蛋白质和多肽的氨基酸序列分析报告

• 3、酶水解
• 用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏 感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。
• 优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可
以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条 件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。
• 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小
的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白 质，对样品的测定结果可能会有干扰。
• 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。
• 2、碱性水解
• 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。 例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮 气后填充管，110 ℃水解22h。
• 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨 酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外 消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限 于测定色氨酸的含量。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带
2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法
3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS-PAGE 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数
4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数；
氨基酸组成分析的目的
现代分离提纯技术的发展使蛋白质操 作微量化，但也给定量带来了困难，一般 很难通过常规的称量或测蛋白溶液在 280nm的光吸收值来准确定量蛋白质，所 以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质 样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据 结果便可以推算出蛋白量的可靠值。
另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结 果的情况，一种可能是蛋白质的N端封闭，另 一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分 是非蛋白质物质，解决这个问题的很好途径便 是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。
• 相关措施：
• 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时， 算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。
• 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、ValVal、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延 长水解时间如水解92h甚至120h来解决。但是长时 间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。
• 因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功 能研究中不可缺少的部分。
蛋白质测序的研究历史
1940年前 1947 1955 1958 1967
采用部分水解的方法试图测定 蛋白质的氨基酸序列
Consden等利用色谱技术成功测 定了短杆菌肽S6的氨基酸序列
Sanger首次测定了牛胰岛素的一级 结构（由51个氨基酸残基组成） Spackman、Stein、Moore制造了自 动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定 量分析进入了一个崭新的阶段
色谱
利用高效液相色 谱对这些氨基酸 进行定性和定量 色谱分析。
• 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或 摩尔比。
一、蛋白质或多肽的水解方法
• 水解是蛋白质氨基酸组成分 析的第一步，作用是破坏蛋 白质的肽键，得到游离的氨 基酸，用于之后的定性定量 分析。
• 这是极其重要的一步，因为 水解质量的好坏将直接影响 到最终分析结果的正确与否。
• 常见蛋白水解酶及其作用位点
• 4、微波辐射能水解
• 微波是一种高频电磁波，其能量传递是 通过分子的极化，而水分子的极化作用是非 常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水 解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和微 波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十 小时缩短到几十分钟。
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 通用的水解剂。
• 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。
• 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测 定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。
Edman 推出第一台自动测序仪
引言
牛胰岛素的一级结构
引言
引言
一级结构测定的基本流程
1. 拆分蛋白质分子的多肽链; 2. 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基; 3. 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较
小的片段; 4. 对各肽段的氨基酸序列进行测序; 5. 重建完整多肽链的一级结构; 6. 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； 7. 酰胺基位置的确定。
章节
第一节 氨基酸组成分析 第二节 蛋白质的末端测定 第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离 第四节 肽段的氨基酸顺序测定 第五节 蛋白质一级结构的重建
第一节 氨基酸组成分析
第一节 氨基酸组成分析
一、蛋白质或多肽的水解方法 二、特殊氨基酸的保护 三、衍生方法及原理 四、氨基酸定性和定量分析 五、测定氨基酸组成的实验步骤
虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。
• 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
• 1、酸性水解
除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基 酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液 中的游离氨基酸。
氨基酸组成分析的步骤
• 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括 3个步骤，即：
1
2
3
水解
在一定温度、酸 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂，水解成 游离氨基酸。
衍生
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
第十章
蛋白质和多肽的氨 基酸序列分析
来自百度文库
引言
• 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在 75～200Da之间，其化学通式为：
• 在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生 物来源的多肽中出现D型氨基酸。
引言
• 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽 键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏 水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并 发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级 结构决定了蛋白质的高级结构及功能。