定点突变

1.1.1 基因定点突变

简介（INTRODUCTION ）

定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变

搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。

PCR1：以primer F 和

primer Rm 为引物对扩增

PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增

实验步骤（PROCEDURE ）

1. 两对引物的Tm 值都应相当。两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。所需引入突

变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。

2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，

也可是部分互补。但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。

搭桥法定点突变

一对中间位置的点突变引物设计 3.

PCR ：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为

引物对扩增。两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。（注意前两次不能使用taq 聚合酶，因为taq 在产物3’ 端多加一个A ，导致后续的PCR3出现移码突变）

4. 克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。

► 一步法定点突变

一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。原理如图

实验步骤（PROCEDURE ）

5. 引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质粒模

5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’

完全互补

5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’

部分互补

5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’

部分互补

板完全匹配。不同于搭桥法的一对中间引物，全质粒PCR法的一对引物最好不是完全配对，因为这对引物是放在一个PCR反应中，完全配对极易形成引物二聚体，而不是与模板质粒结合。这就要求两条引物间配对区域的Tm值要小。

6.PCR。PCR1：质粒+正向引物扩增，PCR2：质粒+反向引物扩增。两次PCR均按照常规PCR

程序进行，不同的是只反应12个而不是30个循环。PCR3：PCR1和PCR2反应完成后，将二者体系混合成一个体系并补加适量的高保真聚合酶（如Pfu 或Pfu-X1），然后按照常规PCR程序继续反应16个循环。

▲关键步骤：

♫不能用taq酶，一是taq酶无3’-5’外切酶活性导致保真性差，全质粒PCR片段长，易出现非目标突变。二是因为taq酶具有5’-3’外切酶活性这就导致当PCR以质粒

为模板复制一圈回到最初引物位置时，原有引物会被外切导致引入的突变又变回

野生型质粒的序列。

♫为防止非目标突变，PCR循环数不要太多（建议不超过25个cycle）

♫在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量以免模板质粒消化不完全背景增加。（酶切和PCR都无法区分）

7.PCR产物的甲基化酶处理

8.待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌，在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修

饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来（DpnI酶只消化甲基化的DNA）。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。

9.向PCR产物中加入1 μL DpnI酶和4 μL的10× NEB cutsmart buffer消化模板质粒置于37°C

反应1 h，取出5 μL跑胶检测，剩余的取部分做细菌转化，涂板。筛选转化子，测序。