高效液相色谱D讲义教材
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第二十章 高效液相色谱(0512)课件
四、检测器
检测器是液相色谱仪的三大关键部 件之一。对检测器的要求是，灵敏度高 、重复性好、线性范围宽、死体积小以 及对温度和流量的变化不敏感等。
检测器的分类
在液相色谱中，有两种类型的检测器 ，一类是溶质性检测器，它仅对被分离 组分的物理或物理化学特性有响应。属 于这类的检测器有紫外、荧光、电化学 检测器等。另一类是总体检测器，它对 试样和洗脱液总的物理或化学性质有响 应。属于这类的检测器有示差折光检测 器等。
输液泵
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流 泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定 性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质 的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要 依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两 大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞 往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
直接紫外检测： 所使用的流动相为在检测 波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接 测定被测组分的紫外吸收强度。
间接紫外检测： 使用具有紫外吸收的溶液 作流动相，间接检测无紫外吸收的组分 。
柱后衍生化光度检测： 对于那些可以与显 色剂反应生成有色配合物的组分，可以 在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适 的显色剂反应，在可见光区检测生成的 有色配合物。
紫外-可见光检测器
原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分 对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组 分浓度成正比。
UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有 很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度 、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所 以还能用于梯度淋洗。
用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度 ，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检 测波长。
高效液相色谱法指导培训讲义
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
高效液相色谱法教学课件 全共169页
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
谢谢！
高效液相色谱法教学课件 全
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
第十四章高效液相色谱法讲课文档
3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
2299
第二十九页，共57页。
流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并 参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的 分离度。对流动相溶剂的要求是：
1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证 柱的稳定性和分离的重现性。
检测能力还可以提高一个数量级以上；
⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析 时间，提高了分离效果； ⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。
2266
第二十六页，共57页。
附属系统
• 脱气
• 梯度淋洗
• 预饱和柱和预柱 • 恒温 • 自动进样 • 馏分收集 • 数据处理
1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯 垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱 。
2244
第二十四页，共57页。
蒸发光散射检测器
(Evaporation Light Scattering Detector, ELSD)
1.色谱柱出口; 2.液压释放口; 3.氮气入口; 4.雾化器; 5.加热漂移管; 6.样品液滴; 7.激光光源; 8.排气口; 9.光电检测器; 10.放大器;
1122
第十二页，共57页。
高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱 、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去
溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有 与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱 ，延长使用寿命。
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第二十九页，共57页。
流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并 参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的 分离度。对流动相溶剂的要求是：
1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证 柱的稳定性和分离的重现性。
检测能力还可以提高一个数量级以上；
⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析 时间，提高了分离效果； ⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。
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第二十六页，共57页。
附属系统
• 脱气
• 梯度淋洗
• 预饱和柱和预柱 • 恒温 • 自动进样 • 馏分收集 • 数据处理
1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯 垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱 。
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第二十四页，共57页。
蒸发光散射检测器
(Evaporation Light Scattering Detector, ELSD)
1.色谱柱出口; 2.液压释放口; 3.氮气入口; 4.雾化器; 5.加热漂移管; 6.样品液滴; 7.激光光源; 8.排气口; 9.光电检测器; 10.放大器;
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第十二页，共57页。
高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱 、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去
溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有 与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱 ，延长使用寿命。
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《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
中国药典 高效液相色谱讲义
26
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
高效液相色谱讲义共74页文档
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
高效液相色谱讲义
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
高效液相色谱讲义
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
第十一章高效液相色谱法教材
➢ 高速：采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快。 只需数分钟； 而经典方法靠重力加料，完成一次分析需数 小时；
➢ 高效：柱填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀，传质 阻力小，因而柱效高，数分钟完成数百物质的分离；
➢ 高灵敏度：紫外检测器最小检测量 10-9g，荧光检测器灵
敏度可达10-11g。
操作条件：室温、高压。
11.3 HPLC的分类与基本原理
14.3.1高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC 液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
7
一、液液分配色谱法（LLC） 二、液固吸附色谱法（LSC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子对色谱法 五、离子色谱法
内梯度: 2台高压泵, 每台泵输送一种溶剂，配比由设定的程序控制。多种 溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室，混合后进入柱系统。
34
35
3．进样系统
手动进样
36
自动进样器进样
自动进样的样品量可连续调节，进样重复性 高，适合做大量样品分析。
37
4. 分离系统——色谱柱
➢ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。
激发波长(ex)和发射波长(em)的
选择；如菲、芘和苯并a芘的激发波长
：280、333 和365 nm；发射波长
350、390和410 nm
44
11.6 高效液相色谱的应用
➢ 在食品研究中的分析应用
食品中的天然成分
✓ 碳水化合物
✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
✓ 脂肪酸和有机酸
➢ 高效：柱填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀，传质 阻力小，因而柱效高，数分钟完成数百物质的分离；
➢ 高灵敏度：紫外检测器最小检测量 10-9g，荧光检测器灵
敏度可达10-11g。
操作条件：室温、高压。
11.3 HPLC的分类与基本原理
14.3.1高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC 液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
7
一、液液分配色谱法（LLC） 二、液固吸附色谱法（LSC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子对色谱法 五、离子色谱法
内梯度: 2台高压泵, 每台泵输送一种溶剂，配比由设定的程序控制。多种 溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室，混合后进入柱系统。
34
35
3．进样系统
手动进样
36
自动进样器进样
自动进样的样品量可连续调节，进样重复性 高，适合做大量样品分析。
37
4. 分离系统——色谱柱
➢ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。
激发波长(ex)和发射波长(em)的
选择；如菲、芘和苯并a芘的激发波长
：280、333 和365 nm；发射波长
350、390和410 nm
44
11.6 高效液相色谱的应用
➢ 在食品研究中的分析应用
食品中的天然成分
✓ 碳水化合物
✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
✓ 脂肪酸和有机酸
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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(5) 低粘度。
四、高效液相色谱法的主要类型及选择
（－）液一液分配色谱法（LLPC）
流动相和固定相：液体。
样品类型：极性的和非极性的，
水溶性和油溶性的， 离子型的和非离子型的各类化合物。
1．分离原理 原理：液液萃取相同。
2固定相 类型：固定相选择较简单。
例如：强极性β，β′一氧二丙睛， 中等极性的聚乙二醇， 非极性的角鲨烷等。
三维色谱能提供更多全面的信息。
（2）荧光检测法
在HPLC种仅次于紫外检测器。 灵敏度高。 最小 检测限比紫外低一个数量级。 选择性好，优于紫外。 但应用没有紫外广泛。 可以衍生化反应
工作原理
光致发光现象
（3）电化学检测法
利用电化学固有的灵敏度
线性范围106， 高灵敏度 10-12g，可与荧光相比， 具很强的专属性。
但，中断色谱信息，不方便。
e光电二极管陈列紫外检测器
DAD 1976年开始报道 可获得“在流”色谱的全部光谱信息， 即不必停留。可能随色谱峰扫描。 与其他快速扫描检测器相比：
结构简单；工作可靠；性能好。
光路特点
工作原理
核 心 ： 二 极 管 阵 列 元 件 是 一 般 由 200~1024 个 组 成
理论基础
法拉第第一定律 在电介过程中，电极上起反应的物质量
（W）与通过电介池的电量（Q）成正比。
法拉第第二定律 各种不同的电介质溶液中，通过相同的电量
时，电极上析出的电极产物的当量数相同。 （96487库仑）
电化学检测种类
电流检测器 安培检测器，应用最为广泛的一种。 组成：工作电极，参考电极，辅助电极
光波范围：200~600mm 每只分辨率为1~2nm 光点管越多， 分辩率越高 如使用211个二极管陈列元件，最快时10ms可是
成一次测量。 因而每秒可收集20000多个数据 可以得到三维图。
应用
色谱峰纯度检查。 比较光谱法、吸收比法。
色谱峰鉴定 与标准品或标准光谱比较 正常紫外光谱的比较 导数紫外光谱的比较
2．全多孔型固定相
它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。
特性： 这类固定相由于颗粒很细（5～10μm）， 孔较浅，传质快， 易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
（二）流动相
正确选择流动相直接影响组分的分离度。
对流动相溶剂的要求是：
（1）溶剂对于样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。 （3）高纯度。 （4）化学稳定性好。
温度、梯度、电解质。
（6）蒸发光散射检测器：ELSD
样品雾化 干燥 细颗粒 激光照射 散射
（7）常用检测器的比较
表
类型 线性
最小检出量 （g/ml）
能否梯度
对流速 对温度
紫外 选
示差 通
2.4×104 104
10-10
10-7
能
不能
不
不
不
敏
荧光 选 103 10-11
能 不 不
安培 选 104 10-9
分离机理
双保留机理，以下共同贡献： 疏溶剂作用 亲硅醇基效应
4.正相键合相色谱法
固定相： 极性的有机基团，CN、NH2等键合在硅胶表面。
流动相： 非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极
性溶剂（如氯仿、醇等）。
流出程序：极性大，后出；极性小，先出。
样品对象： 分离极性化合物。 异构体。 特别适用于分离不同类型的化合物。
3 分离系统——色谱柱
色谱柱:柱管与固定相两部分。 柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较 多。 柱长5～30cm， 内径为4～5mm（4.6mm,5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm，
预柱。
粒度（＜20μm） 填充法:匀浆填充法，
4．检测系统
有两种基本类型的检测器。
不能 敏 敏
ELSD 通 104 1酮提取物标准
银杏总黄酮 银杏总内酯 白果酸
三、高效液相色谱的固定相和流动相
（－）固定相
分类： 以承受高压能力来分类 刚性固体 、硬胶。
刚性固体：以二氧化硅为基质。
硬胶：它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中。
优点：高速、 高效、 高灵敏度、 高自动化。
二、 高效液相色谱仪
主要结构： 高压输液系统， 进样系统， 分离系统 检测系统。
辅助装置： 如梯度淋洗， 自动进样 数据处理等。
1．高压输液系统
部件组成： 储液罐， 高压输液泵（核心）， 过滤器， 压力脉动阻尼器
⑴储液罐
化学惰性
低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法
不能用酸、碱度过大或存在氧化剂的溶液作流动相的体系。
（三）液一固吸附色谱法(LSAC)
固定相： 固体吸附剂。
1．分离原理 吸附:
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,
Kad = Kad为吸附平衡常数， Kad值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。
分离机理
疏溶剂作用理论。
非极性的烷基键合相
“分子毛”，
“分子毛”有较强的疏水特性。
被分离物质分为：非极性部分与极性部分。
一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏 水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；
这种缔合作用是可逆的。
而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。
一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应，属于这类检测器 的有紫外、荧光、电化学检测器等。
另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测 器的有示差折光，电导检测器等。现将常 用的检测器介绍如下:
（l）紫外检测器
最常用：80%的化合物有紫外吸收 应用最早，最广 灵敏度高 对环境温度及流速波动不敏感 可适用于梯度洗脱
≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20
特性：传质特性好,但易水解且受热不稳 定，仅适用于不含水或醇的流动相。
（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下
特性： 共价键健合固定相不易水解， 并且热稳定较硅酸酯好。 缺点是反应不方便； 当使用水溶液时，必须限制PH在4～8范围内。
（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下：
原理：比尔定律
A、紫外检测器的分类与特点
单波长式 多波长式 紫外/可见分光式 光电二极管阵列快速扫描式
a单波长紫外检测器
1如紫外—254检测器 光源： 低压录灯 254nm 80~85% 检测池：样品池小于10ul
光路长：10mm 参比池：空气 光电接收元件：光电倍增管
光电管 光敏电阻
b多波长紫外检测器
光路：与单波长紫外吸收检测器一致， 但：光源是氘灯或氢灯
波长：200~400nm， 灵敏度：比254nm紫外检测器要低。
c紫外—可见分光式检测器
是装有流通池的紫外—可见分光光度计， 光源：氘灯和钨灯
d扫描型可变波长紫外检测器
在色谱流停止工作的情况下，记录样品池 中洗脱组分的吸收行为，
既可提供色谱图，又可提供光谱图；既可 定量，又可定性分析。
1．键合固定相类型
载体： 硅胶。 (Si一OH)与有机分可成键, 一般可分三类
（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等
（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐； 作为阳离子交换 基团的磺酸等.
2．键合固定相的制备
（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相。 用醇与硅醇基发生酯化反应：
流失问题： 化学键合固定相。 重大突破。应用最广泛。 3/4以上的分离是在化学键合固定 相上进行的。
3．流动相 基本要求：
尽可能不与固定相互溶， 流动相与固定相的极性差别越显著越好
正相分配色谱：
流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。 极性小的先流出，极性大的后流出。
反相分配色谱：
第四章 高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、概述 20世纪60年代末70年代初
理论：气相色谱的理论 技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器
因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
氧化铝 （ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。
(四）离子交换色谱法（IEC）
离子交换原理和液相色谱技术的结合
样品对象： 离子型化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 因此，应用范围较广。
1．离子交换原理
待测离子对固定相（离子交换树脂）亲和力的差别来实现分离的。
阳离子交换：
阴离子交换：
一般形式： R一A＋B ＝ R－B＋A
⑵高压输液泵
、①要求： 流量稳定，无脉动 输出压力高 流量范围宽 耐酸，碱缓冲液腐蚀 泵体易于清洗：具有梯度洗脱功能，
②高压输液泵的分类
液压隔膜泵 气动放大泵 注射泵 往复柱塞泵
A、液压隔膜泵
B、气动放大泵
C、注射泵
D、往复柱塞泵
往复泵的优点： 液缸容积小，易于情况，更换系统，
特别适合于梯度淋洗，广泛应用于 HPLC，但：有脉动，
达平衡时，平衡常数（离子交换反应的选 择系数）：
KB/A = [A][B]r/[B][A]r，
D、往复柱塞泵
克服脉动办法： ①采用多头泵交替联动 ②压力脉动阻滞器 ③改进驱动凸轮的几何形状
WATERS泵的特点、泵体、脉动阻滞器、 驱动凸轮。
⑶梯度洗脱装量
四、高效液相色谱法的主要类型及选择
（－）液一液分配色谱法（LLPC）
流动相和固定相：液体。
样品类型：极性的和非极性的，
水溶性和油溶性的， 离子型的和非离子型的各类化合物。
1．分离原理 原理：液液萃取相同。
2固定相 类型：固定相选择较简单。
例如：强极性β，β′一氧二丙睛， 中等极性的聚乙二醇， 非极性的角鲨烷等。
三维色谱能提供更多全面的信息。
（2）荧光检测法
在HPLC种仅次于紫外检测器。 灵敏度高。 最小 检测限比紫外低一个数量级。 选择性好，优于紫外。 但应用没有紫外广泛。 可以衍生化反应
工作原理
光致发光现象
（3）电化学检测法
利用电化学固有的灵敏度
线性范围106， 高灵敏度 10-12g，可与荧光相比， 具很强的专属性。
但，中断色谱信息，不方便。
e光电二极管陈列紫外检测器
DAD 1976年开始报道 可获得“在流”色谱的全部光谱信息， 即不必停留。可能随色谱峰扫描。 与其他快速扫描检测器相比：
结构简单；工作可靠；性能好。
光路特点
工作原理
核 心 ： 二 极 管 阵 列 元 件 是 一 般 由 200~1024 个 组 成
理论基础
法拉第第一定律 在电介过程中，电极上起反应的物质量
（W）与通过电介池的电量（Q）成正比。
法拉第第二定律 各种不同的电介质溶液中，通过相同的电量
时，电极上析出的电极产物的当量数相同。 （96487库仑）
电化学检测种类
电流检测器 安培检测器，应用最为广泛的一种。 组成：工作电极，参考电极，辅助电极
光波范围：200~600mm 每只分辨率为1~2nm 光点管越多， 分辩率越高 如使用211个二极管陈列元件，最快时10ms可是
成一次测量。 因而每秒可收集20000多个数据 可以得到三维图。
应用
色谱峰纯度检查。 比较光谱法、吸收比法。
色谱峰鉴定 与标准品或标准光谱比较 正常紫外光谱的比较 导数紫外光谱的比较
2．全多孔型固定相
它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。
特性： 这类固定相由于颗粒很细（5～10μm）， 孔较浅，传质快， 易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
（二）流动相
正确选择流动相直接影响组分的分离度。
对流动相溶剂的要求是：
（1）溶剂对于样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。 （3）高纯度。 （4）化学稳定性好。
温度、梯度、电解质。
（6）蒸发光散射检测器：ELSD
样品雾化 干燥 细颗粒 激光照射 散射
（7）常用检测器的比较
表
类型 线性
最小检出量 （g/ml）
能否梯度
对流速 对温度
紫外 选
示差 通
2.4×104 104
10-10
10-7
能
不能
不
不
不
敏
荧光 选 103 10-11
能 不 不
安培 选 104 10-9
分离机理
双保留机理，以下共同贡献： 疏溶剂作用 亲硅醇基效应
4.正相键合相色谱法
固定相： 极性的有机基团，CN、NH2等键合在硅胶表面。
流动相： 非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极
性溶剂（如氯仿、醇等）。
流出程序：极性大，后出；极性小，先出。
样品对象： 分离极性化合物。 异构体。 特别适用于分离不同类型的化合物。
3 分离系统——色谱柱
色谱柱:柱管与固定相两部分。 柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较 多。 柱长5～30cm， 内径为4～5mm（4.6mm,5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm，
预柱。
粒度（＜20μm） 填充法:匀浆填充法，
4．检测系统
有两种基本类型的检测器。
不能 敏 敏
ELSD 通 104 1酮提取物标准
银杏总黄酮 银杏总内酯 白果酸
三、高效液相色谱的固定相和流动相
（－）固定相
分类： 以承受高压能力来分类 刚性固体 、硬胶。
刚性固体：以二氧化硅为基质。
硬胶：它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中。
优点：高速、 高效、 高灵敏度、 高自动化。
二、 高效液相色谱仪
主要结构： 高压输液系统， 进样系统， 分离系统 检测系统。
辅助装置： 如梯度淋洗， 自动进样 数据处理等。
1．高压输液系统
部件组成： 储液罐， 高压输液泵（核心）， 过滤器， 压力脉动阻尼器
⑴储液罐
化学惰性
低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法
不能用酸、碱度过大或存在氧化剂的溶液作流动相的体系。
（三）液一固吸附色谱法(LSAC)
固定相： 固体吸附剂。
1．分离原理 吸附:
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,
Kad = Kad为吸附平衡常数， Kad值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。
分离机理
疏溶剂作用理论。
非极性的烷基键合相
“分子毛”，
“分子毛”有较强的疏水特性。
被分离物质分为：非极性部分与极性部分。
一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏 水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；
这种缔合作用是可逆的。
而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。
一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应，属于这类检测器 的有紫外、荧光、电化学检测器等。
另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测 器的有示差折光，电导检测器等。现将常 用的检测器介绍如下:
（l）紫外检测器
最常用：80%的化合物有紫外吸收 应用最早，最广 灵敏度高 对环境温度及流速波动不敏感 可适用于梯度洗脱
≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20
特性：传质特性好,但易水解且受热不稳 定，仅适用于不含水或醇的流动相。
（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下
特性： 共价键健合固定相不易水解， 并且热稳定较硅酸酯好。 缺点是反应不方便； 当使用水溶液时，必须限制PH在4～8范围内。
（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下：
原理：比尔定律
A、紫外检测器的分类与特点
单波长式 多波长式 紫外/可见分光式 光电二极管阵列快速扫描式
a单波长紫外检测器
1如紫外—254检测器 光源： 低压录灯 254nm 80~85% 检测池：样品池小于10ul
光路长：10mm 参比池：空气 光电接收元件：光电倍增管
光电管 光敏电阻
b多波长紫外检测器
光路：与单波长紫外吸收检测器一致， 但：光源是氘灯或氢灯
波长：200~400nm， 灵敏度：比254nm紫外检测器要低。
c紫外—可见分光式检测器
是装有流通池的紫外—可见分光光度计， 光源：氘灯和钨灯
d扫描型可变波长紫外检测器
在色谱流停止工作的情况下，记录样品池 中洗脱组分的吸收行为，
既可提供色谱图，又可提供光谱图；既可 定量，又可定性分析。
1．键合固定相类型
载体： 硅胶。 (Si一OH)与有机分可成键, 一般可分三类
（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等
（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐； 作为阳离子交换 基团的磺酸等.
2．键合固定相的制备
（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相。 用醇与硅醇基发生酯化反应：
流失问题： 化学键合固定相。 重大突破。应用最广泛。 3/4以上的分离是在化学键合固定 相上进行的。
3．流动相 基本要求：
尽可能不与固定相互溶， 流动相与固定相的极性差别越显著越好
正相分配色谱：
流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。 极性小的先流出，极性大的后流出。
反相分配色谱：
第四章 高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、概述 20世纪60年代末70年代初
理论：气相色谱的理论 技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器
因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
氧化铝 （ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。
(四）离子交换色谱法（IEC）
离子交换原理和液相色谱技术的结合
样品对象： 离子型化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 因此，应用范围较广。
1．离子交换原理
待测离子对固定相（离子交换树脂）亲和力的差别来实现分离的。
阳离子交换：
阴离子交换：
一般形式： R一A＋B ＝ R－B＋A
⑵高压输液泵
、①要求： 流量稳定，无脉动 输出压力高 流量范围宽 耐酸，碱缓冲液腐蚀 泵体易于清洗：具有梯度洗脱功能，
②高压输液泵的分类
液压隔膜泵 气动放大泵 注射泵 往复柱塞泵
A、液压隔膜泵
B、气动放大泵
C、注射泵
D、往复柱塞泵
往复泵的优点： 液缸容积小，易于情况，更换系统，
特别适合于梯度淋洗，广泛应用于 HPLC，但：有脉动，
达平衡时，平衡常数（离子交换反应的选 择系数）：
KB/A = [A][B]r/[B][A]r，
D、往复柱塞泵
克服脉动办法： ①采用多头泵交替联动 ②压力脉动阻滞器 ③改进驱动凸轮的几何形状
WATERS泵的特点、泵体、脉动阻滞器、 驱动凸轮。
⑶梯度洗脱装量