蛋白质和多肽的氨基酸序列分析报告
蛋白质和多肽的结构与功能研究
蛋白质和多肽的结构与功能研究蛋白质和多肽是生命体的重要组成部分，它们不仅构成细胞的重要内容物，还参与了生命的各种代谢和功能调节。
蛋白质和多肽的结构与功能研究一直是生命科学的核心领域之一，其研究涉及到生命起源、生物合成和分解、生物学功能和疾病调节等方面。
本文介绍了蛋白质和多肽的结构特点以及其在生命科学中的重要性和应用。
蛋白质是由氨基酸分子组成的高分子化合物，分子量通常大于5000，分子结构复杂、多样性高，具有不同的生物学功能。
蛋白质的基本结构单元是氨基酸，其中包含了20种常见的氨基酸，它们的侧链结构和不同的氨基酸序列决定了蛋白质的结构和功能。
蛋白质的结构可以分为初级、二级、三级和四级结构四个层次。
初级结构指的是氨基酸的线性排列方式，即蛋白质的氨基酸序列。
在氨基酸序列中，某些特定的氨基酸连接方式和位置可以决定蛋白质的二级结构，如α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等。
二级结构是由氢键和范德华力等相互作用而形成的具有稳定的结构单元。
三级结构是由氢键、离子键、疏水作用和范德华力等相互作用而形成的整体折叠结构，在蛋白质的结构和功能中都起着重要的作用。
四级结构指的是多个具有三级结构的多肽链通过非共价键的相互作用而形成的复合体，如酶分子和抗体分子等。
蛋白质的结构和功能密切相关，二级和三级结构具有稳定性和动态性的特点，主要参与了蛋白质的不同功能和调节过程。
多肽是由2-50个氨基酸组成的低分子平均相对分子质量低于5000的化合物。
多肽也是生物体内的重要代谢产物，具有不同的结构和生物学功能。
多肽的结构主要包括线性结构、环形结构和折叠结构。
其中，线性多肽通常由丝氨酸、胱氨酸等氨基酸组成，其结构是直链型，可以通过不同的修饰反应（如酯化、掺杂）得到多种不同的化合物。
环肽是指由两个氨基酸之间的肽键形成的环状化合物。
环肽的稳定性和生物活性都较高，因此在医学和生物技术领域有广泛应用。
折叠多肽是由多个氨基酸组成的立体空间结构，它表现出了与许多酶分子和蛋白质分子相似的特性，因此具有非常广泛的应用前景。
蛋白质结构测定实验报告
一、实验目的1. 理解蛋白质结构测定的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质一级结构和三维结构的测定方法。
3. 了解蛋白质结构测定在生物学研究中的应用。
二、实验原理蛋白质是生命活动中的重要分子，其结构决定了其功能。
蛋白质结构测定是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
蛋白质结构测定主要包括一级结构测定和三维结构测定。
1. 蛋白质一级结构测定：蛋白质一级结构是指氨基酸的排列顺序。
测定蛋白质一级结构的方法有化学裂解法、蛋白酶水解法、高效液相色谱法等。
2. 蛋白质三维结构测定：蛋白质三维结构是指蛋白质分子在空间中的形态。
测定蛋白质三维结构的方法有X射线晶体衍射法、核磁共振法、冷冻电镜法等。
三、实验材料1. 蛋白质样品：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）等。
2. 试剂：硫酸铵、氯化钠、丙酮、乙腈等。
3. 仪器：高效液相色谱仪、核磁共振仪、X射线晶体衍射仪、冷冻电镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质一级结构测定（1）将蛋白质样品进行化学裂解，得到多肽片段。
（2）使用高效液相色谱仪对多肽片段进行分离，得到单个多肽。
（3）对单个多肽进行质谱分析，得到氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定（1）将蛋白质样品进行X射线晶体衍射实验，得到蛋白质晶体。
（2）对蛋白质晶体进行X射线衍射，得到衍射图谱。
（3）根据衍射图谱，计算蛋白质分子的三维结构。
3. 蛋白质结构分析（1）使用核磁共振仪对蛋白质样品进行NMR实验，得到蛋白质分子的三维结构。
（2）将NMR实验结果与X射线晶体衍射结果进行对比，验证蛋白质结构。
五、实验结果与分析1. 蛋白质一级结构测定通过高效液相色谱仪和质谱分析，成功测定了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定通过X射线晶体衍射实验，成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
3. 蛋白质结构分析通过NMR实验，成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
与X射线晶体衍射结果进行对比，验证了蛋白质结构。
实验五蛋白质序列分析
<40 stable >40 unstable
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（二）蛋白质疏水性分析
• 疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力 • 分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的
第一步 • 氨基酸疏水分析为蛋白质二级结构预测提供佐证 • 是分析蛋白质跨膜区重要一步
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蛋白质亲疏水性分析
• ProtScale工具 /tools/protscale.html
直接填写swissprottremblac号accessionnumber直接在搜索框中粘贴氨基酸序列输入swissprottremblac号打开proteintxt将蛋白质序列粘贴在搜索框中输入swissprottremblac号分不同的功能域肽段以p02699为例输出结果功能域用户自定义区段点击不同功能域得到以下结果氨基酸数目相对分子质量理论pi氨基酸组成正负电荷残基数消光系数半衰期原子组成分子式总原子数不稳定系数脂肪系数总平均亲水性40stable40unstable10二蛋白质疏水性分析分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的第一步是分析蛋白质跨膜区重要一步11protscale工具http
②将目的序列粘贴到序列输入框中，选择BLOSUM62 记分矩阵运行BlastP程序。NCBI的BlastP程序要求输 入格式为FASTA格式；
③如果BlastP检测到了高度同源的序列，将有可能提 示目的序列的生物学功能
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基于序列同源的蛋白质功能预测
序列相似性比较作为一个非常有效的工具用于同源 基因的发现
• 典型的有亮氨酸拉链，存在7残基 重复结构（heptad repeat)，以a，
b， c，d，e，f，g位置表示，其中a 和d位置为疏水性氨基酸，而其他位 置 残 基为亲水性
多肽氨基酸序列分析
百泰派克生物科技
多肽氨基酸序列分析
多肽的氨基酸序列分析就是对组成多肽的氨基酸种类、数量以及排列次序进行鉴定，也称为多肽测序，属于多肽一级结构鉴定的内容。
目前较常用的多肽氨基酸序列分析方法包括经典的Edman降解法、C末端酶解法、C末端化学降解法以及新兴的质
谱法等。
Edman降解法主要是对多肽的N末端氨基酸序列进行分析，但是其对N末端封闭的
肽链无能为力。
此外，Edman降解法测序速度较慢、样品用量较大、样品纯度要求
很高，而且对发生修饰的氨基酸残基识别的准确性不高。
C末端测序法在寻找理想
的PITC化学探针方面仍面临着很大的困难。
在这种背景下，高分辨率（达fmol 级）、高准确性以及操作简便的质谱测序技术则备受青睐，质谱分析技术的灵敏度
及准确性与待测物的分子质量成负相关，分子量增大时检测结果的准确性明显降低，多肽的分子量相比蛋白质小得多，因此采用质谱进行多肽氨基酸序列分析比蛋白质简单，许多研究均是以多肽作为分析对象。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC
纳升色谱，提供高效精准的蛋白/多肽氨基酸序列分析服务技术包裹，可对各种蛋
白/多肽样品的一级结构进行解析，包括多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序
以及多肽链内或链间二硫键的位置和数目等，欢迎免费咨询。
氨基酸、多肽与蛋白质
形成一级结构的化学键：
•肽键（主要化学键） •二硫键
目录
一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能 的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。
目 目录 录
三、多肽链中的局部特殊构象是 蛋白质的二级结构
Genome Project) 。
21世纪，蛋白质组学 (Proteomic) 。
目录
一、蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的 各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占 人体干重的 45％，某些组织含量更高， 例如脾、肺及横纹肌等高达80％。
目录
O NH2-CH-C H
甘氨酸
+
OH
O NH-CH-C H
甘氨酸
H
OH
-HOH
O O NH2-CH-C-N-CH-C H HH OH
甘氨酰甘氨酸
目录
肽键
* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合
物。 * 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基
酸缩合则形成三肽……
* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽
目录
1951年, Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋
白质的二级结构——α-螺旋(α-helix)。
1953年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。
1962年，John Kendrew和Max Perutz确定了血红蛋
白的四级结构。
20世纪90年代以后，后基因组计划(Post-Human
下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100 1/16%
蛋白质、多肽等大分子的质谱分析
蛋⽩质、多肽等⼤分⼦的质谱分析蛋⽩质、多肽等⼤分⼦的质谱分析检测仪器:1、基质辅助激光解吸附电离飞⾏时间质谱(MALDI-TOF MS)2、基质辅助激光解吸附电离串联飞⾏时间质谱(Autoflex III MALDI-TOF/TOF)3、纳升液相电喷雾四级杆飞⾏时间串联质谱仪(micrOTOF-Q II? ESI-Qq-TOF)主要应⽤:1、⽣物⼤分⼦的分⼦量检测2、蛋⽩质、多肽的纯度鉴定3、蛋⽩质的肽指纹图谱检测4、混合组分的分⼦量分布检测5、合成物质的分⼦量检测与纯度评价6、重组蛋⽩的分⼦量检测与纯度评价7、蛋⽩质的多肽谱检测8、⾎清多肽谱的检测9、PEG修饰的蛋⽩药物的研究样品要求:1、样品含量: 50-100Fmol (液体约5ul)2、样品形式: 液体；⼲粉；胶粒/条带3、⾮胶样品: 挥发性盐<20mM，⽆PBS、SDS和尿素等物质4、胶类样品: 银染过程中未使⽤戊⼆醛作为固定剂5、保存⽅式: 液体建议低温，胶类⽤去离⼦⽔防⼲蛋⽩质及多肽质谱鉴定简介博奥⽣物有限公司蛋⽩质实验室于2006年开始对外提供多肽和蛋⽩质测试服务，包括多肽和蛋⽩质的分⼦量和序列测定，蛋⽩种类鉴定。
博奥采⽤串联质谱法（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）鉴定蛋⽩，可靠性⾼。
蛋⽩经胰酶消化形成的肽段进⼊质谱，⼀级质谱检测多肽分⼦的⼤⼩，然后再将肽段打碎，形成⼀系列离⼦即N端离⼦系列（B系列）和C端碎⽚离⼦系列（Y系列）。
质谱再检测碎⽚离⼦的⼤⼩，即⼆级质谱。
将质谱数据与蛋⽩数据库进⾏⽐对，获得肽段的序列，特定的多肽序列对应着特定的蛋⽩，从⽽鉴定出待检测蛋⽩。
除了鉴定单个蛋⽩，我们的液相⾊谱和质谱联⽤平台（Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）还具有分析混合蛋⽩的能⼒。
MALDI-TOF MS（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是另⼀种常⽤的质谱平台，通过肽指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）来鉴定蛋⽩质。
蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价
蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价2.深圳亚辉龙生物科技股份有限公司，广东深圳518000【摘要】氨基酸序列是蛋白质和多肽重要的结构，其决定蛋白质的高级结构。
氨基酸测序在蛋白质研究中越发重要，高分辨率质谱技术的发展大大促进了氨基酸测序的研究。
本文综述了氨基酸测序的方法、原理以及其应用的研究进展，随着质谱技术的不断发展，新的测序方法不断建立，氨基酸测序将在蛋白质研究中发挥更大的作用。
【关键词】蛋白质；氨基酸测序；质谱技术；从头测序蛋白质是一类最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。
其一级结构是由多肽链主链上共价连接的氨基酸残基决定的，二级结构和其它高级结构主要是由非共价力如氢键、离子键、范德华力和疏水作用决定的。
一级结构中氨基酸序列的排列决定蛋白质高级结构的生物学活性。
因此，氨基酸序列测定具有非常重要的意义。
氨基酸序列测定一般需要测定其相对分子质量、等电点、N-末端肽段序列和C-末端肽段序列，虽然测定每种蛋白质的氨基酸序列都有自己特殊的问题需要解决，但是氨基酸测定的一般方法都可以概括为：①测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据蛋白质N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可以确定蛋白质分子中的多肽数目；②拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链间的二硫键，如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分；③鉴定多肽链的N-末端残基和C-末端残基，裂解多肽链成较小的片段，测定各肽段的氨基酸序列，目前最常用的肽段测序方法有Edman降解法[1]、酶解法和质谱法；④运用软件重建完整多肽链的一级结构，确定二硫键的位置，利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间交错拼凑出完整多肽链的氨基酸测序。
目前氨基酸序列测定的方法主要有化学降解法、酶降解法和质谱法以及核苷酸序列的推定法，每种方法都有其自身的优势和劣势，以前面三种测序方法最为常用。
1化学降解法化学降解法是指蛋白质或多肽物质与相应的化学试剂反应后，专一裂解多肽链肽段并检测相关裂解片段的方法，包括N-末端肽段序列测定法和C-末端肽段序列测定法。
蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
• 引言 • 蛋白质和多肽的氨基酸组成 • 氨基酸序列分析方法 • 氨基酸序列分析的应用 • 氨基酸序列分析的挑战与展望
01
引言
蛋白质和多肽的定义
蛋白质
由氨基酸组成的大分子，是生命 活动中不可或缺的组成部分，具 有多种生物学功能。
多肽
由2-50个氨基酸组成的短链肽， 具有较低的分子量和稳定性，在 生物体内发挥着重要的生理作用 。
蛋白质相互作用研究
通过分析蛋白质之间的相互作用，可以了解蛋白质在细胞内的功能 和调控机制，为疾病治疗提供新思路。
蛋白质修饰研究
通过对蛋白质的修饰进行分析，可以了解蛋白质的修饰对蛋白质功 能的影响，为药物设计和治疗提供依据。
生物进化研究
物种进化关系研究
通过对不同物种的氨基酸序列进行分析，可以了解物种之间的进 化关系和亲缘关系。
02
蛋白质和多肽的氨基酸组成
常见氨基酸的种类和特性
甘氨酸（Gly）：最简单的氨基酸，无手性碳原 子，呈中性。
01
缬氨酸（Val）：支链氨基酸，呈中性。
03
02
丙氨酸（Ala）：含有三个碳原子的氨基酸， 呈中性。
04
亮氨酸（Leu）：支链氨基酸，呈中性。
异亮氨酸（Ile）：支链氨基酸，呈中性。
05
药物设计与优化
氨基酸序列分析在药物设计 与优化中发挥着关键作用。 通过对靶点蛋白或活性多肽 的氨基酸序列进行分析，可 以发现潜在的药物作用靶点 ，为新药研发提供有力支持 。
生物进化与物种 分类
氨基酸序列分析在生物进化 与物种分类中具有重要价值 。通过对不同物种的蛋白质 和多肽进行氨基酸序列比对 ，可以揭示物种之间的亲缘 关系和进化历程。
氨基酸分析
2.2.56氨基酸分析（1）（见注解）氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。
蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。
蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。
蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。
氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。
并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。
伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。
通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。
设备用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。
当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。
氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。
除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。
检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。
此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。
而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。
一般预防策施在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。
高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。
分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。
所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。
实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。
仪器应放置在实验室的空旷区域。
保持实验室的卫生干净。
根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。
分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。
氨基酸,多肽,蛋白质的关系
氨基酸,多肽,蛋白质的关系
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，是一类含有羧基（-COOH）和氨
基（-NH2）的有机分子。
它们通过共价键结合形成多肽，多个多肽之
间再形成蛋白质。
氨基酸在蛋白质中的序列是非常重要的，因为它们决定了蛋白质
的结构和功能。
蛋白质的结构包含着四个层次：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。
一级结构是氨基酸序列的线性排列；二级结构
包括α螺旋和β折叠；三级结构是主链的三维摆动，使得氨基酸侧
链在空间上排列成为蛋白质的特定形状；四级结构是由两个或多个链
相互作用而形成的复杂蛋白质结构。
蛋白质的功能非常广泛，包括结构支持、酶催化、信号传导和免
疫保护等。
每个蛋白质的功能都与它的结构密切相关，因此对于蛋白
质的结构和功能的研究非常关键。
一种具有特定功能的蛋白质的序列通常由数百个甚至上千个氨基
酸组成。
不同的氨基酸组成不同的序列，则产生不同的蛋白质结构和
功能。
在人体中，氨基酸可以由体内合成或外源性摄取获得。
不同种类
的氨基酸在人体中的相对含量不同，因此也影响了蛋白质的合成和功能。
总之，氨基酸、多肽和蛋白质之间是密不可分的关系。
氨基酸是
构成蛋白质的基本单元，而多个氨基酸结合形成多肽，多个多肽之间
再形成蛋白质。
蛋白质的序列和结构决定了其功能，因此研究氨基酸、多肽和蛋白质的相互关系对于解决人类健康问题具有重要意义。
edman 化学降解法
edman 化学降解法【原创实用版】目录一、Edman 降解法简介二、Edman 降解法的应用范围三、Edman 降解法的优势四、Edman 降解法的操作步骤五、Edman 降解法的局限性正文一、Edman 降解法简介Edman 降解法是一种用于测定多肽和蛋白质氨基酸序列的方法，该方法通过化学降解的方式，将多肽或蛋白质中的氨基酸逐一降解并进行分析，从而得到其氨基酸序列。
Edman 降解法是 1950 年代由瑞典化学家 Pehr Edman 所发明，其对于蛋白质和多肽研究的发展具有重要意义。
二、Edman 降解法的应用范围Edman 降解法主要应用于以下领域：1.蛋白质和多肽的氨基酸序列分析2.蛋白质结构和功能的研究3.蛋白质工程和设计4.生物药物的研究和开发三、Edman 降解法的优势Edman 降解法具有以下优势：1.高效：自动分析仪进行分析时，能够可靠地测定肽链的 30 个左右氨基酸残基序列，最多可以分析 50-60 个氨基酸残基。
2.灵敏度高：此法用量少，一般只用 10-100 皮摩尔的多肽即可测定氨基酸序列。
3.可靠性高：在最好的条件下，每形成一次 PTH-氨基酸，效率可保持在 99% 以上。
4.适用于多种氨基酸：Edman 降解法可以分析各种类型的氨基酸，因此在分析蛋白质和多肽时具有较高的通用性。
四、Edman 降解法的操作步骤Edman 降解法的操作步骤主要包括以下几个方面：1.样品准备：将待测的多肽或蛋白质样品进行纯化，以确保分析结果的准确性。
2.标记氨基酸：将多肽或蛋白质中的氨基酸进行化学标记，通常使用异硫氰酸苯酯（PTH）作为标记试剂。
3.降解：通过化学降解的方式，将标记的多肽或蛋白质中的氨基酸逐一降解。
4.分析：使用自动分析仪对降解产物进行分析，从而得到多肽或蛋白质的氨基酸序列。
五、Edman 降解法的局限性尽管 Edman 降解法具有许多优势，但该方法仍存在一定的局限性：1.肽链较长的多肽分析难度较大，需要先将肽链切断成多个小肽，对这些小肽进行氨基酸分析，然后将这些信息拼接起来，得到起始肽链中的氨基酸序列。
多肽蛋白质N-端序列分析
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多肽蛋白质 N-端序列分析
报告编号：«报告编号» b) 实验方法
1) 液体样品处理： 加 40μl 甲醇到 Prosorb 装置的 PVDF 膜上，待滤过后；加入 40μl 0.1%TFA 溶液， 待滤过后；再加入供试品，供试品的量需大于 50pmol，滤过后；再分别加入 两次 600μl 0.1%TFA 进行滤过。将 Prosorb 放入已预热至 50℃的加热器中烘干， 用 PorSorb Punch(图 1)切下 PVDF 膜，上样。
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多肽蛋白质 N-端序列分析
报告编号：«报告编号»
8. 结论
综上所述，供试品«供试品名称»(批号：«供试品批号»)的 N 端序列为：xxxx
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多肽蛋白质 N-端序列分析
报告编号实验原理edman降解法是异硫氰酸苯酯pitc在弱碱tma条件下与蛋白质n端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽ptc蛋白质然后在无水强酸tfa条件下n端的第一个残基从完整的多肽蛋白链上以2苯氨基噻唑啉酮atzaa的形式裂解下来之后在稀酸25tfa条件下atzaa转化为更加稳定的苯基乙内酰硫脲衍生物即pth氨基酸如图1生成的pthaa输送至高效液相色谱中进行在线分析剩下的多肽蛋白供试品可反复进行上述处理依次生成各种pthaa经液相系统色谱柱分离可以确定被测多肽蛋白质供试品n端的氨基酸排列顺序
报告编号：«报告编号»
多肽蛋白质 N-端序列分析
供试品：«供试品名称»
上海中科新生命生物科技有限公司 2015 年 4 月 19 日
报告编号：«报告编号»
«供试品名称»的多肽蛋白质 N-端序列分析
供试品名称：«供试品名称» 供试品批号：«供试品批号» 委托单位：«委托单位» 检测人员： 核验人员： 技术服务部负责人：
多肽和蛋白质的合成和表征
多肽和蛋白质的合成和表征多肽和蛋白质是生物体中不可缺少的大分子，它们参与着细胞信号传递、酶催化、抗体作用等多种生命活动。
这些大分子的组成单元是氨基酸，它们通过肽键的形成连接成不同长度和序列的多肽和蛋白质。
本文将简要介绍多肽和蛋白质的合成和表征。
一、多肽的合成1. 固相合成法固相合成法是一种基于无机载体的肽链从端到端互相扩展而形成多肽的方法。
其原理是，首先将C端氨基酸保护基固定在固相载体表面，然后将依次加入其余的氨基酸，每次加入后反应前需要对待接的氨基酸羧基和旧的氨基酸C端氨基进行保护处理，最后通过消除保护基进行反应，得到完整的多肽。
2. 液相合成法液相合成法是直接在溶液中进行合成的方法。
其原理是，在氨基酸官能团上挂载一定长度的保护基，不断进行反应脱保护来形成新的肽键，同样需要反复保护处理。
二、蛋白质的合成1. 原核系统表达法原核系统表达法是大肠杆菌等细菌原生质体内表达基因，从而得到蛋白质的方法。
该方法具有高效快捷、生产成本低等特点，但蛋白质表达具有一定难度，还可能出现蛋白质不纯和亲和性低等问题。
2. 哺乳动物细胞表达法哺乳动物细胞表达法主要通过细胞的“自我机制”，通过人工的基因植入，将目标蛋白合成成为细胞的“工具”。
该方法易于合成过量、促繁殖和质量优良的蛋白质，但成本较高。
三、多肽和蛋白质的表征1. 分子量的测定分子量是多肽和蛋白质的一个重要性质，可以通过凝胶过滤层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法进行测定。
2. 氨基酸序列的分析氨基酸序列是多肽和蛋白质确定的一个重要特征，可以通过胰蛋白酶、舍氏酶、丝氨酸氨基内酰胺酶等酶的酶解和质谱等技术进行分析。
3. 二级结构的测定二级结构是多肽和蛋白质的一种原始结构，可以通过核磁共振谱、圆二色光谱等方法进行测定。
本文介绍了多肽和蛋白质的合成和表征，相信读者对这两种大分子有了更加深入的了解。
在今后的生物医学领域和食品加工领域等方面，多肽和蛋白质的合成和表征将继续发挥重要作用。
蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 更精确、 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 方法出现，很多因素如温度、时间、 试剂、添加剂、 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。 程度均有影响。 • 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
样品纯度必须>97%以上； 纯度必须>97%以上 1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 测定蛋白质的相对分子质量 相对分子质量； 2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法， SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 测定蛋白质多肽链种类和数目 多肽链种类和数目； 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS种类： SDS-PAGE 数目： 末端氨基酸残基摩尔数/ 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 测定蛋白质的氨基酸组成 氨基酸组成； 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数； 种氨基酸的个数；
• 1、酸性水解
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中 是最 通用的水解剂。 通用的水解剂。 • 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为 ～ 条件： 、真空、 ℃ 水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 • 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。 和苏氨酸被部分水解，损失分别为 和 。
第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定(共19张PPT)
四、PTH—氨基酸的鉴定
可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及 质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色
谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确
等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广
泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反
相柱进行分离。
第二节 N端蛋白质序列仪
三、气相序列仪
全，在N—甲基咪唑(NMl)和乙酸酐的共同作用下，Thr和
Ser上的羟基基本被乙酰化。
(5)裂解和衍生
C端的ATH衍生物在酸性条件下与[NCS]—反应而被
裂解生成ATH—氨基酸，新的C端自动形成TH，而不必重新
活化。 另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世，
第端六测节 序复C杂端因，序需列此要分较析，多的整经验个。 测序过程只需在开始时对C端进行一次性活
用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图 为标准PTH—氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分
较好分离，需选择合适的色谱条件，表列出了各种条件的改变导致个
别组分位置的迁移及图谱的改善。
第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素
在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单 个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是 由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可 能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95％～98 ％。因此，经过50次循环后，PTH—氨基酸分析谱中将出现较多杂峰， 影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基 酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。
剖析氨基酸和多肽的结构与性质
剖析氨基酸和多肽的结构与性质氨基酸和多肽是生物体内重要的有机化合物，它们在生物体内发挥着重要的功能。
本文将剖析氨基酸和多肽的结构与性质，以帮助读者更好地理解它们的作用和重要性。
一、氨基酸的结构与性质氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它由氨基（NH2）、羧基（COOH）、一个氢原子和一个侧链组成。
氨基酸的结构可以分为α-氨基酸和β-氨基酸两种。
其中，α-氨基酸是最常见的一种，其氨基和羧基都连接在同一个碳原子上。
氨基酸的性质主要取决于其侧链的性质。
不同的氨基酸具有不同的侧链，因此它们的性质也各不相同。
例如，甘氨酸的侧链是一个甲基（CH3），使其具有疏水性；而赖氨酸的侧链含有五个碳原子，具有亲水性。
这些不同的侧链性质决定了氨基酸在生物体内的功能和作用。
氨基酸可以通过肽键连接形成多肽。
肽键是由氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基之间的共价键连接而成。
多肽的结构可以分为原生结构、二级结构、三级结构和四级结构。
其中，原生结构是指多肽链上氨基酸的线性排列方式；二级结构是指多肽链上氨基酸的局部空间排列方式；三级结构是指整个多肽链的空间结构；四级结构是指多肽链与其他分子之间的相互作用。
二、多肽的结构与性质多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而成的化合物。
多肽的结构和性质与氨基酸有着密切的关系。
多肽的结构可以分为线性结构、环状结构和二级结构。
线性结构是指多肽链上氨基酸的线性排列方式。
线性结构的多肽具有一定的生物活性，如抗菌、抗炎等。
例如，多肽链上的氨基酸序列决定了多肽的生物活性。
在设计新的药物时，可以通过改变多肽链上的氨基酸序列来调节药物的活性。
环状结构是指多肽链上的某些氨基酸通过内部肽键形成环状结构。
环状结构的多肽具有较强的稳定性和生物活性。
例如，环肽是一类具有环状结构的多肽，其稳定性较高，可以在胃酸等恶劣环境中保持其生物活性。
二级结构是指多肽链上氨基酸的局部空间排列方式。
多肽的二级结构主要有α-螺旋和β-折叠两种形式。
α-螺旋是指多肽链上的氨基酸通过氢键形成螺旋状结构；β-折叠是指多肽链上的氨基酸通过氢键形成平行或反平行的折叠结构。
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引言
牛胰岛素的一级结构
引言
引言
一级结构测定的基本流程
1. 拆分蛋白质分子的多肽链; 2. 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基; 3. 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较
小的片段; 4. 对各肽段的氨基酸序列进行测序; 5. 重建完整多肽链的一级结构; 6. 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； 7. 酰胺基位置的确定。
• 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。
• 2、碱性水解
• 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。 例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮 气后填充管，110 ℃水解22h。
• 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨 酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外 消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限 于测定色氨酸的含量。
章节
第一节 氨基酸组成分析 第二节 蛋白质的末端测定 第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离 第四节 肽段的氨基酸顺序测定 第五节 蛋白质一级结构的重建
第一节 氨基酸组成分析
第一节 氨基酸组成分析
一、蛋白质或多肽的水解方法 二、特殊氨基酸的保护 三、衍生方法及原理 四、氨基酸定性和定量分析 五、测定氨基酸组成的实验步骤
第十章
蛋白质和多肽的氨 基酸序列分析
引言
• 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在 75～200Da之间，其化学通式为：
• 在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生 物来源的多肽中出现D型氨基酸。
引言
• 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽 键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏 水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并 发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级 结构决定了蛋白质的高级结构及功能。
• 相关措施：
• 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时， 算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。
• 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、ValVal、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延 长水解时间如水解92h甚至120h来解决。但是长时 间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。
色谱
利用高效液相色 谱对这些氨基酸 进行定性和定量 色谱分析。
• 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或 摩尔比。
一、蛋白质或多肽的水解方法
• 水解是蛋白质氨基酸组成分 析的第一步，作用是破坏蛋 白质的肽键，得到游离的氨 基酸，用于之后的定性定量 分析。
• 这是极其重要的一步，因为 水解质量的好坏将直接影响 到最终分析结果的正确与否。
氨基酸组成分析的目的
现代分离提纯技术的发展使蛋白质操 作微量化，但也给定量带来了困难，一般 很难通过常规的称量或测蛋白溶液在 280nm的光吸收值来准确定量蛋白质，所 以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质 样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据 结果便可以推算出蛋白量的可靠值。
另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结 果的情况，一种可能是蛋白质的N端封闭，另 一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分 是非蛋白质物质，解决这个问题的很好途径便 是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。
• 因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功 能研究中不可缺少的部分。
蛋白质测序的研究历史
1940年前 194Байду номын сангаас 1955 1958 1967
采用部分水解的方法试图测定 蛋白质的氨基酸序列
Consden等利用色谱技术成功测 定了短杆菌肽S6的氨基酸序列
Sanger首次测定了牛胰岛素的一级 结构（由51个氨基酸残基组成） Spackman、Stein、Moore制造了自 动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定 量分析进入了一个崭新的阶段
除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基 酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液 中的游离氨基酸。
氨基酸组成分析的步骤
• 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括 3个步骤，即：
1
2
3
水解
在一定温度、酸 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂，水解成 游离氨基酸。
衍生
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 通用的水解剂。
• 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。
• 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测 定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。
• 3、酶水解
• 用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏 感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。
• 优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可
以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条 件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。
• 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小
的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白 质，对样品的测定结果可能会有干扰。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带
2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法
3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS-PAGE 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数
4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数；
虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。
• 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
• 1、酸性水解
• 常见蛋白水解酶及其作用位点
• 4、微波辐射能水解
• 微波是一种高频电磁波，其能量传递是 通过分子的极化，而水分子的极化作用是非 常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水 解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和微 波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十 小时缩短到几十分钟。