13-2多肽与蛋白质类药物

下丘脑激素
甲状腺激素 胰岛激素 胃肠道激素
胸腺激素
表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， ），转移因子 （2）多肽类细胞生 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， 心钠素（ANP）等。 长调节因子 心钠素（ANP） 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 （3）含有多肽成分 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 的其它生化药物 脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素 胚胎素、 助应素、 脑氨肽、蜂毒、蛇毒 胚胎素、 助应素、 神经营养素、胎盘提取物、 提取物、 神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。
二、多肽与蛋白质类药物的制造方法
蛋白质与多肽类药物的提取分离与纯化法 多肽与蛋白质的化学合成法 基因工程法
（ 一） 蛋白质药物
原料选择
发 酵 沉 淀
变性 复性
生物 组织 破碎 提取
上清液
蛋白质纯化 纯度 活性鉴定
合格 不合格
精品
1、原料选择
2、提取
3、分离纯化
纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。
1963年 固相合成（1963年R.B.Merrifield 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 1984年获诺贝尔化学奖
→将氨基酸的C-末端固定在不溶性树脂上，然后将此树脂 将氨基酸的C 末端固定在不溶性树脂上， 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。
例如：人胰岛素（Insulin） 例如：人胰岛素
B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰
猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins,lispro） 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效 ） 诺和诺德公司、速效Ins 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效 ,aspart） ） 安万特公司、 甘精胰岛素 (安万特公司、长效 安万特公司 长效Ins,glargine) 诺和诺德公司、 地特胰岛素 (诺和诺德公司、长效 ） 诺和诺德公司 长效Ins）
(2)各种分离纯化方法的使用程序 (2)各种分离纯化方法的使用程序
原则： 原则：相同性质的纯化方法一般不重 复使用。 复使用。纯化方法顺序先后的安排上 要考虑到有利于减少工序，提高效率。 要考虑到有利于减少工序，提高效率。
(3)分离纯化后期的保护性措施 (3)分离纯化后期的保护性措施 (4)对每一步骤方法的优势进行综合评价 (4)对每一步骤方法的优势进行综合评价
（二）蛋白质类药物 1、发展: 发展: 分类： 2、分类：
蛋白质激素、血浆蛋白质、 蛋白质激素、血浆蛋白质、蛋白质类细胞生长调节 因子、粘蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、 因子、粘蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、 凝集素
蛋白质激素 垂体蛋白质激素
促性腺激素
胰岛素及其他 蛋白质激素 血浆蛋白质
4、多肽合成的主要步骤
氨基的保护和羧基的活化 羧基的保护和氨基的活化 接肽和去保护基
5、基团保护： 基团保护： 保护基：接肽时起保护作用， 保护基：接肽时起保护作用，接肽后除去 氨基保护剂： 氨基保护剂： 苄氧羰基——强酸脱除 苄氧羰基 强酸脱除 叔丁氧羰基（BOC） 三氟乙酸（ 叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脱除 三氟乙酸 TFA） 芴甲氧羰基（Fmoc）——碱脱除 9-芴甲氧羰基（Fmoc）——碱脱除 羧基保护剂 无水乙醇或甲醇在盐酸存在下酯化，使羧基接上烷基——常 无水乙醇或甲醇在盐酸存在下酯化，使羧基接上烷基 常 温下氢氧化钠皂化法脱除 其他功能基团的保护剂
1953年 年
1963年 年 1965年 年
2、合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。 合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。 AA的过程
合成方法： 3、合成方法：
液相合成
→保护氨基、活化羧基的方法 保护氨基、
具体的方法：阶梯伸长法（小肽合成）、片段缩合法（ 具体的方法：阶梯伸长法（小肽合成）、片段缩合法（小肽缩 ）、片段缩合法 合成大肽） 合成大肽）
第二节
多肽与蛋白质类药物
一、概
（一）多肽类药物
1、 发 展
1950s 1960s
述
1970s
1990s
2、多肽类药物的分类 、
多肽激素 多肽类生长因子 含多肽成分的其他生化药物
（1）多肽激素 ）
垂体多肽激素 促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪 促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪 ）、促黑激素 ）、 水解激素（LPH）、催产素（OT）、 ）、催产素 ）、加压素 水解激素（LPH）、催产素（OT）、加压素 AVP） （AVP）等 促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制 促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制 ）、 激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH） ）、促性腺激素释放激素 激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH） 甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT） 甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT） ）、降钙素 胰高血糖素 胰解痉多肽 胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、 胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、 肠泌素、 活性肽（VIP）、 ）、抑胃素 肠泌素、肠血管 活性肽（VIP）、抑胃素 GIP）、缓激肽、 ）、缓激肽 （GIP）、缓激肽、P物质 胸腺素、胸腺肽、 胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子
多肽的固相合成(Fmoc保护法) (Fmoc保护法 6、多肽的固相合成(Fmoc保护法)
（1978年改进的方法，避免了强酸处理） 1978年改进的方法，避免了强酸处理） 年改进的方法
（三）基因工程法 主要程序： 主要程序：
获得目的基因 → 组建重组质粒 → 构建基因 工程（或细胞） 工程（或细胞）→ 培养工程菌 → 目的蛋白的分 离与纯化 → 除菌过滤 → 半成品检定 → 成品 检定 → 包装
蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化： （7）蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化： 逆流分流技术（萃取法） 逆流分流技术（萃取法） 蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化： （8）蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化： 吸附法 （9）蛋白质的其他特殊性质进行纯化 如温度、酸碱、金属离子、络合剂、 如温度、酸碱、金属离子、络合剂、蛋白质沉淀 剂、SOD酶、pH值 SOD酶 pH值
2、生产工艺
捣碎、提取 生理盐水 胸腺 绞碎→ 胸腺碎块 [ ] → 提取液（组分1 ） 加热去杂蛋白]， 15 − [ 80℃、 min → 上清液（组分 2） [ → 丙酮粉（组分3） 沉淀]丙酮，10℃ 分段盐析 ] p [ H 7.0 0→ 上清液（组分4） 磷酸盐缓冲液、硫酸铵、饱和度 .25 分段盐析 ]硫酸铵，饱和度 0. 超滤 ]10 mmol / LTris HCl缓冲溶液 [ 50 → 盐析物 [ − → 超滤液 脱盐、干燥 、S [ ]ephadexG− 25→ 胸腺素（组分5）
3D Structure of Insulin
胰岛素二聚体（ 胰岛素二聚体（dimer） ）
胰岛素六聚体（ 胰岛素六聚体（hexamer ）
三、重要的多肽与蛋白质类药物的制造
（一）多肽类药物 胸腺素（thymocin) 胸腺素
结构与性质 工艺过程 控制要点
1、结构与性质
胸腺素组分5是由80℃热稳定的40～50种多肽组成的混合物， 胸腺素组分5是由80℃热稳定的40～50种多肽组成的混合物，分子 80℃热稳定的40 种多肽组成的混合物 量在1000 15000之间 pI为3.5～9.5。 1000～ 之间， 量在1000～15000之间，pI为3.5～9.5。
等电点的变化：蛋白质结合了较多的正电荷，pI↑， 等电点的变化：蛋白质结合了较多的正电荷，pI↑， 蛋白质结合了较多的负电荷， 蛋白质结合了较多的负电荷，pI↓， pH值至pI的两侧除杂蛋白 值至pI 调pH值至pI的两侧除杂蛋白
(2)蛋白质分子形状和大小其 蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化 方法有 凝胶过滤法 超滤法 离心法 透析法 蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有： （3）蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有： 盐溶与盐析法 结晶法 低温有机溶剂沉淀法
生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状 生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状 ），催乳激素 ）， 腺素（TSH），促黄体生成激素（LH）， ），促黄体生成激素 ），促 腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促 卵泡激素（FSH）。 卵泡激素（FSH）。 人绒毛膜促性腺激素（HCG）， ），绝经尿促性 人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性 腺激素（HMG）， ），血清性促性腺激素 腺激素（HMG），血清性促性腺激素 SGH）。 （SGH）。 胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。 胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。 白蛋白，纤维蛋白溶酶原， 白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合 蛋白（FN） 免疫丙种球蛋白， 蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞 免疫球蛋白，Veil’ 病免疫球蛋白， 免疫球蛋白，Veil’s病免疫球蛋白，抗－ 免疫球蛋白， HBs免疫球蛋白 免疫球蛋白， D免疫球蛋白，抗－HBs免疫球蛋白，抗血 友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ 友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ， 凝血因子Ⅷ 凝血因子Ⅸ 凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。
每一个分离纯化步骤方法的好坏， 每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分 辨本领和重现性二方面考虑外， 辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身 的回收率的高低。 的回收率的高低。
5、纯化方法选择指南
（二）多肽与蛋白质的化学合成
1、发展
• Du.Vigneaud等合成催产素 等合成催产素 等合成 • （oxytocin,OXT ，9AA单链肽） 单链肽） 单链肽 • 合成促肾上腺皮质激素 • （ACTH，39AA单链肽） ， 单链肽） 单链肽 • 中国科学家合成了胰岛素 • （Insulin，51AA双链肽） ， 双链肽） 双链肽