分子生物学 第5章 分子生物研究法(上)
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限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
现代分子生物学(第三版)课后答案 第五章分子生物学研究方法(上)
第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。
2，如何理解PCR扩增的原理和过程。
答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。
3，简述定量PCR的原理和过程。
答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。
一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。
随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。
4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。
应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。
cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。
应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。
5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。
答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
分子生物学-第五章--蛋白质的生物合成可编辑全文
遗传密码的连续性
遗传密码的摆动配对
密码的简并性具有的生物学意义
它允许生物体的DNA碱基有较大变异 的余地，使基因突变可能造成的为害降至 最低程度，而不影响物种形状的表达，对 环境的适应和物种遗传的稳定。
例如细菌DNA中G+C含量变动很大， 但不同G+C含量的细菌却可以编码出相同 的多肽链。
这归因于同义密码子的分布规则。
摇摆假说
由于同义密码子的第1、2个碱基是保守的，第3个碱 基是可变的，因此解读同义密码子的tRNA的反密码子的 第1个碱基必定具有最小的专一性，也就是说它与密码子 第3个碱基之间的配对原则具有一定范围的灵活性。
由于反密码子位于tRNA的突环上，因此反密码子三 联体的排列就会呈弯曲弧线，不能与密码子保持完全的平 行，加上反密码子的第1个核苷酸位于非双链结构的松弛 环内，摇摆的自由度较大，从而导致密码子的第3个核苷 酸和反密码子的第1个核苷酸之间可能形成非标准的碱基 配对，反密码子的这一位点也被称为摇摆位点（一般为第 34位碱基）。
在原核生物和真核生物中，均存在另一种 携带蛋氨酸的tRNA，识别非起始部位的蛋氨 酸密码，AUG。
tRNA在将密码的信息及排列转换为多肽链中 的氨基酸序列的过程中起着中心及桥梁的作用。
最简单的tRNA只有74个核苷酸，而最大的也 很少超过94个核苷酸。这个特点使得tRNA成为最 先被定序的核酸。
序列测定的结果揭示tRNA是同源性相对较高 的RNA分子，tRNA分子含有大量修饰核苷酸和可 能存在各种碱基配对的二级结构。
能 够 识 别 mRNA 中 5′ 端 起 始 密 码 AUG 的 tRNA是一种特殊的tRNA，称为起始tRNA。
在 原 核 生 物 中 ， 起 始 tRNA 是 一 种 携 带 甲 酰蛋氨酸的tRNA，即tRNAifmet；
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
现代分子生物学考试重点
第二章染色体与DNA2.什么是核小体？简述其形成过程。
由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。
核小体是由H2A,H2B,H3,H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bp的DNA组成的。
八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体外面。
每个核小体只有一个H1。
所以，核小体中组蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A,H2B,H3,H4各两个，H1一个。
用核酸酶水解核小体后产生只含146bp核心颗粒，包括组蛋白八聚体及与其结合的146bpDNA，该序列绕在核心外面形成1.75圈，每圈约80bp。
由许多核小体构成了连续的染色质DNA细丝。
核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一阶段。
在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩至原尺寸的1/7。
200bpDNA完全舒展时长约68nm,却被压缩在10nm的核小体中。
核小体只是DNA压缩的第一步。
核小体长链200bp→核酸酶初步处理→核小体单体200bp→核酸酶继续处理→核心颗粒146bp3简述真核生物染色体的组成及组装过程除了性细胞外全是二倍体是有DNA以及大量蛋白质及核膜构成核小体是染色体结构的最基本单位。
核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）各两个分子构成的扁球状8聚体。
蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。
组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。
非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构---- 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。
2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
(NEW)朱玉贤《现代分子生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
4.3 名校考研真题详解 第5章 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术
5.1 复习笔记 5.2 课后习题详解 5.3 名校考研真题详解 第6章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术 6.1 复习笔记 6.2 课后习题详解 6.3 名校考研真题详解 第7章 原核基因表达调控 7.1 复习笔记 7.2 课后习题详解 7.3 名校考研真题详解 第8章 真核基因表达调控 8.1 复习笔记 8.2 课后习题详解 8.3 名校考研真题详解
② T2噬菌体感染大肠杆菌实验
a．在分别含有35S和32P的培养基中培养大肠杆菌。
b．用上述大肠杆菌培养T2噬菌体，分别制备含35S的T2噬菌体和32P的
T2噬菌体。
c．分别用含35S的T2噬菌体和32P的T2噬菌体感染未被放射性标记的大 肠杆菌。
d．培养一段时间后，将混合液离心，检测子代噬菌体放射性。上清液 主要是噬菌体，沉淀物主要是大肠杆菌。
（4）基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划是一项国际性的研究计划，其目标是确定生物物种基因组所 携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成生物物种基因组的全部 DNA序列。
功能基因组学相对于测定DNA核苷酸序列的结构基因组学，其研究内容 是在利用结构基因组学丰富信息资源的基础上，应用大量的实验分析方 法并结合统计学和计算机分析方法来研究基因的表达、调控与功能，以 及基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的 相互作用和生物的生长发育等规律。功能基因组学的研究目标是对所有 基因如何行使其职能从而控制各种生命现象的问题作出回答。
严格地说，重组DNA技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他
可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。
分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
足迹试验的优点
可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段 之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试 验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间 的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以 加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核 酸序列的特异性。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
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第六节
原理
研究DNA与蛋白质相互作用的方法
2.6.1 凝胶阻滞试验
又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究 DNA与 蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选 作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离是同 其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分 子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也 就相在缩短了。所以当特定的 DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在 凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋 白质分子发生了结合作用。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA
测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel
切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一 种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这 一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长 度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形 象地称之为“足迹” 。
分子生物学总结
分⼦⽣物学总结分⼦⽣物学总结第⼀章绪论⼀. DNA重组技术和基因⼯程技术.DNA重组技术⼜称基因⼯程,⽬的是将不同的DNA⽚段按照⼈们的设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达.产⽣影响受体细胞的新的遗传性状.基因⼯程技术还包括其他可能使⽣物细胞基因组结构得到改造的体系.第⼆章染⾊体与DNA⼀. DNA的⼀、⼆、三级结构特征.DNA⼀级结构特征1. 双链反向平⾏配对⽽成2. 脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA⾻架，碱基排在内侧3. 内侧碱基通过氢键互补形成碱基对DNA⼆级结构特征绕DNA双螺旋表⾯上出现的螺旋沟，宽的沟称为⼤沟，窄沟称为⼩沟。
⼤沟，⼩沟都、是由于碱基对堆积和糖-磷酸⾻架扭转造成的。
DNA三级结构特征拓扑异构酶拓扑异构酶负超螺旋松弛DNA 正超螺旋溴已啶溴已啶⼆. 原核⽣物DNA具有哪些不同于真核⽣物DNA的特征.1. 结构简练2. 存在转录单元3. 有重叠基因三. DNA复制通常采取哪些⽅式.1. 线性DNA双链的复制.2. 环状DNA双链的复制分为θ型、滚环型和D-环型等.四. 原核⽣物DNA的复制特点.1. DNA双螺旋的解旋2. DNA复制的引发3. 冈崎⽚段与半不连续复制4. 复制的终⽌5. DNA聚合酶五. 细胞通过哪⼏种修复系统对DNA损伤进⾏修复?1. 错配修复2. 碱基切除修复3. 核苷酸切除修复4. DNA直接修复六. 什么是转座⼦?可分为哪些种类?转座⼦是存在与染⾊体DNA上可⾃主复制和位移的基本单位原核⽣物转座⼦的类型: 1. 插⼊序列 2. 复合转座⼦ 3. TnA家族第三章⽣物信息的传递(上)⼀. 什么是编码链?什么是模板链?与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另⼀条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。
三. 简述σ因⼦的作⽤.σ因⼦的作⽤是负责模板链的选择和转录的起始,它是酶的别构效应物,使酶专⼀性识别模板上的启动⼦.四. 什么是Pribnow box?它的保守序列是什么?RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后,⽤DNase I⽔解DNA,然后⽤酚抽提,沉淀纯化DNA后得到⼀个被RNA聚合酶保护的DNA⽚段,约有41-44个核苷酸对.在被保护区内有⼀个由5个核苷酸组成的共同序列,是RNA聚合酶的紧密结合点,称为Pribnow box. Pribnow区的保守序列是: TTGACA五. 简述原核⽣物和真核⽣物mRNA的区别.(⼀)原核⽣物mRNA的特征1、半衰期短2、多以多顺反⼦的形式存在3、5’ 端⽆“帽⼦”结构, 3’ 端没有或只有较短的polyA 结构。
现代分子生物学(第四版)朱玉贤课件 PPT 第1章 绪论
主要教材与参考书
1.《现代分子生物学》 第3版（2007）朱玉贤、李毅、郑晓峰
2. 现代生物学精要(Instant Notes)系列 《分子生物学》第二版（2002）刘进元 《Molecular Biology》2e P.C.turner,et al 3. Principles of Biochemistry
1994 Gilman Rodbell 美国
1995
Lewis Nusslein-Volhard Wieschaus
美国 德国 美国
建立DNA测序方法
诺贝尔生理医学奖
建立和发展了单克隆抗体技术
诺贝尔生理医学奖
发现可移动癌基因
诺贝尔化学奖 诺贝尔生理医学奖
G蛋白在细胞内信息传导中的作用 诺贝尔生理医学奖
发现了控制果蝇体节发育的基因
诺贝尔生理医学奖
年份
科学家
Doherty 1996 Zinkernagel
国籍
澳 瑞士
1997 Prusiner
美
Furchgott
美
1998
Ignarro Murad
1999 Blobel
美
Carlsson
德
2000 Greengard
预计到2020年，生物医药占全球药品的比重 将超过1/3，生物质能源占世界能源消费的比 重将达5%左右，生物基材料将替代10%-20%的 化学材料。
生物制造、生物能源、生物环保等一 批新兴产业正在快速形成。
据Ernst＆Young研究报告，2010年生 物环境、生物工业处理、生物海洋技术世界市 场规模将达到 134亿美元、327亿美元、288 亿美元。
第5章 分子生物学基本研究方法4-研究DNA-蛋白质互作的方法
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
足迹试验的优点 可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段 之间的结合区域。
使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的
核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。
可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定
其核酸序列的特异性。
西北师范大学
精品课程 武国凡 2015.11
分子生物学 与基因工程
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
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分子生物学 与基因工程
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
2 DNasel足迹试验
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分子生物学 与基因工程
分子生物学 与基因工程
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
3 甲基化干扰试验
检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结合作
用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNA 与蛋白质之 间相互作用的模式。
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分子生物学 与基因工程
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
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分子生物学 与基因工程
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
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分子生物学 与基因工程
第五章 分子生物学基本技术——核酸蛋白互作
思考题
1、研究DNA与蛋白质相互作用的方法有哪些？ 2、凝胶阻滞试验原理是什么？
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分子生物学 第五章
成多肽的氨基酸顺序，再进行比较分析来推测各氨基酸的
密码子。
三、Khorana的实验
Khorana就是用这种方法将所有的遗传密码都破译了。 这项实验还同时证实了三联密码子的准确性以及简并性的存在。
Robter Holley发现并得到了 tRNA的精确结构，应用上述各种方 法仅用了4年时间，于1965年完全查清了20种基本氨基酸所对应 的全部61个密码子，编出了遗传密码字典（教材表 5-4）。AUG 为起始密码子（initiation codon），其余61个密码子对应20种氨 基酸。另外的3个密码子（UAA、UAG和UGA）是终止密码子 （termination codons or stop codons），它们不编码任何氨基酸， 只结束蛋白质的合成。
除了色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其它氨基酸 都有一个以上的密码子，如：亮氨酸、精氨酸、丝氨酸 都有6个密码子，大多数氨基酸有2个、3个或4个密码子 （教材表5-5）。
二、密码的简并性(degeneracy) 密码子的简并性可以减少有害的突变，具有非常 重要的生物学意义。
三、密码的摆动性
密码的简并性往往表现在密码子的第三位碱基上，如甘 氨酸的密码子是GGU、GGC、GGA、GGG，丙氨酸的 密码子是GCU、GCC、GCA、GCG，它们的前两位碱基 是相同的，只是第三位碱基不同。有些氨基酸只有两个密 码子，通常第三位碱基或者都是嘌呤，或者都是嘧啶。 显然，密码子的专一性基本上取决于前两位碱基，第三位 碱基起的作用有限。即第三位碱基有较大的灵活性。
蛋白质分子的20种氨基酸编码，不可能是一对一的关系，两个碱基 决定一个氨基酸也只能编码16种氨基酸，如果用三个碱基决定一个 氨基酸，43=64，就足以编码20种氨基酸。这是编码氨基酸所需碱 基的最低数目，故密码子应是三联体（triplet）。
分子生物学复习题选择判断题 (1)
第二章染色体与DNA1、染色体包括DNA和蛋白质两大部分2、由于细胞内的DNA主要在染色体上，所以说遗传物质的主要载体是染色体3、下列哪一项对于DNA作为遗传物质是不重要的:（B）A.DNA分子双链且序列互补B.DNA分子的长度可以非常长,可以长到将整个基因组的信息都包含在一条DNA分子上C.DNA可以与RNA形成碱基互补D.DNA聚合酶有3` 5`的校读功能4、下列有关C值的叙述正确的是:（C）A.生物的进化程度越高,其C值就越大B.C值与有机体的形态学复杂性成反比C.每一个生物门中的C值与有机体的形态学复杂性大致成比例D.C值与有机体的形态学复杂性成正比5、人是最高等生物,其基因组碱基对数目(2.9×109)是动物界最大的.（×）6..以下DNA(只写出一条链的序列)中,解链温度最高的是:（C）A.TTCAAGAGACTT (4个GC对)B.TCACAGTACGTC (6个GC对)C.GGACCTCTCAGG (8个GC对)D.CGTAGAGAGTCC (7个GC对)7、一个复制子是:（C）A.细胞分离期间复制产物被分离之后的DNA片段B.复制的DNA片段和在此过程中所需的酶和蛋白C.任何自发复制的DNA序列(它与复制起始点相连)D.复制起点和复制叉之间的DNA片段8、真核生物复制子有下列特征,它们:（B）A.复制元的大小都是一样的. B几个相邻的复制元可形成复制元簇C.不同复制元簇在复制起始的时间上是同步的.D.复制时间比原核生物短.9、下列有关冈崎片段的描述中,正确的是:（A）A.冈崎片段出现在DNA复制过程的滞后链中B.冈崎片段的发现能证明DNA复制是以半保留复制方式进行的C.冈崎片段只在原核生物DNA复制中出现D.冈崎片段只在真核生物DNA复制中出现10、原核生物DNA复制过程中,冈崎片段合成的方向与复制叉移动的方向相同.（×）11、聚合反应的特点：(1) 以单链DNA为模板(2) 以dNTP为原料(3) 引物提供3´-OH (4) 聚合方向为5´→3´12、大肠杆菌DNA聚合酶I的作用不包括:（D）A.5` 3`外切酶活性B.3` 5`外切酶活性C.5` 3`DNA聚合酶活性D.3` 5`DNA聚合酶活性13、真核细胞的DNA聚合酶和原核细胞的DNA聚合酶一样,都具有核酸外切酶活性.（×）A.DNA Helicase的生物学功能是:（C）A.缓解DNA复制时产生的twisting problemB.防止DNA的过度超螺旋C.解开双螺旋DNA双链的配对D.促进引物酶的结合14、DNA复制过程,滞后链的引发是由引发体来完成的.15、真核生物复制起始点的特征包括（B ）A、富含GC区B、富含AT区C、Z-DNAD、无明显特征16、基因组DNA复制时，先导链的引物是DNA，后随链的引物是RNA（×）17、原核DNA合成酶中（C ）的主要功能是合成前导链和冈崎片段A、DNA聚合酶ⅠB、DNA聚合酶ⅡC、DNA聚合酶ⅢD、引物酶18、下面关于DNA复制的说法,正确的是:DA.按全保留机制进行B.按3` 5`方向进行C.需要4种NTP的加入D.需要DNA聚合酶的作用19、有关DNA复制的叙述,错误的是:ADA.新链的方向与模板链方向相同B.新链的延伸方向是5` 3`C.需要DNA聚合酶参加D.合成的新链与模板链完全相同20、DNA复制的调控主要发生在起始阶段,即一旦复制开始它将连续进行直至整个基因组复制完毕.（×）21、新生DNA链上的甲基化修饰在帮助DNA修复系统识别亲本链过程中起决定作用.（×）22、有关复制转座,不正确的叙述是:CA.复制转座子,即在老位点留有一个拷贝B.要求有转座酶C.移动元件转到一个新的位点,在原位点上不留元件D.要求有解离酶23、在真核生物核内。
分子生物学
第一章分子生物学定义：分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。
分子生物学简史：○11962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型与Wilkins共享诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X线衍射证实了DNA模型。
○21965年，Jacob（法）和Monod（法）提出并验证了操纵子作为调节细菌细胞代谢的分子机制而与Iwoff共享诺贝尔生理医学奖。
○31968年，Nirenberg（美）由于在破译DNA遗传密码方面的贡献，与Holly和Khorana 共享了诺贝尔生理医学奖。
○41980年，Sanger因设计出一种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Gilbert 和Berg分享诺贝尔化学奖。
○51989年，Altman（美）和Cech（美）由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酸）而共享诺贝尔化学奖。
○61997年，Prusiner（美）由于发现阮病毒是阿尔茨海默病毒（老年痴呆症）等疾病的病原并能直接在宿主细胞中繁殖传播而获得诺贝尔生理医学奖。
作业：你认为二十一世纪初分子生物学将在哪些领域取得进展？第二章C值：生物单倍体基因组DNA的总量。
C值反常现象：动物形态学复杂程度与C值大小不一致的现象称为C值反常现象。
也称“C 值谬误”真核细胞DNA序列：⑴不重复序列⑵中度重复序列⑶高度重复序列核小体定义：核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA 组成的。
八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。
每个核小体只有一个H1。
核小体是染色体结构的第一个层次，构成染色质的基本结构单位。
真核生物基因组的结构特点： 1. 基因组庞大；2.存在大量的重复序列3. 大部分为非编码序列4. 转录产物为单顺反子5. 有内含子结构6. 存在大量的顺式作用元件7. 存在大量的DNA多态性8. 有端粒结构原核生物的基因组特点：1、结构简练；2、存在转录单元；3、有重叠基因DNA的二级结构：分为右手螺旋和左手螺旋相邻碱基对平面之间的距离为0.34nm，即顺中轴方向，每隔0.34nm有一个核苷酸，以3.4nm为一个结构重复周期。
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——DNA、RNA及蛋白质操作技术
从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作 和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分 子生物学研究的核心技术。
Herbert Boyer
表明：
（1）像pSC101这样的质粒DNA分子可 以作为基因克隆的载体，从而把外源 DNA导入寄主细胞；
（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的 基因也可以被成功地转移到原核细胞 中并实现其功能表达；
（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一 种成功的基因克隆体系，有可能在 重组DNA或基因工程研究中发挥重要 作用。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体 。
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transform E. coli with recombinant plasmid
Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmid pSC101
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
• 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过 它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞 中的繁衍与性状表达。
• 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的 基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因 工程技术区别于其它技术的根本特征。
C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与 该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
1965
S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定； 科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1966
M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译 了全部遗传密码。
两大技术保证： 1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands
3’
5’
Restriction enzyme
Ligase
5’
3’
Restriction enzyme
SV40 DNA
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接 酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需 要。
DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到 足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备 自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄 主细胞中进行繁殖。
这就是基因克隆，或分子克隆 。
1964
重组DNA技术历史上的主要事件
事件
F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。
J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。 M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。
EcoRI EcoRI recognition sites
EcoRI cuts DNA into fragments
λ phage
DNA
Sticky end
The two fragments stick together by base pairing
Recombinant DNA
DNA ligase
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。
GGATCC CCTAGG
Second replication
Matt Meselson
Conservative Model
Semiconservative Model
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子 学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流 动和表达。
Jacob and Monod
但是，如果没有分离和富集单一DNA 分子的技术，科学家就无法对这类物质 进行直接的生化分析。
2.DNA的核苷酸序列分析技术
DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化 学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术 学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与 功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有 着十分广泛的使用价值。
年份 1869 1944 1952 1953
1957 1958 19591960 1961
Heat killed S cells
mixed with living R
cells
Living S cells in blood
sample from dead
mouse
Injection
Results
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制 机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
Only cells with recombinant plasmid survive to produce
1975-1977
F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。 1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
1978
首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰 岛素。
1980 1981
美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。
R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋 白质分子中的氨基酸序列。
Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了 调节基因表达的操纵子模型。
Rosalind Franklin
X-ray source
Crystallized DNA
Photograph ic film
Maurice Wilkins1953- Franklin & Wilkins
Description of the 3-D structure of DNA
Francis Crick & James Watson
分子克隆的载 体----具备自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
1970
H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内 切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录 酶。
1972-1973
H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个 重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶
1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway