分子标记的类型

特点: 特点:
具有共显性的特点； 具有共显性的特点； RFLP标记具有种族特异性 标记具有种族特异性， RFLP标记具有种族特异性， 对于分析一个分离群体的不同 来源的染色体片段具有重要价 值； RFLP标记遍及整个基因组； RFLP标记遍及整个基因组； 标记遍及整个基因组 不足：主要表现在所需DNA量 不足：主要表现在所需DNA量 DNA 步骤复杂，需要的仪器、 大，步骤复杂，需要的仪器、 设备较多，周期长，成本高， 设备较多，周期长，成本高， 检测中利用放射性的同位素， 检测中利用放射性的同位素， 易造成环境污染； 易造成环境污染；
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随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ） 随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）
RAPD 技术的步骤
RAPD 扩增
DNA 的 制备
特点
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检测未知序列的基因组DNA 检测未知序列的基因组DNA RAPD标记为显性标记， RAPD标记为显性标记，极少数为共显 标记为显性标记 性标记 引物无种族特异性 RAPD技术简单 RAPD技术简单 RAPD标记的最大缺点是再现性差 RAPD标记的最大缺点是再现性差
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数据处理
简单重复序列ＤＮＡ（ＳＳＲ） 简单重复序列ＤＮＡ（ＳＳＲ）
SSLP(simple
sequence
length
polymorphism) 即简单序列长度多态性， 即简单序列长度多态性， 是由于简单序列的重复次数不同， 是由于简单序列的重复次数不同，导致扩增片
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限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ） 限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）
RFLP标记是发展最早的 标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异， 标记技术。 是指基因型之间限制性片段长度的差异， 标记是发展最早的 标记技术 是指基因型之间限制性片段长度的差异 这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。 这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。 RFLP技术主要包括以下基本步骤： 技术主要包括以下基本步骤： 技术主要包括以下基本步骤 DNA提取→用限制性内切酶酶切 提取→ 片段→ 提取 用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开 →用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移 片段 片段转移 到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分 片段（ 杂交） 到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的 片段 杂交 析。 RFLP遍布整个基因组，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂， 遍布整个基因组， 实验操作繁琐， 遍布整个基因组 并且非常稳定， 实验操作繁琐 检测周期长，成本高昂， 不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以 转换成以PCR为基础的 不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将 转换成以 为基础的 标记。 标记。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma）限制性内切酶片段长 ） 度多态性)作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中 作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中， 度多态性 作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中，但它 运用于植物抗性研究还只是近几年的事。 能对植物的抗性基因进行定位和分离， 运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用 能对植物的抗性基因进行定位和分离 RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从 技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净 ， 技术 酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、 酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在 污染环境下抗性分化进化水平上的差异。 污染环境下抗性分化进化水平上的差异。 与核酸序列分析相比， 可省去序列分析中许多非常繁琐工序， 而言， 与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对 可省去序列分析中许多非常繁琐工序 但相对RAPD 而言， RFLP方法更费时、费力，需要进行 方法更费时、 多种酶切、 方法更费时 费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对 多种酶切 转膜以及探针的制备等多个步骤， 基因组单拷贝序列进行鉴定。 又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由 优越之处， 基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比 又有比 优越之处 父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还 是由缺失、插入造成的。 是由缺失、插入造成的。
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Molecular Markers
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限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ） 随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ） 随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ） 简单重复序列ＤＮＡ（ＳＳＲ）
扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ） 其他种类的分子标记
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Hale Waihona Puke Baidu
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随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ） 随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）
技术是建立在PCR Reaction)基础之上的一种可对整 RAPD 技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整 个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板, DNA为模板 个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板, 以单个 人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA 人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA 聚合酶( 作用下, 进行PCR 扩增[1] [1]。 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增[1]。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电 泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。 泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了 基因组的多态性。 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、 基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化 关系 RAPD标记原理 标记原理: RAPD标记原理: RAPD标记的原理与PCR技术原理相同。在模板DNA、引物和4种碱基存在的条件 RAPD标记的原理与PCR技术原理相同。在模板DNA、引物和4 标记的原理与PCR技术原理相同 DNA 依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，以合成特异DNA片段的一种方法。PCR反应 DNA聚合酶的体外酶促反应 DNA片段的一种方法 下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，以合成特异DNA片段的一种方法。PCR反应 分变性（denaturation）、复性（annealling）、延伸（extension）三步。 ）、复性 ）、延伸 分变性（denaturation）、复性（annealling）、延伸（extension）三步。 PCR原理: PCR原理: 原理
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扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ） 扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）
AFLP（Amplified Fragments Length Polymorphism）即扩增片 （ ） 段长度多态性，是由Zabeau 和Vos（1993）发明的一种利用 段长度多态性，是由 （ ）发明的一种利用PCR技 技 术检测DNA多态性的方法。AFLP 结合了 多态性的方法。 结合了RFLP的稳定性和 的稳定性和PCR技术 术检测 多态性的方法 的稳定性和 技术 高效性的特点。 的多态性极高， 高效性的特点。AFLP的多态性极高，一次可以检测到 －150个扩 的多态性极高 一次可以检测到100－ 个扩 增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。 增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。
段长度的不同而产生的多态性。 段长度的不同而产生的多态性。
SSR标记的特点 标记的特点
数量几乎无限，检测出多态性的频率极高； 数量几乎无限，检测出多态性的频率极高； SSR技术检测到的是一个单一的多等位基因位 技术检测到的是一个单一的多等位基因位 点； SSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合和杂合 标记为共显性标记， 标记为共显性标记 基因型； 基因型； 结果重复性高，稳定可靠； 结果重复性高，稳定可靠； 兼具PCR反应的优点，所需 反应的优点， 量少， 兼具 反应的优点 所需DNA量少，对 量少 DNA质量要求不高； 质量要求不高； 质量要求不高
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限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ） 限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）
限制性片段 长度多态性 （ＲＦＬＰ）
基本原理： 基本原理：
特定生物类型的基因组 DNA经限制性内切酶 经限制性内切酶（ DNA经限制性内切酶（ restriction enzymes,RE） enzymes,RE） 酶切消化后， 酶切消化后，会产生数万条 DNA片段 片段， DNA片段，通过琼脂糖电泳将 这些片段按大小顺序分离开 ，转移到尼龙膜或硝酸纤维 素膜上；用放射性同位素或 素膜上； 非放射性物质标记的DNA DNA作为 非放射性物质标记的DNA作为 探针，与膜上的DNA DNA进行杂交 探针，与膜上的DNA进行杂交 若某一位置上的DNA DNA片段与 ，若某一位置上的DNA片段与 探针的序列相似， 探针的序列相似，则探针就 结合到这个位置上，通过放 结合到这个位置上， 射性自显影或酶学检测， 射性自显影或酶学检测，可 以显示出不同材料含有与探 针序列同源的酶切片段在长 度上的差异，即多态性。 度上的差异，即多态性。
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双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链， DNA聚合酶的参与下， 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据 DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链 聚合酶的参与下 碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以 碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以 发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制 的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制 聚合酶 。
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分子标记的各种类型
Molecular Markers
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分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基 础的遗传标记， 水平遗传多态性的直接的反映。 础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。 水平遗传多态性的直接的反映 与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、 形态学标记、 与其他几种遗传标记 形态学标记 生物化学标记、 细胞学标记相比， 分子标记具有的优越性有： 细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多 分子标记具有的优越性有 数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利； 数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利； 基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的； 基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的； 在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记 在生物发育的不同阶段，不同组织的 都可用于标记 分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不 的变异； 分析；分子标记揭示来自 的变异 表现为中性， 影响目标性状的表达，与不良性状无连锁； 影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简 迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子 单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在 分子 标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、 标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作 基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、 图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因 克隆等方面。 克隆等方面。