菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

15食安（1）班张凯

摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。

关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性；

前言

菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。[2]

本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。

1实验材料与仪器

1．1实验材料与试剂

新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二

钠)]，10％三氯乙酸(TCA)。

1．2实验仪器

722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；

TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；

D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；

DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；

可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；

AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；

BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；

DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；

HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

2实验方法

2.1菠萝蛋白酶的粗酶提取

称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。

2.2盐析

-，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm离心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。

2.3透析

将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放

入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。

2.4酶活力测定方法

取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm 波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。

实验步骤按照表格中完成。

表1 酶活测定步骤

试剂(ml) 对照组平行样品1 平行样品2 平行样品3 TCA 3 ———

酶液0.1 0.1 0.1 0.1

激活剂0.9 0.9 0.9 0.9

酪蛋白 1 1 1 1

37°C准确反应10min

TCA — 3 3 3

A280nm OD 值粗提—0.791 0.818 0.868 盐析—0.823 0.907 0.986 透析—0.894 0.875 0.848

2.5蛋白质含量测定方法

将酶液稀释至一定程度，采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量（参照附录1）。

3实验结果与分析

3.1蛋白质含量计算

3.1.1标准曲线的绘制

表X 0-1000ug/ml标准曲线的绘制

管号 1 2 3 4 5 6

1000μg/mL牛血清白蛋白0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

蛋白质浓度（μg/mL）0 200 40 600 800 1000 吸光值（A595）00.1570.2450.3910.5350.656

得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000μg/mL标准曲线。

图1 蛋白吸光值标准曲线

3.1.2样品的测定

准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。

3.1.3结果计算

由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。

查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)