结核病实验室诊断现状(04.10.17)
宁夏地区结核病实验室检测能力及现状分析
宁夏地区结核病实验室检测能力及现状分析摘要：目的准确了解目前宁夏全区各市县结核病实验室的运转状况，帮助发现基层结核病实验室中应解决的问题，加大阳性痰涂片的发现力度，进一步提高宁夏结核病实验室技术水平。
方法对全区各市县级实验室结核菌痰涂片开展室间质量控制（EQA）及现场评价，省级参比室进行最终质控考核，考核结果与2011年和2012年比较。
结果我区EQA地区覆盖率已达100%，质控频率为省级2次/年，市级1次/季度。
2013年省级EQA复检痰涂片省级EQA587张，镜检符合率98.6%，略高于2012年，但略低于2011年。
肉眼观察痰涂片总体符合率较2011年和2012年略有下降。
2013年现场质控发现痰片缺失21.0%，痰膜大小合格率91.9%，厚薄合格率90.8%，染色合格率92.4%，勉强达标。
结论宁夏各县级实验室基本情况良好，但也存在很多不足，为了更好地了解耐多药结核病流行情况，必须加强实验室能力建设，逐步推进结核病细菌学实验室检测能力。
关键词：痰检质控；室间质量控制（EQA）；现场评价我国属于结核病高负担国家之一，结核病疫情严重，尤其是近年来耐多药结核病（MDR-TB）的发生，成为国家结核病控制规划（NTP）的实施的重大障碍。
结核病细菌学检查是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准，对国家结核病控制项目的成功有重要作用[1]。
有效的质量控制，是痰涂片镜检在结核病防治规划中发挥作用的关键。
结核分枝杆菌痰涂片镜检更是发现传染源的最主要途径和手段。
如何加强痰涂片质量控制，提高各级结核病实验室的痰检质量，提高肺结核病患者的涂阳发率已成为当前国家结核病控制规划实施中的重要内容。
现将我区各地结核病实验室痰检EQA及现场评价结果分析报告如下。
1资料与方法1.1一般资料宁夏全区5个市、22个县2011～2013年所有结核病防治机构和医疗单位结核病实验室的阴性、阳性结核菌痰涂片和实验室登记本。
结核病实验室诊断现状与进展
不需要预热 不需要暗室
可用现有的显微镜
可使用电池电源
结核病的微生物学检验
中盖项目LED评估结果
与初诊患者
LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋 尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（ P=0.000） 随访患者 LED和明场显微镜的检出率分别为 7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26 个百分点（P=0.000）
结核病的生物化学检验
降钙素原（PCT）——感染标志
肺结核患者血清PCT水平明显低于社区获得性肺炎（ CAP）患者，HIV阴性的肺结核患者血清PCT水平并不 会明显增高，故可用于PTB和CAP的鉴别诊断，但当 PCT水平大于正常值时，其预后价值较差。可作为肺结核 和肺结核伴感染诊断的辅助指标。 ——[Eur Respir J 2011; 37(2):371]
结核病的分子生物学检验
（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)：Eiken,Japan 可同时检测患者是否感染结核 所用仪器设备极其简单 63 ℃扩增（避免非特异性扩增 多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区 域，设计4种引物 •对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 •密闭系统(没有污染的风险） •快速，两小时内即可得到检测结果， •肉眼观察
结核病的分子生物学检验
芯片制备质控 空白对照质 控 芯片杂交质控 靶基因扩增质控
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1
2
3 QC BC
4
5
6
结核病实验室诊断现状(04.10.17)
新型检测技术应用情况-1
设备配备情况
设备名称
全球基金项目
中盖结核病项 中盖结核病项
目一期
目二期
我省情况
LED
30个省89个地市 3个省4个地市 4个省4个地市 908个县区1027台 6个县区14台 25个县区46台
全覆盖
Hain
30个省89个地市 4个省4个地市 2个省2个地市 省本级及4地市共5
说明
• WHO在“201 1年全球结核病控制报告”中对该试 剂的评估结论为：单次XpertMTB／RIF检测可检出 99％的涂片阳性(简称涂阳)和>80％的涂片阴性(简 称涂阴)肺结核病患者。但有文献报道，单次 XpertMTB／RIF检测涂阴培阳样本的检出率分别为 72．5％和76．9％。由于涂阴患者包括涂阴培阳 、涂阴和培养阴性(简称培阴)两种类型，而涂阴培 阴患者的检出率必然低于涂阴培阳患者，因此， 该报告中XpeftMTB／RIF的MTB涂片阴性患者阳性 检出率较实际值偏高
对实验室的要求
• 目前的常规实验室方法虽各有长短，但总 体上仍不能满足结核病诊断的要求。快速 、准确、简便和低廉的实验室诊断技术一 直是人们不知疲倦追求的目标。特别是， 近年来人们将控制潜伏性感染或是临床前 期感染作为控制结核病的早期策略之一， 这些对实验室工作提出了较高的要求
对实验室的要求
• 在发达国家，由于结核病疫情低，具有特征性的 持续咳嗽、发热等症状已经不再是疑似结核病的 可疑症状，在这些国家需要：
结核病实验室诊断现状
主要内容
• 一、患者发现 • 二、结核病控制对实验室的要求 • 三、结核病实验室诊断现状 • 四、结核病实验室存在的问题 • 五、结核实验室诊断的主要难题 • 六、十二五结核病实验室建设
我国目前结核病诊断现状
浅析我国目前结核病诊断现状【摘要】目的：分析了解不同级别结核病定点医院及结防机构结核病患者诊断现状，为今后新诊断工具的评估和应用提供合理化建议。
方法：采用典型调查，对选取的8家医院或结防机构结核病患者诊断方式、诊断费用、诊断工具的敏感性、特异性等情况进行对比分析。
结果：省级和地市级医疗机构能够采用多种方法及工具进行肺结核的诊断和鉴别，而县级医疗机构诊断形式单一,仍以痰涂片和x线检查为主。
由于省级和地市级医疗机构尝试引进特异性与敏感性更高的诊断方法和工具对结核病患者进行诊疗，因此诊断所需费用也较县级医疗机构为高。
结论：经典的诊断方式-细菌学痰涂片与影像学x线检查仍然是最为常用的手段，目前省、市级特别是省级定点医院使用新检测手段的比例正慢慢加大，手段多元化，提高了肺结核患者的发现水平。
随着结核病新诊断方法与工具的不断问世，评估、优化、筛选集敏感性、特异性、及时性和经济性于一体的方法，因地制宜应用于不同层级结核病诊疗机构，可有效提高结核患者发现能力，缩短患者诊断延迟，减少肺结核的蔓延。
结核病一直都作为单因致死率最高、最主要危及人类健康的传染性疾病[1]。
据不完全统计，全球约有30%的人有结核菌感染史，由于耐药结核菌出现等原因，目前结核病疫情呈现出再次上升的趋势，每年约有近两百万人死于结核病[2]。
我国结核病疫情相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者数居全球第二位，同时我国耐多药结核病疫情也非常严重，是27个耐药结核病高负担国家之一[3]。
早发现、早诊断、选取敏感的抗结核药物联合治疗是有效控制结核病蔓延的关键手段。
长久以来，对结核病诊断主要一直沿用着经典的痰涂片抗酸杆菌染色及胸部x线检查等手段，但胸部x线的分辨率较低，特异性不强，痰涂片检查阳性率亦较低，无法诊断出大多数结核病例，包括半数的肺结核病例、所有儿童结核病、肺外结核病和耐药结核病病例，而随着结核病诊断技术的不断创新和提高，越来越多的工具和方法可用于结核病的诊断，有些手段能快速检测出耐药结核病，大大缩短了既往需要数月才能获得结果的时间，减少了患者治疗延误，并大大减少结核菌的传播。
2004-10-10175903结核病实验室诊断技术进展
6、分子生物学检测技术
⑴核酸探针：用于测定待检菌核酸同源性序列 的标记核酸片断或序列。结核菌和非结核分枝 杆菌的核酸探针有C-DNA探针；全染色体核酸 探针；克隆核酸探针和寡核苷酸探针。主要用 于分离株的快速鉴定（经培养分离得的菌株）， 其特异性与敏感性均达到100％，有助于结核 病的诊断和鉴别诊断。但核酸探针技术存在检 测灵敏度低，在临床技术中有104－105菌体细 胞/ml才能呈现杂交阳性反应。
结核病实验室诊断技术进展
一、细菌学方面
1、
荧光镜检法检查抗酸杆菌：
可提高工作效率；提高检出率
镜检观察视野以60视野为宜，避免造成 假阴性且可提高工作效率3－5倍，荧光 镜检（直接涂片）法优于抗酸镜检（直 接涂片及集菌）法。
2、BACTEC460自动检测系统
利用分枝杆菌在液体培养基中能早 期微量生长的原理，采用放射技术，在 含有14CO2，仪器能自动测定其脉冲数， 即结核菌生长指数以GI表示，当GI达到 50－100时进行涂片抗酸染色证实是否抗 酸杆菌并观察是否呈索状生长。并以 NAP培养基进行结核菌和非结核分枝杆 菌鉴定。
耐药SM菌株中70－85％有核糖体蛋白S12编码基 因核S16γ RNA编码基因突变所致。耐INH株50－ 76.2％的过氧化氢酶－过氧化物酶编码基因突 变有关，12％在烯酸基还原酶基因，16.6％有 烷基过氧化氢酶编码基因突变。72％的耐PZA 菌株有PZA编码基因突变，69％耐EMB结核菌有 阿拉伯糖基转移酶编码基因B突变，89％发生 306位氨基酸密码子。耐奎诺酮类时由DNA回旋 酶A单位核B亚单位基因突变所致，集中在A亚 单位基因的保守区。
与常规方法的符合率为95－100％，但此法存
在放射性环境污染，费用昂贵，不易普及。
浅谈结核病实验诊断技术的新进展
ＴＳ Ｏ ．Ｂ试验是 以特异性抗 原为刺激 源 ， ．Ｐ ＴＴ 应用 酶联免
疫斑点技术诊 断结核感染 的新方法。结核感染后体 内长期存
在抗原特异性 的记忆性 Ｔ细胞 ， 当再次遇到抗原刺激时 ， 能迅 速活化增值 ， 释放 干扰素 。综合上述 原理 ，ａｖｎ 建立了 Ｌｌａｉ 。 以Ｒ Ｉ Ｄ 编码 的结核特异性抗原 ６ｋ Ｄ早期分泌 靶向抗原 （ Ｓ Ｅ— Ａ －） １ Ｋ Ｔ６ 和 ０ ｄ培养滤过蛋 白（ Ｆ 一０ 肽段库为刺激原 ， Ｃ Ｐ１ ） 检测 外周血中结核特异性释放 干 扰素 的 Ｔ淋 巴细胞 ， 从而诊 断 结 核杆菌感染 。其优点 为 ： 实验结 果清晰 ， 于判断。Ｐ ｉ 易 ａ 等 对 近 ３年的 １ ３项研究 进行 Ｍｅ ｔ ａ分析 ， 明 ＴＳ Ｏ —Ｂ的综 表 —Ｐ ＴＴ 合 敏感性为 ９ ％ ， ０ 在免疫力 低下 的人群 中 ， 然能够 维持较 依 高的敏感性 ” 。在肺外结 核 的诊 断中 ，—Ｐ ＴＴ ＴＳ Ｏ —Ｂ也具有较 高的敏感性 。Ｆ ｒ ｒ ｅｒ ａ和 Ｌｅ等报道 的 ２个前 瞻性研究 中 ， ａ ｅ 共 包括 １ ８例 肺 外结 核 患者 ， －Ｐ ＴＴ 阳性率 为 １０ ［９。 Ｔ Ｓ Ｏ —Ｂ ０ ％ ８ｊ ， 同时以 ＴＳ Ｏ —Ｂ为标 准能够 更加准 确地 锁定 需要 预防性 ．Ｐ ＴＴ
酸扩增法。
抗结核治疗 的感染者 。其斑点 数越多 ， 发生活动性 结核 的可
能性越大 ， 时间内斑点数显著增 加 ， 短 则强烈提示体 内结核活 动 ， 时给 予预防性 的治疗 十分必要 。Ｔ Ｓ Ｏ ・Ｂ在 现有结 此 —Ｐ ＴＴ 核诊断方法存在诸多缺陷 的今 天 ， 以给临床 医生 提供有力 可
速、 特异、操作简单 、 无须 昂 贵仪器 等优点 。但 其可 与少数
结核病实验室诊断技术进展
结核病实验室诊断技术进展结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其发病规律和流行特点决定了在今后相当长的时期内其危害将持续存在。
结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。
世界卫生组织的统计资料显示，约三分之一的世界人口曾经感染结核菌，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。
据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。
目前我国三分之一左右的人口已感染了结核菌，受感染人数超过4亿。
据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核病。
我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群；每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。
如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。
历年来全国结核病流行病学调查结果显示，全国肺结核患病率继续呈现下降趋势。
特别是传染性肺结核患病率下降尤为明显，由2000年的122/10万下降到66/10万，十年降幅近50%。
结核分枝杆菌从分类上看是分枝杆菌科、分枝杆菌属中引起人类患病最多的致病菌。
结核病实验室检查，尤其是细菌学检查是结核病诊断的最主要和最基本技术，也是选择治疗方案、考核疗效、评价防治效果的主要指标。
目前结核病实验室检查技术包括：全菌体为基础的病原微生物学检测、细菌核酸为靶标的分子生物学检测和机体免疫相关反应及其产物的检测。
一、全菌体为基础的病原微生物学检查技术与其它传染性疾病相同，从检测原理和临床检验目的上，结核病的病原微生物学检查，分为基于形态学的显微镜镜检、基于微生物表型的分离培养、药物敏感性实验和菌种鉴定实验。
1. 分枝杆菌形态学检查——抗酸染色镜检：是结核病临床诊断最基本的方法之一，简单快速，在不考虑生物安全防护的前提下，２-４小时即可发报告，对于结核病的诊断、指导和评价临床用药具有重要意义。
检验科结核实验室主要存在的问题
检验科结核实验室主要存在的问题第一篇：检验科结核实验室主要存在的问题检验科结核实验室主要存在的问题尊敬的院领导：至从结核病的管理从县疾控中心转到县医院以来，检验科主要负责结核涂片镜检、培养和部分结核耐药监测。
但是由于检验科目前没有单独的结核涂片、检测的实验室，结核的管理一直与微生物室放在一起进行处理，这样管理不符合规范要求，结核传染性较高，对工作人员存在较大的潜在的危害。
因此导致结核的培养和耐药监测目前检测的较少。
目前科室已经向设备科申请购置专用于观察结核涂片的显微镜和购置一台专用于结核培养的CO2培养箱。
争取更好的开展结核的防治工作。
科室安排有专门工作人员（李意刚）负责结核的管理的相关工作。
检验科2017.7.14第二篇：实验室存在问题及建议实验室存在问题及建议一、现状与讲解词要求的差距1、设备差距：需要的设备、估计需投资（800元以上）1)1套港口物流中心仿真模型9万元；2)2台电瓶堆高叉车10万元；3)1套多媒体设备2万元；4)1套GPS设备2万元；5)包装设备若干1万元；6)展板若干2万元；7)装修及配套服务装置费用10万元；需继续投资总额约36万元。
2、实验室人员差距：估计需要技术人员、解决方法建议物流综合实验室目前缺少三个方面的工作人员：自动化设备操作员、电脑操作员、实验室管理员。
具体情况如下：（1）仓储管理区配置是自动智能的机电一体化设备，非常精密，操作难度大，需要专业的技术人员操作。
教师通过短时间的培训很难做到熟练操作，同行的做法是聘请设备供应商的技术人员在实验室工作一段时间，教师陪同学习，直到教师能够熟练操作，大约一个学期。
（2）实验室的物流信息管理区主要是电脑操作，需要一名有计算机专业背景的教师负责。
目前我系没有这样的教师。
（3）实验室需要一名专职管理员，负责实验室的日常管理、设备维护工作。
3、实验室社会服务的差距：需要的外部协助目前我院实验室与外部没有任何交流，需要和山东省知名第三方物流企业、山东省物流与交通协会、国家农产品现代物流工程技术研究中心等社会组织合作共赢，成为他们的培训基地等合作方。
结核病实验室诊断研究现状
结核病实验室诊断研究现状陈鸣【摘要】结核病是单一致病菌感染引起死亡人数最多的疾病,发病率在全球逐年提高.实验室诊断作为最科学、最客观、最重要的方法,在结核病的诊断、治疗和预防中至关重要.本文就目前实验室诊断结核病的方法进行简要回顾.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2012(030)010【总页数】3页(P769-771)【关键词】结核病;分枝杆菌;实验室诊断【作者】陈鸣【作者单位】第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1(本文编辑:许晓蒙，陈维忠)结核病(tuberculosis)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的传染病，也是单一致病菌感染引起死亡人数最多的疾病［1］。
自1882年德国科学家柯霍发现Mtb以来，全球有三分之一的人曾感染Mtb。
据WHO估计，2010年新发结核病880万例，其中13%为人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者，且约有150万人死于结核病［2］。
2010年我国结核病流行病学抽样调查结果显示，结核病年发患者数约为130万，占全球发病的14.3%，居全球第2位［3］。
因此，准确、快速、简便的实验室诊断和及时、有效的治疗至关重要。
实验室检查作为结核病最客观的诊断方法，在结核病的诊断中仍存在种种困难。
(1)Mtb的细胞壁较厚，脂类含量高达60%，营养要求高，营养物质和药物难以进入细胞内，导致培养周期长，检出结果慢;(2)感染Mtb者，只有约5%在1～2年内会发展为活动性结核病，其余则表现为潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)，而目前诊断LTBI还没有统一的标准和方法，检出率较低，漏诊率和误诊率较高;(3)Mtb感染患者多表现为菌阴肺结核，即经痰涂片抗酸染色和痰分离培养分枝杆菌检查均为阴性，由于菌阴肺结核的诊断缺乏“金标准”，诊断困难，极易发生漏诊、误诊，因此，如何准确对菌阴肺结核患者进行诊断和治疗，是函待解决的一个难题;(4)对接种过卡介苗、非Mtb感染、免疫缺陷人群，免疫学诊断方法的临床诊断能力有限。
结核病诊断市场分析报告
结核病诊断市场分析报告1.引言1.1 概述概述：结核病是一种严重的传染病，全球范围内具有较高的发病率和死亡率。
虽然结核病的诊断和治疗技术在过去几十年中取得了一定的进步，但仍然存在诸多挑战，尤其是在一些发展中国家。
本报告旨在对结核病诊断市场进行深入分析，探讨市场现状、发展趋势以及诊断技术的改进建议，以期为相关行业提供有益参考和指导。
1.2 文章结构文章结构部分介绍了整篇文章的组织和内容安排。
首先，我们将对结核病进行概述，包括其流行病学情况和全球范围内的影响。
然后，我们将介绍结核病诊断的技术和方法，包括目前常用的诊断工具和检测方法。
接下来，我们将进行结核病诊断市场现状的分析，探讨市场规模、竞争格局和未来发展趋势。
最后，我们将进行市场发展趋势的预测，并提出诊断技术改进建议，以及对全文进行总结。
整体而言，本报告将全面而系统地分析结核病诊断市场的现状，为相关行业提供有益的市场参考和发展建议。
1.3 目的目的：本报告旨在分析结核病诊断市场的现状，了解目前诊断技术的发展情况，并探讨市场的发展趋势。
通过对市场趋势和诊断技术的改进建议，提供给医疗行业决策者和相关工作人员参考，以促进结核病诊断技术的不断进步和市场的健康发展。
1.4 总结结核病是一种严重的传染病，对全球健康构成了巨大的挑战。
通过本报告，我们深入分析了结核病诊断市场的现状和发展趋势，并对诊断技术提出了改进建议。
结核病诊断市场具有巨大的发展潜力，在未来将会持续增长。
我们呼吁医疗领域的相关机构和企业加强技术创新，提高诊断准确性和效率，以更好地应对结核病的挑战。
期待在不久的将来，结核病的诊断和治疗水平会得到显著提升，为全球公众健康事业做出更大的贡献。
2.正文2.1 结核病概况:结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可影响人体的肺部和其他器官。
结核病在全球范围内广泛传播，尤其是在发展中国家，造成了严重的公共卫生问题。
根据世界卫生组织的数据，全球每年有超过1000万人感染了结核分枝杆菌，其中约有140万人死亡。
结核病的实验室诊断技术及应用
一 个 斑 点 一 个 结 核 效 应 淋 巴 细 胞
=
阳性对照 （PHA）
阴性结果
阳性结果
T-SPOT结果的解读-阳性结果
• 活动性结核病 — 典型结核中毒症状 — 影像学支持 • 潜伏性结核感染 — 无结核中毒症状 — 无其它结核患病证据
— 排除其他诊断
• 陈旧性结核 • MTB感染状态 — 典型结核中毒症状 — 未发现结核患病证据 — 无结核中毒症状 — 既往TB史或明确TB证据 • NTM（四种）感染
产品
•列入欧美25个国家结核诊疗指南
2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、
2010年加拿大结核指南
•美国CDC推荐—卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选
• 国内风湿科和消化科已列入专家共识
14
快速—T-SPOT的实验步骤
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周 血单个核细胞
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激 结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ干扰素
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素 与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体 结合并固定在细胞周围
过夜孵育，洗板，加入酶标二抗
加入显色液，观察结果
1个斑点=1个效应T细胞
15
实验效果图
空白对照
抗原A ESAT-6 抗原B CFP10
γ -干扰素释放实验（IGRAs)
Interferon-Gamma Release Assays
10
结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
ESAT-6 :
CFP10 :
早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）
培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）
结核病的实验室诊断方法及评价
耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核分枝杆菌的实验室检测现状及现代结核病诊断的新特点
结核分枝杆菌的实验室检测现状及现代结核病诊断的新特点【摘要】自1882年德国细菌学家郭霍（Koch）发现结核分枝杆菌（MTB）以来，为促进结核杆菌生长，缩短培养时间，达到提前分离、鉴定的目的，人们对结核杆菌的营养、生理代谢及人工培养进行了一系列的研究，使得结核杆菌的检测技术从最初的涂片镜检、分离培养发展到现在的分子生物学及噬菌体裂解技术水平。
由于分枝杆菌自身结构及遗传性的原因，决定了其营养要求高，生长缓慢的特性，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，不利于早期诊断和治疗，对结核分枝杆菌的快速诊断是应势而需！多种方法的联合应用使结核病诊断呈现出新的特点。
【关键词】结核分枝杆菌；病原学检查；分子生物学；噬菌体【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2787-011 结核分枝杆菌实验室诊断概况1.1病原学诊断1.1.1 染色镜检法1.1.1.1 涂片抗酸染色镜检法该法简便、快速、价廉；但敏感性低，特异性差：所有分枝杆菌均可着色，无法区别死菌与活菌，结果均为阳性。
1.1.1.2荧光染色法在涂片法中阳性率较高，荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达50%；但假阳性率较高，保存时间短，不到4个月。
1.1.1.3液基夹层杯结核杆菌检验该法操作方便，片中结核菌分布均匀，染色效果清晰；液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高；消化，制片，烤片，采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分枝杆菌，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本，更好的提高了操作的安全性。
1.1.1.4液体培养+显微镜观察药敏试验是2000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技术。
能在培养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，能显著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，同时具有较高的敏感性和特异性，痰标本直接药敏试验比常规方法提早6～8周，更具有快速诊断价值.1.1.2培养法1.1.2.1传统培养法如改良罗氏培养法，该法准确，灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验；但诊断周期长，最快也需要6周，有一定的污染率。
结核病的实验室诊断分析
率较高，此技术已趋向淘汰
瓶外检测技术
瓶内检测技术 易导致污染及生物安全问题
15－21天
不详
无药敏试剂提供
只有3种一线药物
BACTEC ? MGIT? 960/320
指示器系统
阴性培养2 O2
CO2 O2 CO2
O2 O2
FFFOOF22OFF2FOO22FFFOO22
? 1882年由德国医生Koch发现。 ? 结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌
纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝 杆菌属。 ? 分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、 非洲型和田鼠型，而人型结核分枝 杆菌是人类主要的致病菌。
2018/6/17
GDTB
8
结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1. 细胞壁中含有大量 脂质 2.引起的疾病都呈慢性， 并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
生长特点：
生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内 约需要15～20小时，在静脉感染未经 免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬 细胞内约需要15～20小时，在家兔角 膜中约需要20～22小时。
实验室检查方法的历史
1880s
1900s 1920s
1930s 1940s 1950s
Tubercle bacilli 的发现 Ziehl-Neelsen 染色方法 Mantoux test (TST with tuberculin) Petragnani medium Purified Protein Derivative （PPD ） Lewenstein-Jensen 培养基 Dubos agar, Ogawa 培养基 Middlebrook 7H9
结核病的实验室诊断
主要内容
1 结核病的流行情况 32 结核病的病原学 3 结核病的实验室诊断 34 结核病的分子药敏
结核病诊断技术的现状与展望
结核病诊断技术的现状与展望
孙菊梅
【期刊名称】《中国医药指南》
【年(卷),期】2011(9)15
【摘要】@@ 1 结核病检测的现状rn结核病是一种古老的传染病.由于结核病的生物学特性和社会因素,使结核病疫情呈全球性回升,引起国际社会的高度重视,世界卫生组织(WHO)已将结核病作为重点控制的传染病之一.据估计,全球约有1/3的人感染结核杆菌,每年有800万新发病例和300万人死亡.结核杆菌多重耐药株的出现及合并HIV感染使得形势变得非常严峻.
【总页数】2页(P214-215)
【作者】孙菊梅
【作者单位】甘肃省卓尼县人民医院,甘肃,卓尼,747600
【正文语种】中文
【中图分类】R52
【相关文献】
1.儿童结核病诊断技术新进展及展望 [J], 刘珍敏;许红梅
2.结核病及其实验诊断技术的应用现状 [J], 吴凤荣
3.牛结核病流行现状与诊断技术研究 [J], 李少晗;崔尚金;秦彤
4.牛结核病流行现状与诊断技术 [J], 李斌
5.结核病实验室诊断技术现状及进展 [J], 李明;李燕;王超;刘跃平
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肺结核病实验室快速诊断进展
肺结核病实验室快速诊断进展
冯雪鸣
【期刊名称】《杭州师范学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2002(023)002
【摘要】@@ 结核病为严重危害人类健康的慢性传染病 80年代中后期出现世界范围内回升特别面临的新情况是艾滋病毒(HIV)与结核分枝杆菌的双重感染者增多[1].为了控制其蔓延实施有效的防治进行早期诊断十分必要.传统的结核杆菌检测一般依赖于细菌学指标其中痰涂片抗酸染色法快速但灵敏度低而今仍被视为"金标准"的罗-琴(L-J)固体培养法虽然灵敏度高于染色法但培养时间至少要8周不能满足临床快速诊断的需要.本文就近年来有关肺结核实验室快速诊断的某些进展作一综述.
【总页数】3页(P41-43)
【作者】冯雪鸣
【作者单位】杭州师范学院医学院微生物免疫教研室浙江杭州 310012
【正文语种】中文
【中图分类】R52
【相关文献】
1.肺结核病的快速实验室诊断 [J], 袁俐;邢建新;杨军;吴万贵;巫志坚;潘景峰;王宏
2.肺结核病实验室快速诊断进展 [J], 冯雪鸣;方平楚
3.第28届国际实验室血液病会议有关血液病实验室诊断进展 [J], 马娟;
4.第28届国际实验室血液病会议有关血液病实验室诊断进展 [J], 马娟
5.涂阴肺结核病的流行现状与诊断进展 [J], 马艳;李亮;成诗明;周林
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100
2013年各省药敏、培养实验开展率
90
80
70
开展药敏（培养）实验室率（%）
60
50
40
30
20
10
0
北京市 天津市 河北省 山西省 内蒙古 辽宁省 吉林省 黑龙江 上海市 江苏省 浙江省 安徽省 福建省 江西省 山东省 河南省 湖北省 湖南省 广东省 广 西 海南省 重庆市 四川省 贵州省 云南省 西 藏 陕西省 甘肃省 青海省 宁 夏 新 疆 兵 团 0 82 27 50 50 78 38 8 0 10 10 81 33 36 88 89 10 14 77 50 0 0 57 10 10 0 0 40 21 13 40 86 40 22 2 23 77 7 0
3、我国结核病实验室诊断现状
• 我国结核病实验室诊断体系已经建立多年，总体 上由三部分组成 • 第一，国家、省、地市和县级结核病控制体系中 的实验室，对结核病控制工作做出了重要贡献， 在体系中地市、县结核病实验室（包括近两年出 现的定点医院实验室）当前以涂片镜检为主要技 术手段，部分县市开展了培养，部分地市开展了 药敏和分子生物学快速诊断技术
三、结核病实验室诊断现状
• 1、发达国家的结核病实验室诊断现状 涂片常规镜检、分离培养和药物敏感性试验仍然 是大多数发达国家临床实验室诊断技术的主流 与此同时一些快速诊断技术如基于液体培养的方 法、核酸杂交、16s核糖体基因的测序、应用HPLc 对细胞壁脂质(分枝菌酸)的分析、核酸扩增检测（ NAAT)，以及荧光原位杂交和噬菌体生物扩增技术 等方法也成为他们的常规方法 免疫学检测方法也取得不错的结果，特别是γ干扰 素释放试验在发达国家得到了较广泛的应用 测序技术在药敏检测中得到应用
对实验室的要求
• 在发达国家，由于结核病疫情低，具有特征性的 持续咳嗽、发热等症状已经不再是疑似结核病的 可疑症状，在这些国家需要： • 能够在高危险人群中确定潜伏性感染的方法 • 能够替代x线光片和痰涂片来发现移民和其他高感 染风险人群中活动性结核病的措施 • 能够替代传统培养方法的早期诊断手段 • 能够快速便捷的区别医源性感染和社区获得性感 染的指纹分析手段 • 能代替生化方法来进行菌种鉴定的新技术。
地市级药敏试验开展率(%) 0
县区级培养实验开展率(%) 10 10 21
20 28 48 20 10 10 10 59 42 18 77 35 85 20 35 51 90 43 50 19 10
新型检测技术应用情况-1
设备配备情况
设备名称 LED 全球基金项目 中盖结核病项 中盖结核病项 目一期 目二期 我省情况 30个省89个地市 3个省4个地市 4个省4个地市 908个县区1027台 6个县区14台 25个县区46台 30个省89个地市 125台（NTRL1 台） 无 30个省89个地市 865个县区934台 4个省4个地市 4台 2个省2个地市 5台（NTRL1 台）
患者发现
• 2012年全省结防机构登记活动性肺结核患 者47334例，登记率82.70/10万，涂阳患者 21339例（占45.08%，登记率为37.28/10万 ），涂阴患者25731例（占54.36%），未查 痰,12例（占0.03%），结核性胸膜炎252例 （占0.53%），与2011年相比涂阳减少4812 例，涂阴增加5427例 • 2012年湖北省登记耐多药肺结核患者210 例
对实验室的要求
• 在发展中国家，尤其是结核病高负担国家，结核病暴露史 已经很难进行确定和评估，一些免疫学方法也在实验室诊 断中起着一定的作用，如血清学方法，但是，广泛的卡介 苗(BcG)接种和HIV感染影响了一些血清学方法的特异性。 对于寻找快速、可信、简便的方法来替代现行的涂片显微 镜检查的需求不很迫切，这些国家的需要倾向于： • 较传统培养方法更敏感、快速、简便的手段来诊断涂阴肺 结核和无症状的结核病患者 • 在耐药结核病高流行国家需要快速、可靠、廉价的方法来 发现耐药结核病患者 • 在HIV感染者中简便的筛查结核病患者的方法
说
明
• WHO在“201 1年全球结核病控制报告”中对该试 剂的评估结论为：单次XpertMTB／RIF检测可检出 99％的涂片阳性(简称涂阳)和>80％的涂片阴性(简 称涂阴)肺结核病患者。但有文献报道，单次 XpertMTB／RIF检测涂阴培阳样本的检出率分别为 72．5％和76．9％。由于涂阴患者包括涂阴培阳 、涂阴和培养阴性(简称培阴)两种类型，而涂阴培 阴患者的检出率必然低于涂阴培阳患者，因此， 该报告中XpeftMTB／RIF的MTB涂片阴性患者阳性 检出率较实际值偏高
结核病实验室诊断现状
主要内容
• • • • • • 一、患者发现 二、结核病控制对实验室的要求 三、结核病实验室诊断现状 四、结核病实验室存在的问题 五、结核实验室诊断的主要难题 六、十二五结核病实验室建设
结核病难上加难！
发现难 传染/传播性强 呼吸道 飞沫传播 1人-10-15人
症状隐匿/多样
全覆盖 省本级及4地市共5 台 省本级及4地市共6 台 省级及全球基金项 目县共39台
Hain Genechip GeneXpert
4个省4个地市 1个省1个地市 4台 3台 2个省3个地市 4个县区 尚未采购
新型检测技术应用情况-2
• 设备配备情况 – 其他
• 达米恩项目：为贵州贵阳、青海西宁地市级及所辖 县区配备LED荧光显微镜
对实验室的要求
• 当前，抗酸菌涂片镜检、结核分枝杆菌分 离培养和药物敏感性试验等常规方法仍然 是发达国家和发展中国家细菌学诊断的主 要方法，它不仅是发现传染源的最主要手 段，也是确诊结核病、选择治疗方案、考 核疗效以及评价防治效果的可靠指标
对实验室的要求
• 目前的常规实验室方法虽各有长短，但总 体上仍不能满足结核病诊断的要求。快速 、准确、简便和低廉的实验室诊断技术一 直是人们不知疲倦追求的目标。特别是， 近年来人们将控制潜伏性感染或是临床前 期感染作为控制结核病的早期策略之一， 这些对实验室工作提出了较高的要求
二、结核病控制对实验室的要求
• 结核病正确诊断是发现、治疗和管理结核 病患者的基础。实验室诊断起着重要的作 用，特别是细菌学诊断 • WHO1995年把DOTS策略作为全球结核病控 制策略，肺结核症状可疑者使用痰涂片检 查发现传染性患者是DOTS策略5要素之一 • 2005年提出的遏制结核病策略，仍然将采 用细菌学方法发现患者作为要素之一，并 提出协作研发新型诊断技术
患者发现
• 据WHO估算，每年新发MDR-TB患者50万，XDR-TB 5万，目前检测到的耐多药结核病病例仅占全球负 担的5%，广泛耐药结核病（XDR-TB）则更低 • 依据我国第5次结核病流行病学调查结果。我国结 核病患者中涂阳患者占14．4％(118／1310)，菌 阳(涂阳或培阳)患者占26．5％(347／1310)，菌阴 患者占73．5％(963／1310) • 根据07-08耐药监测结果估算，我国每年新发 MDR-TB患者12.1万，XDR-TB 1万 • 提示虽然实验室发现了大量患者，但诊断技术与 能力仍然缺乏
Xpert MTB/RIF
• • • • 检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药 直接标本检测 100分钟可获得结果
WHO关于Xpert MTB/RIF的建议
• Xpert MTB/RIF 应该用于怀疑MDRTB的病人、以及HIV合并结核的病 人的最初诊断（强烈推荐）
• Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不 十分严重的地区，可以考虑作为 显微镜检查基础之上的后续检测， 特别是用于涂阴标本的进一步检 测（根据具体情况推荐，需考虑 当地的资源）
临床诊断
临床诊断难度加大
一、患者发现
2012年全国结防机构登记活动性肺结核患者 894199例，登记率66.37/10万，涂阳患者 358149例（占40.05%，登记率为26.58/10 万），涂阴患者508620例（占56.88%）未 查痰2073例（占0.23%），结核性胸膜炎 25357例（占2.84%），与2011年相比涂阳 减少65681例，涂阴增加53960例 2012年登记的耐多药肺结核患者共2731例
•
• •
1、发达国家的结核病实验室诊断现状
• 基因分型技术在发达国家被广泛使用，主要方法 有：限制性酶切片段长度多态性(IS6110一RFLP)、 数目可变的串联重复序列(VNTR)、分枝杆菌散在 重复单位分型(MIRU)、间隔区寡核苷酸分型 (Spoligotyping)，单核苷酸多态性分析(SNPS)、长 片段多态性(LSP)以及缺失图谱等方法 • 在一定条件下可以追溯和确定传染源，鉴别未知 传播，发现和鉴别培养的假阳性
宜昌市
汉中市
Hain组合方案： 县级采用 LED+ 胸片 + 临床检查的方案进行诊断；地市级对涂阳的 痰标本开展Hain耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐 药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛 耐药性。
关于Hain和基因芯片的建议
• • • • • • 适用于地区及以上级实验室 仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测 操作需要至少有3个独立的实验室以避免交叉污染 仅能检测MDR，XDR的检测仍需要依靠传统药敏试验 可以独立作为MDR的诊断工具 对于MDR病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养） 检测治疗效果（培养阴转） • 临床报告必须取得省级临床检验中心颁发的《临床基因 扩增实验室》许可证 • 建议的覆盖面: 每50－100万人口至少需要1个LPA实验 室或基因芯片实验室，就我国目前实际情况100万人口 地市的级建立一个相应实验室是可行的
2、发展中国家结核病实验室诊断现状
• 从全球来看，结核病的高负担国家主要集中在发展中国家 ，由于经济发展程度所限，已经被使用了百余年的痰涂片 显微镜检查技术和分离培养技术仍然是发展中国家结核病 实验室诊断体系中所采用的主要方法 • 尽管痰涂片显微镜检查在HIV高流行地区其灵敏度不是很 高，但是其简便、价廉并能够检测出传播意义更为重要的 排菌患者 • wHO在发展中国家仍然推荐使用涂片镜检作为结核病控制 规划中患者发现的基本手段，在这些国家，只是在少数地 区的实验室能开展分离培养和药物敏感性试验等