微生物细胞计数及染色操作
微生物细胞的简单染色法及镜检技术
实验方法
油镜下观察到的简单染色后细菌形态
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实验方法
8.实验结束后处理：
用擦镜纸擦去镜头上的香柏油。然后用擦镜纸蘸少许 二甲笨擦去镜头上残留的油迹。将物镜镜头转至安全 位置，复位聚光镜，降下载物台，关闭电源，盖好镜 套方可离开。
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微生物及应用技术
微生物细胞的简单染色法及镜检技术
实验目的
1.学习微生物制片和染色的基本技术； 2.掌握细菌简单染色的原理和方法，初步认识细菌的形态特征； 3.掌握细菌简单涂片方法； 4.掌握无菌操，常不易识别，而经着色后与背 景形成鲜明的对比。是易于在显微镜下进行观察。在中性碱性或弱酸 性的溶液中，微生物细胞会呈现不同的颜色。
2.干燥：将涂片置火焰上较高处微热，烘干或自然干燥，也可 用电吹风低温吹干。
实验方法
3.热固定：手持已干燥的涂有菌膜的载玻片涂面朝上，快速通 过酒精灯，火焰两至三次，务使涂片烫手。 4.染色：将热固定的细菌涂片平放在实验台上，待拨片冷却后 滴加染料一至二滴于涂片上。覆盖涂面染色一至二分钟。
实验方法
实验材料及设备
1.菌种：培养好的细菌； 2.试剂：美兰染色剂、蒸馏水； 3.仪器及其他：显微镜、擦镜纸、载玻片、酒精灯
实验方法
1.涂片：取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水或无菌水用接 种环以无菌操作挑取观察菌体，并和水充分混合涂成直径约为 一厘米极薄的菌膜。如果采用的是液体培养物或固体培养物中 洗下的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。
5.水洗：将涂片用蒸馏水冲洗至无蓝色液体流出(0052)，用吸水 纸吸去多余的水份。 6.干燥：自然干燥或吸水纸吸干或用电吹风吹干。
实验方法
7.镜检：先用低倍镜找到样品区域，将载物台下降。在待观察 的样品区域，加滴香柏油。将油镜转到工作位置，从侧面注视， 将载物台小心的上升使油镜浸在油中，然后用细节器调节，在 油镜下观察菌体形态染色结果并绘图
微生物计数方法
微生物计数方法微生物计数是许多领域中重要的分析方法，包括环境科学、食品科学、医学和生物技术。
正确的计数方法能够准确地估计样品中微生物的数量，对于研究和工业应用都是至关重要的。
下面将介绍几种常用的微生物计数方法。
血细胞计数器法是一种使用显微镜进行微生物计数的经典方法。
该方法使用血细胞计数器对微生物样品进行计数，每个格子中的微生物数量被计算出来，然后进行统计分析。
此方法的优点是准确性高，但是耗时长，操作繁琐，需要熟练的操作人员。
流式细胞术是一种使用流式细胞仪进行微生物计数的现代方法。
该方法将微生物样品通过流式细胞仪进行计数和分析，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，但是设备成本高，维护成本也较高。
自动细胞计数器法是一种使用自动细胞计数仪进行微生物计数的现代方法。
该方法使用自动细胞计数仪对微生物样品进行计数，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，而且设备相对较为经济实惠，易于推广应用。
平板计数法是一种常用的细菌计数方法。
该方法将微生物样品涂布在平板上，培养后计算菌落数量，从而得出样品中的细菌数量。
此方法的优点是简单易行、成本低，但是结果受培养条件和操作者技能水平的影响，准确性相对较低。
不同的微生物计数方法具有不同的优缺点，应根据具体的研究目标和实际情况选择合适的方法。
为了提高计数的准确性，需要注意样品的采集、保存、制备和处理等方面的问题，确保样品的质量和代表性。
微生物的分离与计数是微生物学中重要的实验技术之一。
通过分离和计数，我们可以获得微生物群体的相关信息，如种类、数量、生长状况等，对于微生物学研究、应用以及工业生产等领域都具有重要的意义。
选择合适的培养基：根据目标微生物的种类和生长需求，选择适合的培养基。
培养基应具有营养丰富、透明度高、易于观察等特点。
制备样品：从目标环境中采集样品，如土壤、水、食品等，并进行预处理，以去除不需要的杂质和大型生物。
显微镜直接计数和平板菌落计数
测定结果误差较大、操作比较烦琐、需要的时间较长。
三、主要器材
1. 活材料：啤酒酵母（S6） 、 解脂假丝酵 母（S5）
2. 染色液：复红染色液（或结晶紫，美兰） 3. 器材：显微镜、血球计数板、载玻片、 盖玻片 、擦镜纸、吸水纸、计数器、滴管、 无菌吸管、无菌培养皿、马铃薯葡萄糖培养 基。
实验八 微生物显微镜直接计数
和平板菌落计数
一. 实验目的
1. 学习、掌握显微镜直接计数法和平板菌 落计数法； 2. 了解血球计数板的构造、计数原理和计 数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通 常采用的有显微镜直接计数法和平板菌落 计数法。
（一）显微镜直接计数法
后要尽快倒入冷至45℃左右的培养基15 ml ，并迅速旋转混匀。否则，菌体会 吸附在皿底，不易分散形成单菌落。
（二）平板菌落计数法 1. 编号 将平皿和试管分别标记浓度。 2. 稀释样品 将酵母菌样品进行适当稀释。 3. 取样 用无菌吸管准确吸取10-4、 10-5、 10-6稀释菌液各1 ml，放0.2 ml 于无菌平皿。 4. 倒平板 于上述平皿中尽快倒入融化并 冷却到45℃左右的培养基15 ml ，旋转混匀。 5. 计数 培养48 h后取出培养皿，算出同一 稀释度的三个平皿中平均菌落数，再按公 式计算每毫升样品中活菌数。
平板菌落计数法示意图
五、实验报告
（一）实验结果 1. 将直接计数结果记录于表中。 2. 将平板菌落计数结果记录于表中。
（二）思考题 某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌
存活率，请设计1-2种可行的检测方法。
六．注意事项
1．计数器必须洗干净，勿刷 ； 2. 千万注意勿损坏计数器 。 3. 平板菌落计数时，测定样品移入培养皿
测定微生物总数的方法
测定微生物总数的方法测定微生物总数是微生物学研究中的一项重要任务，它可以帮助我们了解微生物在环境中的分布和数量。
本文将介绍几种常用的测定微生物总数的方法。
一、直接计数法直接计数法是最直接、最常用的测定微生物总数的方法之一。
它通过使用显微镜观察样品中的微生物细胞数目来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、土壤样等，制备适当的稀释液。
2. 取适量的稀释液滴于玻璃片上，用显微镜观察。
3. 在显微镜下，使用目镜和物镜进行放大观察，并使用计数室或计数网格进行计数。
4. 统计不同视野中的微生物数量，并计算平均值，从而得到微生物总数。
二、培养法培养法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品在培养基上培养并生长，然后观察和计数生长的菌落数来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取适量的样品，如空气、食品、药品等，制备适当的稀释液。
2. 取一定量的稀释液接种于含有富营养物的培养基上。
3. 将培养基培养在适当的温度和湿度条件下，使微生物生长繁殖。
4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。
5. 根据计数结果，计算微生物总数。
三、膜过滤法膜过滤法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品过滤到膜上，然后将膜放置在培养基上进行培养和生长，最后观察和计数生长的菌落数来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。
2. 将稀释液通过膜过滤装置过滤到膜上。
3. 将膜放置在含有富营养物的培养基上进行培养和生长。
4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。
5. 根据计数结果，计算微生物总数。
四、荧光显微镜法荧光显微镜法是一种高级的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品染色，并利用荧光显微镜观察和计数荧光染色的微生物细胞来进行测定。
具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。
2. 取适量的稀释液滴于载玻片上，进行定性或定量染色。
微生物的制片染色技术
微生物的制片染色技术微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。
至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均需经特殊方法染色后，才能进行观察。
细菌的制片染色细菌涂片的制作与简单染色涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。
注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。
简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。
此方法用于观察细菌外形及大小。
革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。
用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。
染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。
镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。
革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。
因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。
此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。
特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。
芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。
芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。
微生物计数方法有哪些
微生物计数方法有哪些微生物计数方法是用来确定样品中微生物数量的技术方法。
根据微生物所在的环境、特征和研究目的的不同，可以选择不同的计数方法。
常用的微生物计数方法包括直接计数法、培养计数法、膜滤法、荧光染色法等。
本文将详细介绍这些常用的微生物计数方法。
一、直接计数法直接计数法是指直接通过显微镜观察计数来确定微生物数量的方法。
常用的直接计数法有：1. 显微镜计数法：通过显微镜观察样品中微生物的数量，通常使用显微镜配合计数室或计数盘进行计数。
2. 相位差显微镜计数法：与常规显微镜计数法类似，但使用相位差显微镜可以获得更清晰的图像，更准确地计数微生物的数量。
3. 流式细胞仪计数法：使用流式细胞仪对微生物进行计数和粒子分析，可以同时获得微生物的数量和其他特征信息，如大小、形状等。
二、培养计数法培养计数法是通过将微生物样品培养在含有适宜营养物质的培养基上，利用微生物的生长繁殖特性来确定微生物数量的方法。
1. 可视化计数法：将培养基和微生物混合后在琼脂培养基上进行平皿计数或浸液计数，通过观察菌落形成单位来计数微生物数量。
2. 过滤膜计数法：将微生物样品过滤到具有适当孔径的膜滤器上，然后将膜滤器移植到含有适宜培养基的琼脂平皿上，通过菌落形成单位进行计数。
3. 表面播菌计数法：将微生物样品均匀涂布在琼脂平板的表面，通过菌落形成单位计数微生物的数量。
三、膜滤法膜滤法是利用膜滤器对微生物样品进行筛选和集落计数的方法。
膜滤法通常用于分析水、空气和食品等中微生物的数量。
1. 电子显微镜计数法：将微生物样品过滤到具有适当孔径的膜滤器上，并使用电子显微镜观察并计数微生物的数量。
2. DNA混合体计数法：将微生物样品过滤到DNA束水中，通过对DNA束的计数来确定微生物数量。
3. 梅勒算法：将微生物的集落过滤到膜滤器上，使用特定的染色剂、显微镜和图像分析软件进行计数。
四、荧光染色法荧光染色法是通过使用特定的荧光染料和荧光显微镜或流式细胞仪来计数微生物数量的方法。
常用的微生物染色方法
常用的微生物染色方法微生物染色是微生物学研究中非常重要的方法，通过染色可以使微生物的形态和结构更加清晰，便于观察和研究。
下面将介绍几种常用的微生物染色方法。
1. 革兰氏染色法（Gram染色）：革兰氏染色法是最常用的微生物染色方法之一、该方法可以根据细胞壁结构的差异将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，可以保留紫色的革兰氏染料-碘-酒精复合物，呈紫色；而革兰氏阴性菌由于细胞壁较薄，无法保留染料-碘-酒精复合物，经酒精洗涤后以褪色方式显现嫩蓝色。
2. 去瓶球菌染色法（Ziehl-Neelsen染色）：该染色方法主要用于诊断结核菌感染。
结核菌具有酸酒杆菌的特征，该染色方法通过热定性进行，即将杆菌加热固定在玻璃片上。
染色液为仲子红与甲苯红的酒精醚溶液，结核菌上的脂质物质可以吸附染色液，呈现红色。
3.金黄色葡萄球菌染色法：金黄色葡萄球菌染色采用的是接种在含有豆粉和盐的琼脂糖平板上的细菌进行。
染色液为碘酸钾和碘甘液的混合物，在细菌细胞内部染出棕色团块。
4. 吉姆萨染色法（Giemsa染色）：吉姆萨染色法主要用于染色血液细胞、细菌和寄生虫等。
染色液为吉姆萨染料溶液，通过染色液和蒸馏水的混合来染色。
吉姆萨染色方法对捕获染色成分极为敏感，将蓝色碱性染料用于碱性碳水化合物和核酸材料，将红色和紫红色酸性染料用于酸性成分，如蛋白质和细胞质组分。
5. 格拉姆-韦瑞染色法（Gram-Weigert染色）：该染色法用于菌体内基质和胞外多糖的特异染色。
六元蔗糖银试剂与格拉姆染色特殊染料结合，生成黑色的沉淀物，用以观察菌体内多糖地点和部位。
6.碘染色法：碘染色用于染色藻类和真菌。
该染色法主要原理是将菌丝或细胞的内部特异性细胞器染为紫黑色，以便更容易观察和研究。
7.寇歇染色法：寇歇染色法主要应用于真菌的染色，染色方法与碘染色类似，可以观察到真菌菌丝和孢子的形态和结构。
总结起来，微生物染色方法有很多种，每种方法适用于特定的微生物和研究目的。
临床检验——微生物 常见染色操作
临床检验微生物—常见染色操作
一、涂片制备
1、涂片
用接种环或接种针从肉汤增菌液、半固体斜面或平板上挑取适量菌液或菌落于洁净破片上（固体菌种先加1小滴或1环生理盐水于玻片上），将挑取的增菌液直接涂布于玻片上（菌落均匀涂片于盐水中），涂片要薄而均匀，临床标本如脓、痰、分泌物等可直接涂片。
2、干燥
涂片最好在室温下自然干燥，或将玻片涂菌面朝上，置于酒精灯火焰上方适当位置慢慢烘干，切不可放在火焰上直接烤干。
3、固定
涂片干燥后，在酒精灯火焰上迅速通过3次（涂菌面朝上），加热固定。
固定的目的一是杀死细菌，二是使细菌附着于玻片上，不易被水冲掉。
1、初染：初染剂结晶紫，染色10秒钟，适量流水洗掉。
2、媒染：媒染剂碘液，染色10秒钟，适量流水洗掉。
3、脱色：脱色剂丙酮—酒精，脱色约10—20秒钟，至无紫色脱出为止，适量流水洗掉。
4、复染：复染剂复红，染色10秒钟，适量流水洗掉，自然干燥后镜检。
结果判断：革兰阳性呈蓝紫色，革兰阴性呈红色。
1、初染：加石碳酸复红染液，室温染色10分钟或更久，细流水冲洗，甩干。
2、脱色：酸性酒精脱色至无红色为止，细流水冲洗。
3、复染：亚甲基蓝复染30秒钟，细流水冲洗，待干镜检。
结果判读：抗酸染色阳性呈红色，抗酸染色阴性呈蓝色。
1、标本处理：取脑脊液2ml经3000r/min离心10min。
2、涂片：取沉淀物1环涂布于洁净玻片上，然后加适量墨汁，加盖玻片后用暗视野镜检观察。
3、结果判读：镜下背景呈黑褐色，菌体为无色。
微生物细胞大小测定及显微镜直接计数
微生物细胞大小测定及显微镜直接计数一、实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。
用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图示）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上，此处正好与物镜放大的中间物像重迭，用于测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺（图示）是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10µm即0.01mm，是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和稀释平板计数法。
直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼德罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载坡片上有4条槽所构成的3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图示），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，大方格用三线隔开，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，大方格之间用双线分开，而每个大方格又分成16个小方格。
微生物显微操作技术及染色技术—微生物的染色技术
思考讨论与任务
思考与讨论：我学到什么？
1、微生物染色的原理 2、微生物染色剂的种类 3、微生物染色的方法
任务： 1、简述染色的方法有哪些？并 各举一例？
菌
芽孢染色
染
负染色:荚膜染色法
色
法 活菌： 用美蓝或TTC（氯化三苯四氮唑）等做活体染色
三、微生物的染色方法
1、简单染色 是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
金黄色葡萄球菌简单染色图片
Байду номын сангаас
三、微生物的染色方法
2、革兰氏染色法(Gram stdn) 是丹麦医生Gram于1884年创立的。通过这一染色，可把几乎所有细菌分成革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌(简写为G+、G-)两大类。
三、微生物的染色方法
正染色：利用染料与细胞组分结合而进行的染色包括 简单染色：只用一种染色剂 复染色：使用两种或两种以上染色剂，经过初染、脱色、复染后，由于细菌的 结构不同而染成不同的颜色。 负染色：细胞不染色而使背景染色的方法。
三、微生物的染色方法
简单染色
正染色
革兰氏染色
细
死菌
复合染色法
抗酸性染色
模块四 微生物显微形态观察及染色技术
Microscopic morphology observation and staining techniques
任务二 微生物染色技术
知识目标：
掌握微生物染色的方法 熟悉微生物染色剂的种类
掌握微生物染色技术的原理
任务二 微生物染色技术
能力目标：
食品微生物检测(计数法)
大肠菌群操作步骤1
25g(mL) 样品
吸取1mL 225mL0.85% 灭菌生理盐水 9mL0.85% 灭菌生理盐 水
1:10
1:100
10mL 10mL 10mL 双料 双料 双料
5mL 单料
5mL 5mL 单料 单料
5mL 单料
5mБайду номын сангаас 单料
5mL 单料
36℃±1 ℃,培养24h ±2h
4.
2.
称样品
2.1手部的消毒 2.2镊子、剪刀、勺子的消毒。 2.3样品包装口的消毒（一个样品换一把镊子、剪刀或勺 子）。
3.
实验结束后的消毒
3.1用过的实验器材经高温消毒后再清洗。 3.2实验台面用消毒水擦洗干净。 3.3清洗双手：先用肥皂清洗双手，在消 毒水中浸泡双手3min后用水冲洗，再 用肥皂清洗双手。 3.4打开紫外灯消毒30－60min。
6.
7. 8. 9. 10. 11.
三．
培养基和试剂
营养琼脂 0.85％灭菌生理盐水 75％酒精棉球
1. 2. 3.
四．
检验程序
检样稀释及培养
1.
1.1以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于含有225mL灭菌 生理盐水的塑料瓶内，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中处理。 1.2用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注 入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及 管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。 1.3另取1mL灭菌吸管，按1.2操作方法，做10倍递增稀释， 如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
霉菌和酵母菌计数操作步骤
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。
所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。
微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。
不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。
常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。
通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
微生物的计数方法
1.血细胞计数法将稀释的菌液样品滴在血细胞计数板上，在显微镜下计算4~5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再以此为依据，估算总菌数。
①此法的缺点是不能区分死菌和活菌。
②对压在小方格界线上的细菌，应当取平均值计数。
③此法可用于测定培养液中酵母菌种群数量的变化2.稀释涂布平板法原理：每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
①这一方法常用来统计样品中活菌的数目②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个活多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定。
但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。
④此法若不培养成菌落，可通过将一定量的菌液均匀地涂布在玻片上的一定面积上，经固定染色后在显微镜下计数，这样又称涂片计数法。
染色可用台盼蓝，台盼蓝能使死细胞染成蓝色，可分别计数死细胞和活细胞。
3.滤膜法滤膜法是当样品中菌数很低时，可将一定体积的湖水、海水或饮用水灯样品通过膜过滤器。
然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积上）的细菌数。
此法也可以通过培养观察形成的菌落数来推算样品中的菌数。
例如测定饮用水中大肠杆菌的数目：将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。
在该培养基上大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数目。
此法也是统计样品中活菌的数目。
4.比浊法原理是在一定范围内，菌是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。
因此可借助与分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。
实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。
微生物直接计数和大小测定
微生物直接计数和大小测定
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2、显微镜测微技术：
微生物大小通常见测微计来测量，测微计分别有接 目镜测微尺和镜台测微尺两个别。
• 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在中央有一带刻 度尺，等份成50或100小格，每一格大小是相正确， 在同一接目镜下，随不一样放大率物镜而改变其大 小。
微生物直接计数和大小测定
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四、方法及步骤
1、血球计数： ⑴灭活：取菌悬液一管（10ml）摇匀，加入1%甲醛， 将酵母菌灭活，充分振荡，使菌体分散成单体。 ⑵稀释：将菌液适当稀释（菌液如不浓可无须稀 释），要求每小格内约3—5个菌体为宜。 ⑶染色：加0.1%吕氏美蓝酒精溶液0.5ml，摇匀， 使菌体着色。 ⑷取清洁干燥血球计数器，在计数室上加盖盖玻片。
微生物直接计数和大小测定
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微生物直接计数和大小测定
目尺刻线(27格) 台尺刻线(4格) 第11页
按照以下公式即可求出在低倍镜下目镜测微尺每格长 度：
目镜测微尺每格长度（微米）=两条两重条合重线合间线间镜目台镜测测微微尺尺格格数数×10
如：目测为30小格等于台测为20小格，已知台测每格
为10微米，那么对应在目镜测微尺上每格长度为（20×10
B
二室 菌数/ml
平均值
⑺计数完成后，将计数器在水龙头下冲洗（勿用硬物洗刷， 如试管刷），洗完后晾干，镜检确认无残留菌体和其它沉积 物，若不洁净则必须重复洗涤至洁净为止。
微生物直接计数和大小测定
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2、测微技术：
⑴接目镜测微尺校正： 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央刻有 “十字”刻线。 镜台测微尺每小格为10μm。 接目镜测微尺装入接目镜内隔板（光栏）上，刻 度向下，并把镜台测微尺置于载物台上。 先用低倍镜校对，调整至能清楚地看到镜台测微 尺为止。移动镜台测微尺和旋转目镜测微尺，使二者 刻度平行，并使目镜测微尺“0”与镜台测微尺一条线 重合，然后找出两个尺刻线再次重合时分别格数
微生物数量测定
微生物数量测定在生物学和医学领域，微生物的数量测定是一个重要的实验技术。
通过对微生物数量的测定，我们可以了解生物体在不同环境中的适应性和生存能力，评估环境的健康状态，以及监测和治疗疾病等。
微生物数量测定的基本原理是利用单位体积或单位面积上的微生物细胞数，通过统计和计算得到微生物的数量。
常用的方法包括显微镜计数法、比浊法、平板计数法等。
显微镜计数法是一种直接计数法，通过显微镜观察并计数样品中的微生物数量。
该方法需要将样品均匀涂布在载玻片上，干燥后进行染色和固定，然后使用显微镜观察并计数。
该方法的优点是简单易行，适用于微生物数量较少的样品，但不适用于大量样品。
比浊法是一种通过测量样品的浊度来测定微生物数量的方法。
该方法是通过将样品与标准曲线进行比较，得出微生物的数量。
该方法的优点是快速、简便、准确度高，适用于大量样品的测定。
但是，该方法需要使用标准曲线，对于某些微生物可能不太准确。
平板计数法是一种通过培养微生物并计数菌落数量来测定微生物数量的方法。
该方法是将样品稀释后涂布在培养基上，培养一定时间后统计菌落数量，然后计算出微生物的数量。
该方法的优点是准确度高，适用于各种微生物的测定，但需要一定的培养时间和人力。
微生物数量测定的应用领域非常广泛，包括环境科学、医学、食品科学、农业科学等。
例如，在环境科学中，微生物数量测定可以用来评估污染物的毒性对生态环境的影响；在医学中，微生物数量测定可以用来监测和治疗疾病；在食品科学中，微生物数量测定可以用来控制食品的质量和安全；在农业科学中，微生物数量测定可以用来了解土壤的健康状况和作物的生长情况等。
微生物数量测定是一种重要的实验技术，广泛应用于生物学和医学等领域。
通过对微生物数量的测定，我们可以更好地了解生物体的适应性和生存能力，评估环境的健康状态，监测和治疗疾病等。
未来随着科技的不断进步和应用领域的不断拓展，微生物数量测定的方法和应用将更加多样化和精准化。
在生物学和医学领域，微生物的大小和数量的测定对于研究生命过程、疾病诊断和治疗等方面都具有重要的意义。
211066664_了解临床微生物检验的常用染色方法
医药健闻了解临床微生物检验的常用染色方法李玉梅 （自贡市第四人民医院，四川自贡 643000）微生物细胞含有大量的水分（通常在80%以上），对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。
所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都要经过染色后，才能在显微镜下进行观察。
但是，染色就意味着微生物处于死亡状态，其形态、结构也会发生一些变化，并不能完全代替活细胞的真实状况。
基本原理微生物染色通常有化学和物理两种方法。
其中，物理方式通常采用渗透、染料吸附等，化学方法则利用染料与细胞物质进行化学反应。
通常来说，酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。
但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。
细菌的等电点较低，呈现出酸性。
因此，一般细菌学经常会使用碱性染料染色。
染色还可能与菌体结构、膜的状况（通透性、孔大小等）、细胞结构，以及染色时的电解质、温度等有一定关系。
染料染料分为人工和天然两种。
天然染料存在于自然界当中，例如苏木素、胭脂虫红等，通常提取于植物当中。
人工染料一般在煤焦油当中获得，属于苯衍生物。
染料通常为有机酸或碱类，在有机溶剂当中易溶解，水中难溶解，但可以制成盐类而溶于水。
染料还可分为酸性、碱性、中性、单纯四大类。
其中，酸碱染料并不是依据溶液的pH值决定，而是其自身所带的助色基团决定。
将助色基团电离之后，查看电荷的带电情况。
通常而言，碱性染料助色基团为正电荷，酸性染料助色基团为负电荷。
因此，碱性染料通常能电离无色阴离子和有色阳离子，如龙胆紫、亚甲基蓝等；酸性染料通常能电离一些无色阳离子和彩色阴离子，如伊红、苦味酸、加那绿等。
中性染料是一种复合型染料，通常是将酸碱染料进行混合。
单纯染料通常亲和力低，染色的能力通常由被染色物决定，若能够较好地溶于被染色物当中，则染色能力强，且单纯染料难以溶于水，可溶脂肪溶剂，例如紫丹类。
微生物的染色与计数实验报告
一、实验题目：微生物的染色与计数本实验分三个部分：①革兰氏染色法②微生物显微镜直接计数法③海洋微生物菌群分析及形态观察二、实验目的与要求1.了解革兰氏染色的原理和重要性，学习并掌握革兰氏染色的方法。
2.重点掌握酵母等单细胞微生物的显微计数方法和技术要领。
3.掌握海洋样品中微生物菌群分离的一般方法，认识海洋霉菌并进行形态观察，学会细菌、霉菌菌群的辨认和优势度分析。
三、实验原理为了进一步认识微生物，我们需要对其进行染色和计数，革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状，它不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
染色过后就要对微生物进行计数，我们采用显微镜直接计数法，将小量待测样品的悬浮液置于血细胞计数板上，该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室，每一个大方格中的小方格都是400个。
设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，本实验采用25个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000AB个。
而为了研究在海洋环境下（潮间带海泥）中存在的细菌、霉菌、放线菌等微生物的数量和种类，将样品在微生物适宜生长的基本培养基上逐级进行平板稀释，达到检测待测物品中生活着的所有微生物的目的。
四、实验材料与用具1.溶液或试剂：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌悬液，革兰氏染色液，潮间带退潮后距离表层5㎝深处底泥样品制备菌悬液，胰蛋白胨大豆固体培养基（TSA），青霉素，链霉素，20％乙酸，乳酚棉兰染色液，无菌海水等2.仪器用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管，试管、小烧杯、天平、微量移液器、吸管、涂布器、接种环、载玻片，酒精灯，镊子等五、操作步骤可将整个实验分为三个阶段：第一阶段：革兰氏染色①制片：将先前培养的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌分别作涂片，干燥、固定。
微生物细胞计数及染色操作
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
革兰阳性菌细胞壁特殊组分
膜磷壁酸 壁磷壁酸
革兰阴性菌细胞壁特殊组分
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上 加盖专用的厚玻片。
(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖 玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水
纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数 室内。
(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要 按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格 （即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格 ×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需 再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格， 每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中 格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一 种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格 都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。
2.血球计数板的使用 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。 (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每 小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即 可。
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人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。08:47:2308:47:2308:4712/17/2020 8:47:23 AM
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做一枚螺丝钉，那里需要那里上。20. 12.1708 :47:230 8:47De c-2017 -Dec-2 0
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微生物细胞计数及染色操作
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微生物细胞计数及染色操作
•大肠杆菌革兰氏染色
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微生物细胞计数及染色操作
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炭疽芽胞杆菌
微生物细胞计数及染色操作
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微生物细胞计数及染色操作
•(二)酵母细胞数的测定操作方法 •1.血球计数板的构造
• 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻 片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。
• 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球 计数 板、载玻片等。
• 麦芽汁培养基、酵母菌。 • 吸管、吸水纸等。
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微生物细胞计数及染色操作
四、实验步骤
•（一） 染色实验
1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未 知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球 菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于 浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫 手为宜。
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微生物细胞计数及染色操作
•革兰阳性菌细胞壁特殊组分
•膜磷壁 •壁磷壁酸 酸
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微生物细胞计数及染色操作
•革兰阴性菌细胞壁特殊组分
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微生物细胞计数及染色操作
•革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
细胞壁 强度 厚度
肽聚糖层数 肽聚糖含量
磷壁酸 外膜
脂蛋白 脂多糖
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微生物细胞计数及染色操作
2．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 分钟，水洗。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 用水冲净酒精。
（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。
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微生物细胞计数及染色操作
•肽聚糖(peptidoglycan)
•革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
•N-乙酰葡糖 胺 •N-乙酰胞壁酸
•溶菌酶作用 点
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•青霉素作用 点
微生物细胞计数及染色操作
•肽聚糖(peptidoglycan)
•革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
革兰阳性菌 较坚韧 20-80nm
可多达50层 占细胞壁干重50%-80%
+ — — —
革兰阴性菌 较疏松 10-15nm 1-2层
占细胞壁干重5%-20% — + + +
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微生物细胞计数及染色操作
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 （basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
•2.血球计数板的使用 •(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。 •(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每 小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即 可。
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微生物细胞计数及染色操作
•(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室 上加盖专用的厚玻片。
•(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于 盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸
微生物细胞计数及染色 操作
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2020/11/14
微生物细胞计数及染色操作
一、目的要求
• 学会血球计数板的使用方法
• 了解革兰氏染色的原理
• 学习并掌握革兰氏染色的方法
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微生物细胞计数及染色操作
•二 酵母细胞计数原理
• 微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法 和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接 计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后 者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费 时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计 数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式 运算后，即可得出实际数值。
水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计 数室内。
•(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室， 要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中 格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格 ×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需 再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
• 碱性染料初染液——结晶紫（crystal violet）
• 媒染剂——碘（iodine）
• 脱色剂——95％的酒精（ethanol）
• 复染液——番红
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微生物细胞计数及染色操作
三、实验器材
• 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；
• 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95% 乙醇，载玻片，显微镜等。
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பைடு நூலகம்
微生物细胞计数及染色操作
（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽 孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱 色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌 龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或 已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半， 每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个 大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供 微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度 为，其体积为0.1mm3。
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微生物细胞计数及染色操作
•计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中 格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为 25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是 哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大 方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。
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微生物细胞计数及染色操作
细菌染色基本原理
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 • 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌
的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌，用G-表示。 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。