外植体选择和灭菌 ppt课件
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2-2外植体
ห้องสมุดไป่ตู้
衰败型
NH4＋ 生长素
保守分裂型
NH4＋ 生长素
细胞分裂素 NO3-
亢进分裂型
成功案例：王海波（1989）通过调整培养基中 2，4-D的水平建立了小麦胚性愈伤组织无性系， 诱导了松脆愈伤组织，建立了悬浮系，游离原 生质体
六、愈伤组织的细胞分化
维管组织是最先分化的组织。
1 影响维管组织分化的因子 （1）生长素 （2）蔗糖（麦芽糖、海藻糖） （3）细胞分裂素 （4）温度、光照
栽培胡萝卜： 培养基中不含还原氮，只要氧化氮浓度相 当高，也能形成体细胞胚，但发生率低。 还原氮和氧化氮的最适合比是 10mmol/L : 40mmol/L
只以还原氮为氮源时，经常调节培养基的 PH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与两种 氮比例适宜时相当。但当PH在4天内降到 4-3.5，对胚胎发生有抑制。 最低数量的内源还原氮量：5mmol/kg鲜组 织。
1%
2% 2.5－3.5% 4%
很少形成
形成 形成 很少或不形成
不形成
很少或不形成 形成 形成
但葡萄糖、果糖、其它单糖无作用。生长 素对维管组织分化所起的作用在很大程度 上取决于糖的存在。
第六节
愈伤组织中的形态发生
一、器官发生（organogenesis)（茎芽分化） 二、体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 三 人工种子
禾谷类植物
外植体 诱导培养基（2，4-D） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
（不含2,4-D或含IAA或NAA） 茎芽分化
苜蓿
外植体 诱导培养基（2，4-D，激动素） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
衰败型
NH4＋ 生长素
保守分裂型
NH4＋ 生长素
细胞分裂素 NO3-
亢进分裂型
成功案例：王海波（1989）通过调整培养基中 2，4-D的水平建立了小麦胚性愈伤组织无性系， 诱导了松脆愈伤组织，建立了悬浮系，游离原 生质体
六、愈伤组织的细胞分化
维管组织是最先分化的组织。
1 影响维管组织分化的因子 （1）生长素 （2）蔗糖（麦芽糖、海藻糖） （3）细胞分裂素 （4）温度、光照
栽培胡萝卜： 培养基中不含还原氮，只要氧化氮浓度相 当高，也能形成体细胞胚，但发生率低。 还原氮和氧化氮的最适合比是 10mmol/L : 40mmol/L
只以还原氮为氮源时，经常调节培养基的 PH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与两种 氮比例适宜时相当。但当PH在4天内降到 4-3.5，对胚胎发生有抑制。 最低数量的内源还原氮量：5mmol/kg鲜组 织。
1%
2% 2.5－3.5% 4%
很少形成
形成 形成 很少或不形成
不形成
很少或不形成 形成 形成
但葡萄糖、果糖、其它单糖无作用。生长 素对维管组织分化所起的作用在很大程度 上取决于糖的存在。
第六节
愈伤组织中的形态发生
一、器官发生（organogenesis)（茎芽分化） 二、体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 三 人工种子
禾谷类植物
外植体 诱导培养基（2，4-D） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
（不含2,4-D或含IAA或NAA） 茎芽分化
苜蓿
外植体 诱导培养基（2，4-D，激动素） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
外植体的选择与培养精选PPT
(1) 常用的培养基：①MS培养基；
无菌培养基上，这一过程叫做接种。 第三节 外植体的选择与培养
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； 1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 ②合适的培养条件： 第三节 外植体的选择与培养
（一）接种—无菌操作 (4)布质制品的灭菌
(5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。
定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 第三节 外植体的选择与培养
2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象
1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
①植物品种
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (1)对接种材料进行消毒； 三、外植体的接种与培养
愈伤组织
根、芽
培 细养胞基分中 裂无 素机 浓离 度子 较种 高类 时及；比例不A当时。
芽根
第四节、试管苗驯化与移栽
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养
无菌培养基上，这一过程叫做接种。 第三节 外植体的选择与培养
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； 1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 ②合适的培养条件： 第三节 外植体的选择与培养
（一）接种—无菌操作 (4)布质制品的灭菌
(5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。
定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 第三节 外植体的选择与培养
2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象
1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
①植物品种
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (1)对接种材料进行消毒； 三、外植体的接种与培养
愈伤组织
根、芽
培 细养胞基分中 裂无 素机 浓离 度子 较种 高类 时及；比例不A当时。
芽根
第四节、试管苗驯化与移栽
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养
植物组织培养学课件 (6)
植体浸入15～30秒种即可起到消毒作用
• 由于酒精对组织细胞的杀伤力比较强,使用 时间不能过长,一般达不到彻底消毒的要求， 但酒精的浸润作用可以促进其它消毒剂渗 透到外植体的整个表面，提高杀菌效果， 常做为外植体消毒的第一步
次氯酸钠（NaClO）
• 可以分解释放Cl2,具有较强的杀菌作用,对 植物细胞的损伤较小,消毒时间10min左右 为宜(2NaClO+H2O+2CO2 =2NaHCO3+ Cl2)
• 鳞茎：百合、大蒜等。且鳞茎的不同部位 的再生能力有很大的差别，外层比内层鳞 片叶的再生能力强，同一鳞片下段比中上 段再生能力强
其它 • 子叶或下胚轴 • 胎座 • 胚珠 • 种子 • 花瓣 • 花药和花粉
• ……
因此，选择合适的部位和组织（最 能表达全能性），是决定组织培养 成功的前提之一
⑶外植体的大小
一般来讲，较大的外植体有较大的再生能力
许多植物的茎尖培养表明，材料越小，成活率越 低（临界大小一般为一个茎尖分生组织带1～2个 叶原基）
但也不能过大，过大则难以消毒灭菌，容易引起 污染
一般愈伤组织诱导，可将材料切成5mm小段或 5mm×5mm小块
脱毒培养在保证存活的前提下应尽量小（0.1～ 0.2mm）
长状态已脱离分化状态，重新恢复分生能 力，即脱分化 ⑵继代培养 也称传代培养，指愈伤组织在培养基上生 长一段时间后，营养物枯竭，水分散失， 并已经积累了一些代谢产物，此时需要将 这些组织转移到新的培养基上
水稻幼穗
愈伤组织
⑶分化培养
愈伤组织的再分化过程
⑷生根培养
在生根培养基 (with relatively higher auxin/cytokinin ratios) 上进行根的诱导
• 由于酒精对组织细胞的杀伤力比较强,使用 时间不能过长,一般达不到彻底消毒的要求， 但酒精的浸润作用可以促进其它消毒剂渗 透到外植体的整个表面，提高杀菌效果， 常做为外植体消毒的第一步
次氯酸钠（NaClO）
• 可以分解释放Cl2,具有较强的杀菌作用,对 植物细胞的损伤较小,消毒时间10min左右 为宜(2NaClO+H2O+2CO2 =2NaHCO3+ Cl2)
• 鳞茎：百合、大蒜等。且鳞茎的不同部位 的再生能力有很大的差别，外层比内层鳞 片叶的再生能力强，同一鳞片下段比中上 段再生能力强
其它 • 子叶或下胚轴 • 胎座 • 胚珠 • 种子 • 花瓣 • 花药和花粉
• ……
因此，选择合适的部位和组织（最 能表达全能性），是决定组织培养 成功的前提之一
⑶外植体的大小
一般来讲，较大的外植体有较大的再生能力
许多植物的茎尖培养表明，材料越小，成活率越 低（临界大小一般为一个茎尖分生组织带1～2个 叶原基）
但也不能过大，过大则难以消毒灭菌，容易引起 污染
一般愈伤组织诱导，可将材料切成5mm小段或 5mm×5mm小块
脱毒培养在保证存活的前提下应尽量小（0.1～ 0.2mm）
长状态已脱离分化状态，重新恢复分生能 力，即脱分化 ⑵继代培养 也称传代培养，指愈伤组织在培养基上生 长一段时间后，营养物枯竭，水分散失， 并已经积累了一些代谢产物，此时需要将 这些组织转移到新的培养基上
水稻幼穗
愈伤组织
⑶分化培养
愈伤组织的再分化过程
⑷生根培养
在生根培养基 (with relatively higher auxin/cytokinin ratios) 上进行根的诱导
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
（2）在无病虫害的田块，连续晴天3～4d时选取生长健壮、新萌发且未着地 的匍匐茎段3cm长作外植体。
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
外植体的选择和灭菌ppt课件
6
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
7
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
10
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
3
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
7
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
3
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
第三章_外植体的选择和灭菌
对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更严格 的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。
要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
精品课件
2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌 2.6 无菌操作室的灭菌 2.7 操作
小结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适 的时期、适宜的大小。
第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其 效果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预
防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属
器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、
操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
精品课件Βιβλιοθήκη 1 外植体的灭菌方法➢预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 ➢预处理的植物材料的灭菌： ➢ 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
精品课件
2 常用灭菌药剂的使用和效果
精品课件
2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下， 然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好， 盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
精品课件
2.5 布质制品的灭菌
湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/ 厘米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温 度，灭菌20 min～30min。
要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
精品课件
2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌 2.6 无菌操作室的灭菌 2.7 操作
小结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适 的时期、适宜的大小。
第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其 效果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预
防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属
器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、
操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
精品课件Βιβλιοθήκη 1 外植体的灭菌方法➢预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 ➢预处理的植物材料的灭菌： ➢ 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
精品课件
2 常用灭菌药剂的使用和效果
精品课件
2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下， 然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好， 盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
精品课件
2.5 布质制品的灭菌
湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/ 厘米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温 度，灭菌20 min～30min。
第三章 外植体的选择和灭菌
第三节 污染原因和预防措施
培养物污染的原因 污染的预防措施
一．培养物污染的原因
1.培养物污染的原因主要有：外植体带菌；培养 基及器皿灭菌不彻底；操作不规范等。在组织 培养实验中，污染的病原分为细菌及真菌两类。 2. 细菌污染的特点是菌斑呈粘液状物，且在接 种1-2天即可发现，除材料或培养基灭菌不彻 底外，工作人员的不慎也是造成细菌污染的原 因；真菌污染的部分长有不同颜色的霉菌，在 接种3-10天后才能发现，真菌污染的原因多为 周围环境的不清洁，超净台的过滤装置失效， 培养器皿的口径过大等。
四．外植体大小
目前许多植物的茎尖培养表明，外植体 （茎尖）越小成活率越低。因此除非用 去除病毒，否则不宜将外植体切的太小。 但不是说外植体越大越好，外植体过大， 不易彻底灭菌。
第二节 外植体的灭菌方法
常用灭菌药剂 外植体的灭菌方法
一．常用灭菌药剂及灭菌效果
消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 升汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素 浓度/% 2 9-10 饱和溶液 0.1-1难易 易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中 消毒分钟 5-30 5-30 5-30 2-10 0.2-2 5-15 2-10 5-30 30-60 灭菌效果 很好 很好 很好 最好 好 好 很好 好 较好
1．70%-75%酒精
70%-75%酒精---具有较强的穿透力和杀 菌力，通常外植体浸入15-30秒即可。常 作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和 灭菌的双重作用，但不能达到彻底灭菌 的作用，必须结合其它药剂灭菌。有时 为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶 液中加入0.1%的酸或碱，提高乙醇的杀 菌效果。
2．果实和种子的消毒
视果实和种子的清洁程度，先用自来水 冲洗10-20分钟，甚至更长时间。再用 70%酒精迅速漂洗一次。果实用2%次氯 酸钠溶液浸10分钟，后用无菌水冲洗2-3 次后，就可取出果实内的种子或组织进 行培养。种子则先用10%次氯酸钠溶液 浸泡20-30分钟，对难以消毒的还可用 0.1%升汞或1%-2%溴水消毒5分钟。
植物组织培养植物组织培养技术灭菌方法无菌操作技术 PPT
2、 取材:
材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。 如叶片切成0、5cm见方的小块;茎切成含有一个节的小段。在接种过程中要 经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
3、 接种:
用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后, 将管口在火焰上再灼烧数秒钟,盖上瓶盖。
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min。
注:接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; 若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
(二)接种技术 (实验课)
1、 消毒:
将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无 菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。
具体操作过程是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管囗靠近酒精 灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取 一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基。若是叶片直截了当附在培 养基上,以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上) 外,其他尚无统一要求。
低全部去掉细胞分裂素,并加入适量的生 长素(NAA、IBA等)。
3、培养过程中常出现的 问题及解决方法
(第四章 植物组织培养中常见问题及解决方法)
A、培养外植体的污染
B、初代培养外植体的褐变培养的环境条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件,培养基组成、pH值、渗 透压等各种化学环境条件都会影响组织 培养育苗的生长和发育。
的。
pH值对琼脂的影响:
一般来说当pH值高于6、5时,培养基全变硬; 低于5时,琼脂不能特别好地凝固。
pH值在培养基制作中的变化:
高温灭菌会降低pH值(约0、2—0、8个pH值) pH值大小调整可用0、1M的NaOH和0、IM的HCI来 调整。lml的NaOH可使pH值升高0、2单位,lml的HCl 可使pH值降低0、2单位。调节时一定要充分搅拌均 匀。
材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。 如叶片切成0、5cm见方的小块;茎切成含有一个节的小段。在接种过程中要 经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
3、 接种:
用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后, 将管口在火焰上再灼烧数秒钟,盖上瓶盖。
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min。
注:接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; 若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
(二)接种技术 (实验课)
1、 消毒:
将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无 菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。
具体操作过程是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管囗靠近酒精 灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取 一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基。若是叶片直截了当附在培 养基上,以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上) 外,其他尚无统一要求。
低全部去掉细胞分裂素,并加入适量的生 长素(NAA、IBA等)。
3、培养过程中常出现的 问题及解决方法
(第四章 植物组织培养中常见问题及解决方法)
A、培养外植体的污染
B、初代培养外植体的褐变培养的环境条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件,培养基组成、pH值、渗 透压等各种化学环境条件都会影响组织 培养育苗的生长和发育。
的。
pH值对琼脂的影响:
一般来说当pH值高于6、5时,培养基全变硬; 低于5时,琼脂不能特别好地凝固。
pH值在培养基制作中的变化:
高温灭菌会降低pH值(约0、2—0、8个pH值) pH值大小调整可用0、1M的NaOH和0、IM的HCI来 调整。lml的NaOH可使pH值升高0、2单位,lml的HCl 可使pH值降低0、2单位。调节时一定要充分搅拌均 匀。
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去再生能力。Biblioteka 外植体状态：2 外植体的来源
-生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植 物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物， 甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生 菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微 生物滋生，从而影响培养效果。
3、材料取材
⑴材料选择
培养材料应选择有代表性的主要植 物、选择性状优良的种质或特殊的基因 型。
快速繁殖时应在植株生长的最适时 期取材，花药培养应在花粉发育到单核 期取材。
(五)外植体大小
外植体大小： 外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体
增殖较快。
外植体极性： 当外植体以形态学的基部接种于培养基上
1、预处理
先对植物材料进行修剪整理，去掉不需 要部分，将准备使用的植物材料（外植体） 在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁 的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15 分钟，再用流水冲洗干净。
2、表面灭菌
（1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口 罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净 ，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。
a. 单子叶植物不易诱导器官发生。 b. b. 木本植物较难诱导。 c. c. 存在基因型差异（如番茄29%~63%） d. d. 开始生长季节取材容易诱导。
外植体种类及基因型
(二)外植体的部位
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。
第三章 外植体选择和灭菌
一般来说，无论何种类型的细胞工程技术， 起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种 与培养等基本过程。
§1、外植体的选择和灭菌
一 外植体的选择 (一) 外植体的基因型 • 不同种类的植物 • 同一植物的不同器官
对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功 率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低
常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发
生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
• 在选择植物外植体进行组织培养时，还要 求考虑待培养材料的来源是否有保证，是 否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特 别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会 引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较 多。
选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。 胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污 染，材料太小难于成活。
外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活。
外植体的大小 0.5-1cm， 过大的外植体容易污染， 过小存活率很低。
选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎 段、节间、叶片、叶柄等。
C、流水冲洗外植体； D、外植体切割、分离及灭菌处理； E、外植体接种于诱导培养基。 F、环境条件控制促进外植体的生长。
(三)取材季节
取材的季节以早春为好
• 不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数 植物而言，应在其生长开始的季节采样 。
• 在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体 可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高， 而且增殖率也大。
(四)器官的生理状态和发育年龄
1幼年组织具有较高的形态发生能力
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响 形态发生。一般情况下，幼年组织比老年组织具有较 高的形态发生能力，生理年龄越老的组织或器官，越 接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失
外植体的选择有什么要求?
外植体的大小
选材
生理学上的年龄
外植体的来源 取材的季节
二、外植体的灭菌
灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。 • 常用灭菌方法:
干热灭菌: 150度，40’ 1２0度， 120 ’
湿热灭菌:高压灭菌锅，压力达0.5kg/cm2时放气， 压力达1.1 kg /cm2,121度,16-30’
（2）操作期间双手和台面常用70%酒精或 消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫 外灯照射杀菌，然后开启风机。
射线灭菌:紫外灯 过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um ） 熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲醛 ＋甲醛一半量的高锰酸钾 火烧灭菌：酒精灯 药剂灭菌：外植体
(一 )外植体的灭菌 原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间） 药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸 钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化 汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。
3、供体植株的管理
取自室外的外植体材料，供体植株的管 理十分重要，这与外植体培养时的污染率密 切相关。植株管理中应注意：
⑴避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类 和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引 起植物组织的潜在感染。
⑵注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵 染，取自感病植株的外植体，在培养中的 污染率远远高于来自健康植株的外植体， 必要时需使用化学药剂防治病害。 ⑶控制湿度 给供体植株浇水时应从根部 给水，避免从上部浇水，以免上部形成易 于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室 湿度；取材前尽可能保持植株干爽。
自
然 环 境 生 长 植 株
温室控制条件下生长植株
已离体培养植株
多数情况下，应尽量使用温室或人工气候 室控制培养的植物材料作为外植体来源， 减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料 间的一致性，提高实验的可重复性，也便 于培养技术的规范。
某些多年生植物或特殊材料，必须取自 自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那 些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对 于培养过程中可能出现内生菌污染的材料， 应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始 培养的材料。
-生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植 物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物， 甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生 菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微 生物滋生，从而影响培养效果。
3、材料取材
⑴材料选择
培养材料应选择有代表性的主要植 物、选择性状优良的种质或特殊的基因 型。
快速繁殖时应在植株生长的最适时 期取材，花药培养应在花粉发育到单核 期取材。
(五)外植体大小
外植体大小： 外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体
增殖较快。
外植体极性： 当外植体以形态学的基部接种于培养基上
1、预处理
先对植物材料进行修剪整理，去掉不需 要部分，将准备使用的植物材料（外植体） 在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁 的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15 分钟，再用流水冲洗干净。
2、表面灭菌
（1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口 罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净 ，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。
a. 单子叶植物不易诱导器官发生。 b. b. 木本植物较难诱导。 c. c. 存在基因型差异（如番茄29%~63%） d. d. 开始生长季节取材容易诱导。
外植体种类及基因型
(二)外植体的部位
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。
第三章 外植体选择和灭菌
一般来说，无论何种类型的细胞工程技术， 起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种 与培养等基本过程。
§1、外植体的选择和灭菌
一 外植体的选择 (一) 外植体的基因型 • 不同种类的植物 • 同一植物的不同器官
对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功 率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低
常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发
生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
• 在选择植物外植体进行组织培养时，还要 求考虑待培养材料的来源是否有保证，是 否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特 别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会 引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较 多。
选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。 胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污 染，材料太小难于成活。
外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活。
外植体的大小 0.5-1cm， 过大的外植体容易污染， 过小存活率很低。
选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎 段、节间、叶片、叶柄等。
C、流水冲洗外植体； D、外植体切割、分离及灭菌处理； E、外植体接种于诱导培养基。 F、环境条件控制促进外植体的生长。
(三)取材季节
取材的季节以早春为好
• 不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数 植物而言，应在其生长开始的季节采样 。
• 在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体 可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高， 而且增殖率也大。
(四)器官的生理状态和发育年龄
1幼年组织具有较高的形态发生能力
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响 形态发生。一般情况下，幼年组织比老年组织具有较 高的形态发生能力，生理年龄越老的组织或器官，越 接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失
外植体的选择有什么要求?
外植体的大小
选材
生理学上的年龄
外植体的来源 取材的季节
二、外植体的灭菌
灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。 • 常用灭菌方法:
干热灭菌: 150度，40’ 1２0度， 120 ’
湿热灭菌:高压灭菌锅，压力达0.5kg/cm2时放气， 压力达1.1 kg /cm2,121度,16-30’
（2）操作期间双手和台面常用70%酒精或 消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫 外灯照射杀菌，然后开启风机。
射线灭菌:紫外灯 过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um ） 熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲醛 ＋甲醛一半量的高锰酸钾 火烧灭菌：酒精灯 药剂灭菌：外植体
(一 )外植体的灭菌 原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间） 药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸 钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化 汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。
3、供体植株的管理
取自室外的外植体材料，供体植株的管 理十分重要，这与外植体培养时的污染率密 切相关。植株管理中应注意：
⑴避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类 和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引 起植物组织的潜在感染。
⑵注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵 染，取自感病植株的外植体，在培养中的 污染率远远高于来自健康植株的外植体， 必要时需使用化学药剂防治病害。 ⑶控制湿度 给供体植株浇水时应从根部 给水，避免从上部浇水，以免上部形成易 于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室 湿度；取材前尽可能保持植株干爽。
自
然 环 境 生 长 植 株
温室控制条件下生长植株
已离体培养植株
多数情况下，应尽量使用温室或人工气候 室控制培养的植物材料作为外植体来源， 减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料 间的一致性，提高实验的可重复性，也便 于培养技术的规范。
某些多年生植物或特殊材料，必须取自 自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那 些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对 于培养过程中可能出现内生菌污染的材料， 应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始 培养的材料。