泳纯) ,酚/ 三氯甲烷/ 异戊醇 (25∶24∶1) 购自上海
(猪皮明胶) 100 %Type Lime bone
Gelatin (牛骨明胶)
重复
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
表 1 不同方法提取的 D NA 浓度和纯度
Байду номын сангаас
方法 1
2006 年第 32 卷第 4 期 (总第 220 期) 43
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
样品
Gelatin from bovine skin (牛皮明胶)
Gelatin from porcine skin (猪皮明胶)
100 %Type A pork skin Gelatin
方法 3 (裂解抽提法) :称取的样品种类和数量同 方法 1 ,并加入到 115 mL 离心管中 ,在管中加入 600 μL 自 配 的 核 酸 裂 解 液 , 置 65 ℃恒 温 箱 中 温 育 20 min ,在 65 ℃条件下加入等体积的酚/ 三氯甲烷/ 异 戊醇 (体积比 25∶24∶1) ,室温下 12 000 r/ min 离心 10 min ,小心转移上清液至一新的 115 mL 离心管中 ,加 入等体积的三氯甲烷/ 异戊醇 (体积比 24∶1) ,剧烈振 荡 ,室温下 12 000 r/ min 离心 10 min ,小心转移上清 液至一新的 115 mL 离心管中 ,加入 018 倍体积的异 丙醇混匀 ,室温放置 2h 左右 ,12 000 r/ min 离心 10 min ,弃 上 清 液 , 加 入 600μL 70 % 乙 醇 洗 涤 一 次 , 12000 r/ min 离心 5 min ,弃上清液 。DNA 溶于 10μL 水中 ,合并 10 管 DNA 溶液 , - 20 ℃保存 ,备用 。 11212 PCR 扩增
因此 ,为快速 、高效地鉴定动物明胶的真伪 ,基于
第一作者 :博士 ,副研究员 。 3 国家质检总局资助项目 收稿日期 :2005 - 11 - 21
DNA 水平的分子生物学检测方法 ,便因其高特异性 、 高灵敏度且简便快速等优点而成为首选 。但由于明 胶的加工工艺特殊 ,包括酸 、碱浸泡 ,长时间高温处理 及一系列后续的高强度加工过程 ,再加之特有的物理 性质 ,如高黏度 ,常温水溶剂中不溶性和溶胀性等 ,导 致明胶中的 DNA 难以提取 。德国一家公司自称拥 有从明胶中提取 DNA 专利 ,但未见任何相关报道 。 除此之外 ,也未见其它国家对该类研究的报道 。因此 提取出一定数量和质量的 DNA 是进行明胶分子生 物学检测的前提条件 。
明胶是从动物表皮 、结缔组织和骨组织中的胶原 部分水解得到的不溶性蛋白质 ,由于其特殊的物理特 性 、营养价值和药用功能 ,被作为辅料或药物广泛应 用于食品 、医药和其他工业领域 。
用于明胶生产的动物材料多为屠宰场提供的牛 、 猪 、羊等的皮毛 、骨头 ,其中欧洲明胶工业的主要原料 为牛骨 、牛皮等 。1990 年代 ,英国疯牛病事件在给全 球的肉制品行业带来严重冲击的同时也波及明胶市 场 。由于公众对疯牛病的普遍恐惧和担忧 ,欧洲一些 环保组织已经开始抵制来自牛副产品的明胶 ,各国对 明胶类产品的流通与管理也出台了相应的法规 。伊 斯兰国家出于宗教原因 ,严格禁止猪来源明胶 。我国 每年从国外进口大量明胶以满足生产的需要 ,但明文 禁止从欧盟 、加拿大 、美国 、日本等 20 多个疯牛病疫 区进口牛来源明胶产品 。然而很多进口商提出进口 除牛羊明胶以外的明胶品种 ,如猪明胶 。
1 材料与方法
111 材 料 11111 实验样品
方法 2 (蛋白沉淀法) :称取的样品种类和数量同 方法 1 ,并加入到 115 mL 离心管中 ,在管中加入 1 mL 自配的 核 酸 裂 解 液 , 置 65 ℃恒 温 箱 中 温 育 20 min ,在 65 ℃条件下加入 600μL 自配的蛋白沉淀液 , 室温下 12 000 r/ min 离心 10 min ,小心转移上清液至 一新 115 mL 离心管中 ,再加入 018 倍体积的异丙醇 混匀 ,室温放置 2 h 左右 ,12 000 r/ min 离心 10 min , 弃上清液 ,加入 600μL 70 %乙醇洗涤 1 次 ,12 000 r/ min 离心 5 min ,弃上清液 。DNA 溶于 10 μL 水中 , 合并 10 管 DNA 溶液 , - 20 ℃保存 ,备用 。
但目前对动物明胶的来源检测却缺乏相应的检 测手段 。国内对动物胶的检测 ,多集中在对鹿胶 、龟 胶和阿胶的真伪鉴别上 。韩继武等[1 ] 采用理化显色 反应 ,利用不同浓度凝胶的凝胶温度检测鉴别真伪鹿 角胶 ;山东阿胶集团和海洋大学[2 ]利用分子标记技术 检测阿胶原料 ———驴皮的真伪 ,以此确定阿胶的真 伪 ;最近有关于用 SDS 不连续电泳检测鹿胶 、龟胶和 阿胶的报道[3 ] ,通过电泳谱带来区分 3 种不同的胶 , 但该方法对样品处理的要求较高 ,否则难以得到较准 确的结果 。
皮 、牛皮和牛骨的明胶 DNA ,并利用分光光度计对提 取的 DNA 进行 DNA 浓度和纯度测定 。
检测结果表明 :方法 2 对 4 种样品所提取 DNA 的 OD260/ OD280 比值分别为 116801 , 118033 , 116033 和 113089 , 除 1 种 猪 皮 明 胶 外 , 其 余 3 种 样 品 的 OD260/ OD280的比值均低于 118 ,说明所提取的 DNA 纯度不够 , 存在蛋白质污染 ; 方法 2 所提取的样品 DNA 的 OD260/ OD280 比 值 分 别 为 513254 , 413117 , 219319 和 518956 ,远远在双链 DNA 有效纯度 118 的 范围之外 ; 而方法 3 所提取的所有 样 品 DNA 的 OD260/ OD280比值分别为 118366 , 117514 , 210388 和 117728 ,均在 118 ～210 左右 (表 1) ,因此方法 3 的 DNA 提取效果较其它 2 种更好 ,更适合于作为明胶 中的 DNA 提取方法 。
42 2006 V ol . 32 N o . 4 (To t a l 220)
生 工 公 司 ; 核 酸 裂 解 液 ( 10 mmol/ L Tris2HCl ,
400mmol/ L NaCl , 2mmoL Na2 ED TA , 2 % SDS , p H812) ,蛋白沉淀液 (312 mol/ L NaAc ,p H 418) 均为 实验室配制 。 11113 主要仪器设备
称取 1 g 琼脂糖 ,于 50 mL 电泳缓冲液中加热 , 充分溶化 ,加入溴化乙锭至终浓度为 1μg/ mL ,制胶 。 将 5～8μL PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混 合 ,点样 。90 V/ cm 恒压 ,电泳 10～20 min ,凝胶成像 仪观察结果 。
2 实验结果
211 明胶中 D NA 提取质量和效率的比较 用 3 种不同的 DNA 提取方法分别提取来自猪
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
动物明胶中 3 种 D NA 提取方法的比较研究 3
陈 颖 王 晶 吴亚君 钱增敏 徐宝梁
(中国检验检疫科学研究院 ,北京 ,100025)
摘 要 基于 DNA 水平的分子生物学检测方法 ,因其高特异性 、高灵敏度且简便快速等优点 ,成为明胶动物来 源鉴别检测的有效方法 。但明胶的特殊加工工艺给 DNA 的提取带来了一定的困难 。研究中选取了牛皮明胶 、 牛骨明胶和猪皮明胶等不同动物品种和不同动物组织来源的明胶产品 ,采用了试剂盒法 、蛋白沉淀法和裂解抽 提法等 3 种 DNA 提取方法 ,从 DNA 提取质量 、提取效率及明胶动物种类来源 PCR 扩增等方面对 3 种方法进行 了比较 。研究结果表明 ,裂解抽提法所提取的明胶中的 DNA 质量优于前 2 种方法 ,且适合于进一步的 PCR 扩 增检测 ,是适合于明胶 DNA 提取的有效方法 。 关键词 动物明胶 , DNA 提取 , 生物学检测
skin , Gelatin f rom porcine skin , 100 % Type A pork skin Gelatin 及 100 % Type Lime bone Gelatin 四种样 品各 400 mg (每种样品做 3 个重复) ,分 10 管提取 , 每管 40 mg ,加入到 115 mL 离心管中 ,再加入 600μL 核酸裂解液 ,以下步骤按试剂盒说明书进行 。DNA 溶于 10μL 水中 ,合并 10 管 DNA 溶液 , - 20 ℃保存 , 备用 。
扩增反应在 25 μL 的反应体系中进行 。反应成 分为 : 10 ×PCR 缓冲液 215μL , 215 mmol/ L dN TPs 015μL , 10 μmol/ L 上 下 游 引 物 各 015 μL ; Taq 酶 1U ,DNA 模板 5μL ,补足水至 25μL 。
牛源性成分 PCR 扩增反应条件为 :94 ℃预变性 2 min ,94 ℃变性 1 min ,58 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 30 s ,30 个循环 ,72 ℃延伸 5 min ;猪源性成分 PCR 扩增 反应条件为 : 94 ℃预变性 5 min ,94 ℃变性 30s ,59 ℃ 退火 30s ,72 ℃延伸 30s ,30 个循环 ,72 ℃延伸 5 min 。 11213 扩增结果的检测
牛皮明胶 ( Gelatin f rom bovine skin) 和猪皮明胶 ( Gelatin f rom porcine skin) ,购自美国 Sigma 公司 ;猪 皮明胶 (100 % Type A pork skin Gelatin) 和牛骨明胶 (100 %Type Lime bone Gelatin) ,购自罗赛洛 (广东) 明胶有限公司 。 11112 主要试剂
核酸蛋白分析仪 (Beckman DU640) ,恒温箱 ,低 温冷冻高速离心机 ( Eppendorf 5804R) ,微量移液器 , PCR 仪 ( Gene AM P PCR System 9700) ,电泳仪 ,凝胶 成像仪 。 112 实验方法 11211 DNA 提取方法
方法 1 ( 试 剂 盒 法) : 称 取 Gelatin f rom bovine
生产与科研经验
为确定 3 种 DNA 提取方法的优劣 ,对所提取的 明胶样品分别进行牛和猪源性成分的检测 ,扩增所采 用的引物分别来自文献报道 ,其中牛源性成分的扩增 的 上 下 游 引 物 分 别 为 5 ’2CACAA TCCA GAACT2 GACAC23’和 5 ’2GA T GGCT T GGGAA TA GTAC GA2 3’,扩增片段长度为 147bp [4 ] ; 猪源性成分的扩增的 上 下 游 引 物 分 别 为 5 ’2GCCTAAA TCTCCC2 CTCAA T GCTA23 和 5 ’2A T GAAA GA GGCAAA2 TA GA T T T TC G23’,扩增片段长度为 212 bp [5 ] 。
引物由上海博亚生物技术公司合成 ; Wizard Ge2 nomic DNA purification 试剂盒购自美国 Promega 公 司 ; Taq 酶 、dN TPs、PCR 缓冲液 、溴化乙锭 、分子量 Marker (100～600bp) 均购自大连宝生物公司 ;琼脂糖 (电泳纯) ,酚/ 三氯甲烷/ 异戊醇 (25∶24∶1) 购自上海
(猪皮明胶) 100 %Type Lime bone
Gelatin (牛骨明胶)
重复
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
表 1 不同方法提取的 D NA 浓度和纯度
Байду номын сангаас
方法 1
2006 年第 32 卷第 4 期 (总第 220 期) 43
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
样品
Gelatin from bovine skin (牛皮明胶)
Gelatin from porcine skin (猪皮明胶)
100 %Type A pork skin Gelatin
方法 3 (裂解抽提法) :称取的样品种类和数量同 方法 1 ,并加入到 115 mL 离心管中 ,在管中加入 600 μL 自 配 的 核 酸 裂 解 液 , 置 65 ℃恒 温 箱 中 温 育 20 min ,在 65 ℃条件下加入等体积的酚/ 三氯甲烷/ 异 戊醇 (体积比 25∶24∶1) ,室温下 12 000 r/ min 离心 10 min ,小心转移上清液至一新的 115 mL 离心管中 ,加 入等体积的三氯甲烷/ 异戊醇 (体积比 24∶1) ,剧烈振 荡 ,室温下 12 000 r/ min 离心 10 min ,小心转移上清 液至一新的 115 mL 离心管中 ,加入 018 倍体积的异 丙醇混匀 ,室温放置 2h 左右 ,12 000 r/ min 离心 10 min ,弃 上 清 液 , 加 入 600μL 70 % 乙 醇 洗 涤 一 次 , 12000 r/ min 离心 5 min ,弃上清液 。DNA 溶于 10μL 水中 ,合并 10 管 DNA 溶液 , - 20 ℃保存 ,备用 。 11212 PCR 扩增
因此 ,为快速 、高效地鉴定动物明胶的真伪 ,基于
第一作者 :博士 ,副研究员 。 3 国家质检总局资助项目 收稿日期 :2005 - 11 - 21
DNA 水平的分子生物学检测方法 ,便因其高特异性 、 高灵敏度且简便快速等优点而成为首选 。但由于明 胶的加工工艺特殊 ,包括酸 、碱浸泡 ,长时间高温处理 及一系列后续的高强度加工过程 ,再加之特有的物理 性质 ,如高黏度 ,常温水溶剂中不溶性和溶胀性等 ,导 致明胶中的 DNA 难以提取 。德国一家公司自称拥 有从明胶中提取 DNA 专利 ,但未见任何相关报道 。 除此之外 ,也未见其它国家对该类研究的报道 。因此 提取出一定数量和质量的 DNA 是进行明胶分子生 物学检测的前提条件 。
明胶是从动物表皮 、结缔组织和骨组织中的胶原 部分水解得到的不溶性蛋白质 ,由于其特殊的物理特 性 、营养价值和药用功能 ,被作为辅料或药物广泛应 用于食品 、医药和其他工业领域 。
用于明胶生产的动物材料多为屠宰场提供的牛 、 猪 、羊等的皮毛 、骨头 ,其中欧洲明胶工业的主要原料 为牛骨 、牛皮等 。1990 年代 ,英国疯牛病事件在给全 球的肉制品行业带来严重冲击的同时也波及明胶市 场 。由于公众对疯牛病的普遍恐惧和担忧 ,欧洲一些 环保组织已经开始抵制来自牛副产品的明胶 ,各国对 明胶类产品的流通与管理也出台了相应的法规 。伊 斯兰国家出于宗教原因 ,严格禁止猪来源明胶 。我国 每年从国外进口大量明胶以满足生产的需要 ,但明文 禁止从欧盟 、加拿大 、美国 、日本等 20 多个疯牛病疫 区进口牛来源明胶产品 。然而很多进口商提出进口 除牛羊明胶以外的明胶品种 ,如猪明胶 。