荧光漂白恢复_荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI

于 淼① 高 建①

[文章编号] 1672-8270(2009)06-0008-02 [中图分类号] R 197 [文献标识码] B

Characteristics of application and technology on FRAP , FRET and FCS/Yu Miao , Gao Jian//China Medical Equipment,2009,6(6):8-9.

[Abstract] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) are three experimental techniques based on the fluorescence analysis that are commonly used to study molecular interaction. In this article, we will discuss and compare the application and technical specifications for FRAP , FRET and FCS.[Key words] FRAP; FRET; FCS; Fluorescence Analysis

[First-author's address] Laboratory Center, China Medical University, Shenyang 110001, China.

荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

[摘要] 荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术，常用来研究分子间相互作用。对三种技术的特点做以比较和讨论。

[关键词] 荧光漂白恢复；荧光共振能量转移；荧光相关光谱；荧光检测

作者简介

于淼,女,(1980- )，硕士，助教。现就职于中国医科大学实验技术中心，主要从事激光扫描共聚焦显微镜工作。

FRAP：经荧光素标记的某一区域被光照射后，荧光物质的光化学结构被破坏，荧光强度下降，但随之此处荧光强度会逐渐恢复，荧光强度与恢复强弱及快慢代表周围分子扩散的速率或分子运动速度[1]。

FRET：受激态荧光素（供体）将其能量向另一个荧光素（受体）传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。测定FRET程度的参数，包括供体淬灭、受体发射、供体荧光寿命、供体荧光去极化等[2]。

FCS：是一种通过检测微区内（共焦体积）分子

的荧光信息（强度、波动、波长等）来分析样品特性的检测

技术，类似于传统的荧光分光光度计，主要用于液态样品的成份分析[3]。

以上三种技术的主要参数有：

扩散率：测量扩散的速率，通常表现在分子和分子络合物的扩散系数。

多组分扩散：用来检测和区别单个和多组分之间扩散的能力。

运动分量：检测能够自由扩散的组分。

①中国医科大学实验技术中心 辽宁 沈阳 110001

ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI

学术论著

浓度：提供一个不需独立校准测量分子浓度的能力。

络合：检测分子络合。

络合化学计量学：检测分子络合的化学计量学，如分子结合时的基本率等。

结合动力学：测量形成络合物的动力学。比较三种技术的检测参数，见表1。

物形成的动力学。FRET又称为福斯特共振能量转移，即在两个单独的荧光团之间的偶极诱导偶极的作用。这种现象要求在独立的受体供体荧光对之间的转换在相对分子距离小于10 nm时才能发生，而且供体的发射光谱与受体的吸收光谱要有实质性的重叠。如果没有这种保证我们可能会被诱导，或者至少不是纯粹定性。

FCS是一种在很小容量内测定荧光强度相关变动的单分子检测技术，可以用来测量单一组分和多种组分的扩散。如同FRAP，测定扩散系数需要了解光束的半径。FCS不能测量运动分量，未经校准时不能提供一个直接和独立的浓度测量。由于这种浓度测量方法能用来区分扩散系数，故FCS能提供络合物化学计量学和结合等温线的测量数据。FCS也可以用来测量络合物的形成率。FCS的测量依赖于有一个大的浓度波动，这限制了其所能测量的浓度范围只能在FCS能够测量的范围内。

综上所述，这三种新兴的实验手段为生命科学相关研究开辟了新的研究途径和研究领域，需要根据这

三种荧光检测技术的不同，选择适合的实验方法，配置适宜的软硬件功能[4]，完成相应的科学实验。

参考文献

张志毅,周涛,巩伟丽.荧光漂白后恢复技术及其

在活细胞分子机制研究中的应用[J].生物技术通讯,2008(4):46-48.

张益珍,幸浩洋,李宜贵，等.荧光共振能量转移

技术及其在医药学中的应用[J].华西药学杂志, 2004,19(6):491-492.

袁兰.激光扫描共聚焦显微镜技术教程[M].北

京:北京大学医学出版社.2004:107-109.崔泽实.荧光显微镜的功能配置及应用要点[J].

医疗装备,2004,17(9):4-6.

[1] [2][3] [4] 收稿日期：2009-04-21

检测参数FRAP FRET

FCS 扩散率○

○多组分扩散○

运动分量○

浓度○络合○

○络合化学计量学○络合动力学

○

○○

表1 FRAP、FRET及FCS检测参数

FRAP是一种相对来说比较容易完成的技术。通过扩散时间测量扩散系数，因而需要精心测量沿着z 轴在xy平面上光束的半径。从FRAP中获得多个扩散系数是非常难的。FRAP在三种技术中是唯一能够检测运动分量的技术，但它不能独立作浓度检测。由于其只能区分扩散系数,因此检测分子络合和测量这些络合物的化学计量学的能力受限。FRAP在二维扩散测定方面存在较特殊问题，如膜扩散，扩散系数依赖于分子大小，而且成对数关系。FRAP能够用来测量分子动力学。但FRAP技术也有它的不足之处，第一，它只能检测膜蛋白的群体移动，而不能观察单个蛋白的移动，其次，它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部条件的限制。

FRET一般不用作测量分子扩散，不能独立的测量供体浓度, 如果精确校准，可用来测量受体浓度。FRET很难获得化学计量学的信息，经过精心校准仅可获得有限的信息。FRET在测量络合程度变化上体现出强大的技术能力，因此可用来测量络合

中国医学装备2009年6月第6卷第6期 荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点-于 淼等