沉淀反应与凝集反应

1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后 制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后 观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。
3. 影响因素：
琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则; 电泳终点时间的确定; 标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形; IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化）， 抵消了电渗作用。
二）技术要点：
制备琼脂板，打孔，加样于孔内，电泳2～3mA/cm ， 0.5～1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。
三）影响因素
① 抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比; ② 抗血清的抗体谱，混合抗血清的使用; ③ 电泳条件直接影响分辨率。
四）应用
纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋的 识别与鉴定
对流免疫电泳
通电
蛋白质抗原常 带较强的负电 荷，在电场中 向正极移动 抗体球蛋白 带负电荷较少， 籍电渗作用向 负极泳动
－
＋
对流免疫电泳
结果分析：
• 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。 • 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合。 • 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
2.沉淀反应分两个阶段
第一阶段：
抗原抗体特异性结合，快速但不可见。
第二阶段：
形成肉眼可见的大的免疫复合物。
3.沉淀反应的类型
①液体内沉 淀试验 •免疫 浊度测 定 •絮状 沉淀试 验
②凝胶内沉 淀试验
③凝胶免疫 电泳技术
•对流免疫电泳 •火箭免疫电泳 •免疫电泳 •免疫固定电泳
•单向 扩散试 验 •双向 扩散试 验
•对新生儿溶血性贫血性疾病的诊断；
•对溶血性贫血的研究； •对细菌或立克次体的不完全抗体检查。
第二部分
第一节
沉 淀 反 应
沉淀反应的特点
第二节
第三节 第四节
液体内沉淀试验
凝胶内沉淀试验 免疫电泳技术
第一节
沉淀反应原理及特点
1.沉淀反应（precipitation）:
是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发 生特异性结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的 抗原抗体反应相同。℃
24～48h观察沉淀环
影响因素：
－抗体质量 －标准曲线 ，质控血清 －结果与真实含量不符 －双环现象（不同扩散率抗原性相同的两个组分）
上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排 右2为异常病理血清
2、双向扩散试验 （平板法）
原理：
将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在 凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。鉴定抗 原抗体的最基本、最常见的方法之一
+
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
三、免疫电泳
一）原理：
区带电泳＋双向扩散。 1、蛋白质抗原在电场中，由于迁移率（取决于其分子量的 大小和所带净电荷的多少）不同，其泳动速度不同，将复合 蛋白质在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带。 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进 行双向扩散 。
•应用：
测定相应抗体的效价；可作临床诊断或流行病学调查。
试管凝集试验
根据凝集程度记录为：＋＋＋＋（100％凝集）、＋＋ ＋（75％凝集）、＋＋（50％凝集）、＋（25％凝集）。以 出现50％凝集以上的血清最大稀释度为该血清的凝集效价。
第三节
间接凝集反应
间接凝集反应(indirect agglutination):
二、间接血凝试验
1/2 1/4
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos.
Neg.
Patient
8 6 4 1
7
5
2
3 1/8
反向间接血凝试验
<2
128 32
512
32
64
Titer
4
8
血凝试验强度
三、胶乳凝集试验
将待检血清或抗原和致敏乳胶各滴一滴在玻片上，阳 性者5～10min即出现凝集。如妊娠免疫诊：
反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗 原，也可用于检测各种蛋白质成分。
二）抗体的检测
检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。
第四节
自身红细胞凝集试验
未经致敏的受检者新鲜红细胞
试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体
临床应用：HIV检测、HBV检测
自身红细胞凝集试验
第五节
抗球蛋白试验
抗球蛋白试验 又称 Coombs试验
第四节 免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
抗原抗体反应 的高度特异性 电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳。
特异性强，效价高，亲和力强。
③抗原抗体反应液的最适PH:
为6.5～8.5
第三节
凝胶内沉淀试验
一、原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度 梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成 肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰 胺凝胶。
二、方法
1、单向扩散试验 （平板法） 原理：
第二节
液体内沉淀试验
一、 絮状沉淀试验
絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质 存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉 淀物。
方法受抗原抗体比例的影响非常明显 应用于测定抗原抗体反应的最适比例 三种类型：
① 抗原稀释法：抗原最适比例
② 抗体稀释法：抗体最适比例 ③ 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
最适比例方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照 — — —
1/5
+
+ +
+ + +
+ + +
+ +
+
±
1/10
+
+ +
+ +
+ +
+ + +
+ +
+
1/20
+
+ +
+ +
+ +
+ + +
+ +
+
1/40
—
—
±
—
+
—
+
—
+ +
（一）直接Coombs试验
检测红细胞上抗体或不完全抗体
单价抗体只能与一方抗原的抗原决定簇结合，不产生凝 集反应，当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连接一方抗 原决定簇的单价抗体连接起来，出现凝集现象。
（二）间接Coombs试验
检测血清中的抗红细胞抗体
临床应用：
•在输血上的应用； •血型抗原抗体的检查；
将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面， 然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用 下，出现肉眼可见的凝集现象。
一、间接凝集反应的类型
1.正向间接凝集试验 2.反向间接凝集试验 3.间接凝集抑制试验 4.协同凝集试验
1.正向间接凝集试验
用抗原致敏载体--检测抗体
2.反向间接凝集试验
用抗体致敏载体----检测抗原
第十章
沉淀反应与凝集反应
第一部分 第二部分 凝集反应 沉淀反应
第一部分
凝集反应
第一节 凝集反应的特点 第二节 直接凝集反应
第三节 间接凝集反应
第四节 自身红细胞凝集试验
第五节 抗球蛋白试验
第一节
凝集反应的特点
一、凝集反应定义
细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗
原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致 敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性 反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集 现象。参与凝集反应的抗体有IgM和IgG,IgM的凝集 作用比IgG大数百倍。
3.间接凝集抑制试验
用抗原致敏载体--检测抗原
4.协同凝集试验
协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似，但所用载 体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一 种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与 IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接 时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出 现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检 测。
思考题
1. 2. 3. 4. 什么是沉淀反应？ 沉淀反应的特点？ 单向扩散试验的原理和应用？ 什么叫直接凝集反应，什么叫间接凝 集反应？它们之间有何异同？ 5. 叙述间接血凝试验的原理。
二、火箭免疫电泳
1.原理：
单向免疫扩散＋电泳，定量检测技术
电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极 泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来 越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形 成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固 定时，峰的高度与抗原量呈正相关。
2. 技术要点：
技术要点：
平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔， 孔径为3mm，孔间距在3～5 mm之间，在相对的孔中加入抗 原或抗体，放置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周围是否出 现沉淀环。