高效液相色谱D讲义教材
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不能用酸、碱度过大或存在氧化剂的溶液作流动相的体系。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
固定相: 固体吸附剂。
1.分离原理 吸附:
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,
Kad = Kad为吸附平衡常数, Kad值大表示组分在吸附剂上保留强,难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱,易于洗脱。
氧化铝 (ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝)。
(四)离子交换色谱法(IEC)
离子交换原理和液相色谱技术的结合
样品对象: 离子型化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 因此,应用范围较广。
1.离子交换原理
待测离子对固定相(离子交换树脂)亲和力的差别来实现分离的。
阳离子交换:
阴离子交换:
一般形式: R一A+B = R-B+A
5.离子性键合相色谱法
固定相;
硅胶为基质,
键
合各种离子交 (CH3)等。
换
基
团
,
如
一
SO3H
一 CH2NH2 、 - C00H 、 一 CH2N
流动相:缓冲溶液。
分离原理:离子交换。
离子性化学键合相色谱法优点:
①可有效地分离各种类型化合物(非极性、极性和离子型)。 ②不易流失。 ③特别适用于梯度淋洗。 缺点:
Kad值可通过吸附等温线数据求出。
2.固定相
吸附剂: 如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。
硅胶 线性容量较高, 机械性能好, 不溶胀, 与大多数试样不发生化学反应
因此硅胶用得最多。
3流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。
对极性强的试样宜用极性强的洗脱剂; 对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。
洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数(ε0)来量。 ε0越大,表示洗脱剂的极性越强。
达平衡时,平衡常数(离子交换反应的选 择系数):
KB/A = [A][B]r/[B][A]r,
第四章 高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)
一、概述 20世纪60年代末70年代初
理论:气相色谱的理论 技术:高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器
因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点。
1.高效液相色谱法与经典液相色谱法
3 分离系统——色谱柱
色谱柱:柱管与固定相两部分。 柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较 多。 柱长5~30cm, 内径为4~5mm(4.6mm,5mm),凝胶色谱柱内径3~12mm,
预柱。
粒度(<20μm) 填充法:匀浆填充法,
4.检测系统
有两种基本类型的检测器。
1.键合固定相类型
载体: 硅胶。 (Si一OH)与有机分可成键, 一般可分三类
(1)疏水基团 如不同链长的烷烃(C8和C18)和苯基等
(2)极性基团 如氨丙基,氰乙基、醚和醇等。
(3)离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基,季镀盐; 作为阳离子交换 基团的磺酸等.
2.键合固定相的制备
(l)硅酸酯(≡Si一OR)键合固定相。 用醇与硅醇基发生酯化反应:
分离机理
双保留机理,以下共同贡献: 疏溶剂作用 亲硅醇基效应
4.正相键合相色谱法
固定相: 极性的有机基团,CN、NH2等键合在硅胶表面。
流动相: 非极性或极性小的溶剂(如烃类)中加入适量的极
性溶剂(如氯仿、醇等)。
流出程序:极性大,后出;极性小,先出。
样品对象: 分离极性化合物。 异构体。 特别适用于分离不同类型的化合物。
理论基础
法拉第第一定律 在电介过程中,电极上起反应的物质量
(W)与通过电介池的电量(Q)成正比。
法拉第第二定律 各种不同的电介质溶液中,通过相同的电量
时,电极上析出的电极产物的当量数相同。 (96487库仑)
电化学检测种类
电流检测器 安培检测器,应用最为广泛的一种。 组成:工作电极,参考电极,辅助电极
C18柱的反应与钝化
特性: 这类键会固定相具有热稳定好, 不易吸水, 耐有机溶1 剂的优点。 能在70℃以下, PH=2~8范围内正常工作, 应用较广泛.
3.反相健合相色谱法
固定相: 非极性,如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等。 流动相: 极性较强的溶剂,
样品对象: 样品范围广。
流出程序:
优点:柱效高,能获得无拖尾色谱峰的。
分类:
固定相按孔隙深度分类: 表面多孔型固定相 全多孔型固定相
1.表面多孔型固定相
基体:实心玻璃珠, 表面多孔:多孔活性材料, 多孔活性材料:硅胶、氧化铝、离子交换剂、
分子筛、聚酸胺等。 特性:
厚度薄、孔浅,相对死体积小,出峰迅速、柱效亦高;
颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达平衡,
D、往复柱塞泵
克服脉动办法: ①采用多头泵交替联动 ②压力脉动阻滞器 ③改进驱动凸轮的几何形状
WATERS泵的特点、泵体、脉动阻滞器、 驱动凸轮。
⑶梯度洗脱装量
梯度洗脱,又称:溶剂程序 分类:1:低压样度洗脱装置
2:高压梯度洗脱装置
2.进样系统
高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 以克服柱外展宽(又称柱外效应)较突出 。 注射器、进样阀
2.全多孔型固定相
它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。
特性: 这类固定相由于颗粒很细(5~10μm), 孔较浅,传质快, 易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
(二)流动相
正确选择流动相直接影响组分的分离度。
对流动相溶剂的要求是:
(1)溶剂对于样品,必须具有合适的极性和良好的选择性。 (2)溶剂要与检测器匹配。 (3)高纯度。 (4)化学稳定性好。
(5) 低粘度。
四、高效液相色谱法的主要类型及选择
(-)液一液分配色谱法(LLPC)
流动相和固定相:液体。
样品类型:极性的和非极性的,
水溶性和油溶性的, 离子型的和非离子型的各类化合物。
1.分离原理 原理:液液萃取相同。
2固定相 类型:固定相选择较简单。
例如:强极性β,β′一氧二丙睛, 中等极性的聚乙二醇, 非极性的角鲨烷等。
分离机理
疏溶剂作用理论。
非极性的烷基键合相
“分子毛”,
“分子毛”有较强的疏水特性。
被分离物质分为:非极性部分与极性部分。
一方面,分子中的非极性部分与固定相表面上的疏 水烷基产生缔合作用,使它保留在固定相中;
这种缔合作用是可逆的。
而另一方面,被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用,促使它离开固定相,并减小其保留作用。
显然,两种作用力之差,决定了分子在色谱中的保 留行为。
分离机理
疏溶剂作用理论。 缔合作用的强度和溶质的色谱保留值取决
于三个因素: ①溶质分子中非极性部分的总表面积 ②键合相上烷基的总表面积 ③洗脱液的表面张力
表面张力大,S与L缔合时释放的能量多,k也大 加入电解质,表面张力大, k也大。 有机极性溶剂增加,表面张力小, k也小。 无机盐增加,表面张力大, k也大。
≡Si-0H+ROH→≡Si-OR+H20
特性:传质特性好,但易水解且受热不稳 定,仅适用于不含水或醇的流动相。
(2)≡Si-C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下
特性: 共价键健合固定相不易水解, 并且热稳定较硅酸酯好。 缺点是反应不方便; 当使用水溶液时,必须限制PH在4~8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O-Si-C)键合固定相 制备反应如下:
⑵高压输液泵
、①要求: 流量wenku.baidu.com定,无脉动 输出压力高 流量范围宽 耐酸,碱缓冲液腐蚀 泵体易于清洗:具有梯度洗脱功能,
②高压输液泵的分类
液压隔膜泵 气动放大泵 注射泵 往复柱塞泵
A、液压隔膜泵
B、气动放大泵
C、注射泵
D、往复柱塞泵
往复泵的优点: 液缸容积小,易于情况,更换系统,
特别适合于梯度淋洗,广泛应用于 HPLC,但:有脉动,
但,中断色谱信息,不方便。
e光电二极管陈列紫外检测器
DAD 1976年开始报道 可获得“在流”色谱的全部光谱信息, 即不必停留。可能随色谱峰扫描。 与其他快速扫描检测器相比:
结构简单;工作可靠;性能好。
光路特点
工作原理
核 心 : 二 极 管 阵 列 元 件 是 一 般 由 200~1024 个 组 成
优点:高速、 高效、 高灵敏度、 高自动化。
二、 高效液相色谱仪
主要结构: 高压输液系统, 进样系统, 分离系统 检测系统。
辅助装置: 如梯度淋洗, 自动进样 数据处理等。
1.高压输液系统
部件组成: 储液罐, 高压输液泵(核心), 过滤器, 压力脉动阻尼器
⑴储液罐
化学惰性
低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法
一类是溶质性检测器,它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应,属于这类检测器 的有紫外、荧光、电化学检测器等。
另一类是总体检测器,它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应,属于这类检测 器的有示差折光,电导检测器等。现将常 用的检测器介绍如下:
(l)紫外检测器
最常用:80%的化合物有紫外吸收 应用最早,最广 灵敏度高 对环境温度及流速波动不敏感 可适用于梯度洗脱
电量检测器 测电量:根据法拉第定律可计算组分
的浓度。
(4)化学发光检测法:
某些物质,进行化学反应,生成处于激发 态的中间体和反应产物。 激发态→回 →基态→化学发光 化学发光的反应条件:
反应的自由能应足以生成电子激发态的产物 常用的化学发光剂 :光泽精C、鲁米诺
(5)示差折光率检测器
通用性检测器。 根据化合物的折光率不同。 光会偏转。 光偏转的程度与样品的浓度成正比。 但灵敏度低。
光波范围:200~600mm 每只分辨率为1~2nm 光点管越多, 分辩率越高 如使用211个二极管陈列元件,最快时10ms可是
成一次测量。 因而每秒可收集20000多个数据 可以得到三维图。
应用
色谱峰纯度检查。 比较光谱法、吸收比法。
色谱峰鉴定 与标准品或标准光谱比较 正常紫外光谱的比较 导数紫外光谱的比较
三维色谱能提供更多全面的信息。
(2)荧光检测法
在HPLC种仅次于紫外检测器。 灵敏度高。 最小 检测限比紫外低一个数量级。 选择性好,优于紫外。 但应用没有紫外广泛。 可以衍生化反应
工作原理
光致发光现象
(3)电化学检测法
利用电化学固有的灵敏度
线性范围106, 高灵敏度 10-12g,可与荧光相比, 具很强的专属性。
光路:与单波长紫外吸收检测器一致, 但:光源是氘灯或氢灯
波长:200~400nm, 灵敏度:比254nm紫外检测器要低。
c紫外—可见分光式检测器
是装有流通池的紫外—可见分光光度计, 光源:氘灯和钨灯
d扫描型可变波长紫外检测器
在色谱流停止工作的情况下,记录样品池 中洗脱组分的吸收行为,
既可提供色谱图,又可提供光谱图;既可 定量,又可定性分析。
不能 敏 敏
ELSD 通 104 10-7
能 不 不
(8)银杏黄酮提取物标准
银杏总黄酮 银杏总内酯 白果酸
三、高效液相色谱的固定相和流动相
(-)固定相
分类: 以承受高压能力来分类 刚性固体 、硬胶。
刚性固体:以二氧化硅为基质。
硬胶:它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中。
温度、梯度、电解质。
(6)蒸发光散射检测器:ELSD
样品雾化 干燥 细颗粒 激光照射 散射
(7)常用检测器的比较
表
类型 线性
最小检出量 (g/ml)
能否梯度
对流速 对温度
紫外 选
示差 通
2.4×104 104
10-10
10-7
能
不能
不
不
不
敏
荧光 选 103 10-11
能 不 不
安培 选 104 10-9
流失问题: 化学键合固定相。 重大突破。应用最广泛。 3/4以上的分离是在化学键合固定 相上进行的。
3.流动相 基本要求:
尽可能不与固定相互溶, 流动相与固定相的极性差别越显著越好
正相分配色谱:
流动相的极性小于固定相的极性, 它适用于极性化合物的分离。 极性小的先流出,极性大的后流出。
反相分配色谱:
流动相的极性大于固定相的极性。 它适用于非极性化合物的分离, 其流出顺序与正相色谱恰好相反。
(二)化学键合相色谱法(CBPC)
化学键合相色谱法: 简称键合相色谱,采用化学键合相的液相色谱。
特点: 不易流失, 适用于梯度淋洗, 表面的官能团可以是各种极性的, 特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。 适用于种类繁多样品的分离。
原理:比尔定律
A、紫外检测器的分类与特点
单波长式 多波长式 紫外/可见分光式 光电二极管阵列快速扫描式
a单波长紫外检测器
1如紫外—254检测器 光源: 低压录灯 254nm 80~85% 检测池:样品池小于10ul
光路长:10mm 参比池:空气 光电接收元件:光电倍增管
光电管 光敏电阻
b多波长紫外检测器
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
固定相: 固体吸附剂。
1.分离原理 吸附:
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,
Kad = Kad为吸附平衡常数, Kad值大表示组分在吸附剂上保留强,难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱,易于洗脱。
氧化铝 (ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝)。
(四)离子交换色谱法(IEC)
离子交换原理和液相色谱技术的结合
样品对象: 离子型化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 因此,应用范围较广。
1.离子交换原理
待测离子对固定相(离子交换树脂)亲和力的差别来实现分离的。
阳离子交换:
阴离子交换:
一般形式: R一A+B = R-B+A
5.离子性键合相色谱法
固定相;
硅胶为基质,
键
合各种离子交 (CH3)等。
换
基
团
,
如
一
SO3H
一 CH2NH2 、 - C00H 、 一 CH2N
流动相:缓冲溶液。
分离原理:离子交换。
离子性化学键合相色谱法优点:
①可有效地分离各种类型化合物(非极性、极性和离子型)。 ②不易流失。 ③特别适用于梯度淋洗。 缺点:
Kad值可通过吸附等温线数据求出。
2.固定相
吸附剂: 如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。
硅胶 线性容量较高, 机械性能好, 不溶胀, 与大多数试样不发生化学反应
因此硅胶用得最多。
3流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。
对极性强的试样宜用极性强的洗脱剂; 对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。
洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数(ε0)来量。 ε0越大,表示洗脱剂的极性越强。
达平衡时,平衡常数(离子交换反应的选 择系数):
KB/A = [A][B]r/[B][A]r,
第四章 高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)
一、概述 20世纪60年代末70年代初
理论:气相色谱的理论 技术:高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器
因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点。
1.高效液相色谱法与经典液相色谱法
3 分离系统——色谱柱
色谱柱:柱管与固定相两部分。 柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较 多。 柱长5~30cm, 内径为4~5mm(4.6mm,5mm),凝胶色谱柱内径3~12mm,
预柱。
粒度(<20μm) 填充法:匀浆填充法,
4.检测系统
有两种基本类型的检测器。
1.键合固定相类型
载体: 硅胶。 (Si一OH)与有机分可成键, 一般可分三类
(1)疏水基团 如不同链长的烷烃(C8和C18)和苯基等
(2)极性基团 如氨丙基,氰乙基、醚和醇等。
(3)离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基,季镀盐; 作为阳离子交换 基团的磺酸等.
2.键合固定相的制备
(l)硅酸酯(≡Si一OR)键合固定相。 用醇与硅醇基发生酯化反应:
分离机理
双保留机理,以下共同贡献: 疏溶剂作用 亲硅醇基效应
4.正相键合相色谱法
固定相: 极性的有机基团,CN、NH2等键合在硅胶表面。
流动相: 非极性或极性小的溶剂(如烃类)中加入适量的极
性溶剂(如氯仿、醇等)。
流出程序:极性大,后出;极性小,先出。
样品对象: 分离极性化合物。 异构体。 特别适用于分离不同类型的化合物。
理论基础
法拉第第一定律 在电介过程中,电极上起反应的物质量
(W)与通过电介池的电量(Q)成正比。
法拉第第二定律 各种不同的电介质溶液中,通过相同的电量
时,电极上析出的电极产物的当量数相同。 (96487库仑)
电化学检测种类
电流检测器 安培检测器,应用最为广泛的一种。 组成:工作电极,参考电极,辅助电极
C18柱的反应与钝化
特性: 这类键会固定相具有热稳定好, 不易吸水, 耐有机溶1 剂的优点。 能在70℃以下, PH=2~8范围内正常工作, 应用较广泛.
3.反相健合相色谱法
固定相: 非极性,如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等。 流动相: 极性较强的溶剂,
样品对象: 样品范围广。
流出程序:
优点:柱效高,能获得无拖尾色谱峰的。
分类:
固定相按孔隙深度分类: 表面多孔型固定相 全多孔型固定相
1.表面多孔型固定相
基体:实心玻璃珠, 表面多孔:多孔活性材料, 多孔活性材料:硅胶、氧化铝、离子交换剂、
分子筛、聚酸胺等。 特性:
厚度薄、孔浅,相对死体积小,出峰迅速、柱效亦高;
颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达平衡,
D、往复柱塞泵
克服脉动办法: ①采用多头泵交替联动 ②压力脉动阻滞器 ③改进驱动凸轮的几何形状
WATERS泵的特点、泵体、脉动阻滞器、 驱动凸轮。
⑶梯度洗脱装量
梯度洗脱,又称:溶剂程序 分类:1:低压样度洗脱装置
2:高压梯度洗脱装置
2.进样系统
高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 以克服柱外展宽(又称柱外效应)较突出 。 注射器、进样阀
2.全多孔型固定相
它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。
特性: 这类固定相由于颗粒很细(5~10μm), 孔较浅,传质快, 易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
(二)流动相
正确选择流动相直接影响组分的分离度。
对流动相溶剂的要求是:
(1)溶剂对于样品,必须具有合适的极性和良好的选择性。 (2)溶剂要与检测器匹配。 (3)高纯度。 (4)化学稳定性好。
(5) 低粘度。
四、高效液相色谱法的主要类型及选择
(-)液一液分配色谱法(LLPC)
流动相和固定相:液体。
样品类型:极性的和非极性的,
水溶性和油溶性的, 离子型的和非离子型的各类化合物。
1.分离原理 原理:液液萃取相同。
2固定相 类型:固定相选择较简单。
例如:强极性β,β′一氧二丙睛, 中等极性的聚乙二醇, 非极性的角鲨烷等。
分离机理
疏溶剂作用理论。
非极性的烷基键合相
“分子毛”,
“分子毛”有较强的疏水特性。
被分离物质分为:非极性部分与极性部分。
一方面,分子中的非极性部分与固定相表面上的疏 水烷基产生缔合作用,使它保留在固定相中;
这种缔合作用是可逆的。
而另一方面,被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用,促使它离开固定相,并减小其保留作用。
显然,两种作用力之差,决定了分子在色谱中的保 留行为。
分离机理
疏溶剂作用理论。 缔合作用的强度和溶质的色谱保留值取决
于三个因素: ①溶质分子中非极性部分的总表面积 ②键合相上烷基的总表面积 ③洗脱液的表面张力
表面张力大,S与L缔合时释放的能量多,k也大 加入电解质,表面张力大, k也大。 有机极性溶剂增加,表面张力小, k也小。 无机盐增加,表面张力大, k也大。
≡Si-0H+ROH→≡Si-OR+H20
特性:传质特性好,但易水解且受热不稳 定,仅适用于不含水或醇的流动相。
(2)≡Si-C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下
特性: 共价键健合固定相不易水解, 并且热稳定较硅酸酯好。 缺点是反应不方便; 当使用水溶液时,必须限制PH在4~8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O-Si-C)键合固定相 制备反应如下:
⑵高压输液泵
、①要求: 流量wenku.baidu.com定,无脉动 输出压力高 流量范围宽 耐酸,碱缓冲液腐蚀 泵体易于清洗:具有梯度洗脱功能,
②高压输液泵的分类
液压隔膜泵 气动放大泵 注射泵 往复柱塞泵
A、液压隔膜泵
B、气动放大泵
C、注射泵
D、往复柱塞泵
往复泵的优点: 液缸容积小,易于情况,更换系统,
特别适合于梯度淋洗,广泛应用于 HPLC,但:有脉动,
但,中断色谱信息,不方便。
e光电二极管陈列紫外检测器
DAD 1976年开始报道 可获得“在流”色谱的全部光谱信息, 即不必停留。可能随色谱峰扫描。 与其他快速扫描检测器相比:
结构简单;工作可靠;性能好。
光路特点
工作原理
核 心 : 二 极 管 阵 列 元 件 是 一 般 由 200~1024 个 组 成
优点:高速、 高效、 高灵敏度、 高自动化。
二、 高效液相色谱仪
主要结构: 高压输液系统, 进样系统, 分离系统 检测系统。
辅助装置: 如梯度淋洗, 自动进样 数据处理等。
1.高压输液系统
部件组成: 储液罐, 高压输液泵(核心), 过滤器, 压力脉动阻尼器
⑴储液罐
化学惰性
低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法
一类是溶质性检测器,它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应,属于这类检测器 的有紫外、荧光、电化学检测器等。
另一类是总体检测器,它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应,属于这类检测 器的有示差折光,电导检测器等。现将常 用的检测器介绍如下:
(l)紫外检测器
最常用:80%的化合物有紫外吸收 应用最早,最广 灵敏度高 对环境温度及流速波动不敏感 可适用于梯度洗脱
电量检测器 测电量:根据法拉第定律可计算组分
的浓度。
(4)化学发光检测法:
某些物质,进行化学反应,生成处于激发 态的中间体和反应产物。 激发态→回 →基态→化学发光 化学发光的反应条件:
反应的自由能应足以生成电子激发态的产物 常用的化学发光剂 :光泽精C、鲁米诺
(5)示差折光率检测器
通用性检测器。 根据化合物的折光率不同。 光会偏转。 光偏转的程度与样品的浓度成正比。 但灵敏度低。
光波范围:200~600mm 每只分辨率为1~2nm 光点管越多, 分辩率越高 如使用211个二极管陈列元件,最快时10ms可是
成一次测量。 因而每秒可收集20000多个数据 可以得到三维图。
应用
色谱峰纯度检查。 比较光谱法、吸收比法。
色谱峰鉴定 与标准品或标准光谱比较 正常紫外光谱的比较 导数紫外光谱的比较
三维色谱能提供更多全面的信息。
(2)荧光检测法
在HPLC种仅次于紫外检测器。 灵敏度高。 最小 检测限比紫外低一个数量级。 选择性好,优于紫外。 但应用没有紫外广泛。 可以衍生化反应
工作原理
光致发光现象
(3)电化学检测法
利用电化学固有的灵敏度
线性范围106, 高灵敏度 10-12g,可与荧光相比, 具很强的专属性。
光路:与单波长紫外吸收检测器一致, 但:光源是氘灯或氢灯
波长:200~400nm, 灵敏度:比254nm紫外检测器要低。
c紫外—可见分光式检测器
是装有流通池的紫外—可见分光光度计, 光源:氘灯和钨灯
d扫描型可变波长紫外检测器
在色谱流停止工作的情况下,记录样品池 中洗脱组分的吸收行为,
既可提供色谱图,又可提供光谱图;既可 定量,又可定性分析。
不能 敏 敏
ELSD 通 104 10-7
能 不 不
(8)银杏黄酮提取物标准
银杏总黄酮 银杏总内酯 白果酸
三、高效液相色谱的固定相和流动相
(-)固定相
分类: 以承受高压能力来分类 刚性固体 、硬胶。
刚性固体:以二氧化硅为基质。
硬胶:它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中。
温度、梯度、电解质。
(6)蒸发光散射检测器:ELSD
样品雾化 干燥 细颗粒 激光照射 散射
(7)常用检测器的比较
表
类型 线性
最小检出量 (g/ml)
能否梯度
对流速 对温度
紫外 选
示差 通
2.4×104 104
10-10
10-7
能
不能
不
不
不
敏
荧光 选 103 10-11
能 不 不
安培 选 104 10-9
流失问题: 化学键合固定相。 重大突破。应用最广泛。 3/4以上的分离是在化学键合固定 相上进行的。
3.流动相 基本要求:
尽可能不与固定相互溶, 流动相与固定相的极性差别越显著越好
正相分配色谱:
流动相的极性小于固定相的极性, 它适用于极性化合物的分离。 极性小的先流出,极性大的后流出。
反相分配色谱:
流动相的极性大于固定相的极性。 它适用于非极性化合物的分离, 其流出顺序与正相色谱恰好相反。
(二)化学键合相色谱法(CBPC)
化学键合相色谱法: 简称键合相色谱,采用化学键合相的液相色谱。
特点: 不易流失, 适用于梯度淋洗, 表面的官能团可以是各种极性的, 特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。 适用于种类繁多样品的分离。
原理:比尔定律
A、紫外检测器的分类与特点
单波长式 多波长式 紫外/可见分光式 光电二极管阵列快速扫描式
a单波长紫外检测器
1如紫外—254检测器 光源: 低压录灯 254nm 80~85% 检测池:样品池小于10ul
光路长:10mm 参比池:空气 光电接收元件:光电倍增管
光电管 光敏电阻
b多波长紫外检测器