糖蛋白质相互作用
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化学进展第20卷
合以染色质的形式存在于细胞核中,此时基因表达受到抑制。基因表达的人工调节是后基因组研究的重要课题,在生物医学领域(如基因治疗)中有广泛的应用前景。有研究表明糖基化的DNA与基因的表达是相关的协・30]。Matsuura等bh32]利用糖.凝集素的相互作用实现了DNA转录的人工调节。他们制备了质粒DNA与乳糖的复合物(plasmidDNAlactose)作为糖基化DNA的类似物,该类似物通过乳糖基与凝集素RCA。∞的识别作用发生交联.加入的RNA聚合酶不能与DNA有效结合,于是DNA的转录受到抑制。加入过量的乳糖以竞争结合凝集素,RNA聚合酶与释放出的DNA类似物结合,DNA转录得以进行,从而实现基因表达的人工调节(如图1)。
图1利用糖.凝集素相互作用调节基因表达的示意副”1
Fig・1Schematicillustrationofmodelsystemforregulationofgeneexpressionutilizingcarbohydrate.1eetininteraction[32]
1.4基于凝集素媒介的药物导向治疗
导向治疗属于靶向给药系统,是指应用一定的生物医学技术让治疗药物与靶向载体相结合,在载体的导向下把药物运送到需要发挥作用的特定部位,从而减少药物对健康机体可能的副作用和毒性。导向药物的设计是导向治疗的重要研究方向D引。1987年,Bagshaweml首次提出了抗体导向酶.前药治疗(antibody—directedenzymeprodrugtherapy,ADEPT)这一新概念,即利用抗体作为载体携带前药的专一性活化酶,活化酶通过肿瘤细胞表面抗原选择性地结合到肿瘤部位,当前药进入体内,前药就与结合到细胞表面的活化酶发生特异性反应,释放药物作用
于肿瘤细胞。这种方法利用抗原与抗体、酶与底物的双重选择特异性提高药物的靶向性,同时也降低了药物毒性。凝集素与糖类的识别作用就可以起到这样的导向作用¨5|。随之,凝集素导向酶.前药治疗(1ectin-directedenzyme-activatedpmdmgtherapy,LEAPT)也发展了起来¨引。其3个基本步骤如图2所示:(1)糖基化的鼠李糖苷酶通过受体媒介胞吞作用(receptor-mediatedendocytosis,RME)进入细胞;(2)鼠李糖包裹的前药进入到细胞;(3)前药在酶的作用下释放药物。结果显示,这种方法操作简单,只需要对酶进行糖基化改性,同时药物的靶向选择性也提高了60倍。Benito等¨引设计了一类连接有多糖的树枝状p.环糊精衍生物,合成了一系列这种具有不同单糖单元和空问结构的衍生物,考察了它们与ConA及一种巨噬细胞表面甘露糖/海藻糖特异性受体的结合能力。抗癌药物docetaxel借助口一环糊精圆筒状的分子结构特征与之结合。这种新型的糖导向药物就可以像“生物导弹”一样发挥针对性的靶向治疗作用。
图2LEAPT双向导向系统示意图‘蚓
F睡.2LEAPT船abipartitedeliverysystem‘”1
2糖.凝集素相互作用研究方法学与器件
生命体系中涉及大分子与大分子或大分子与小分子之间的相互作用,作用的形式包括化学键的断裂、组合或重排,还包括氢键、疏水作用、偶极作用和范德华力等弱相互作用。分子间相互作用会引起复杂的结构变化,伴随能量转移。人们对分子间相互作用进行了一系列研究,相关的研究方法也逐渐成熟起来。本文主要综述了电化学、压电传感、光谱、纳米技术、微阵列技术和生物传感器等方法和器件在糖.蛋白质(凝集素)相互作用研究中的应用。2.1电化学方法
电化学方法检测灵敏度高,易于实现自动化和连续分析,可用于氧化还原过程及其机理、催化过程
与机理、新材料表征、表面分析和电池反应跟踪等研
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QCM技术由于其特有的优势,已用于糖、糖蛋白、凝集素以及微生物的检测。Cannon等㈨1发展了一种基于糖受体的压电传感器用来检测单糖。他们采用基因工程手段在糖受体分子的氨基酸序列中插入半胱氨酸,糖受体通过金硫键固定到石英晶体表面。从质量效应的角度,单糖是小分子,不足以引起大的频移,但糖受体组装膜在结合单糖之前是一层黏性膜,结合单糖后,膜变得更致密而更具刚性,从而产生较大的频率响应。Stine等№川比较了鞘糖脂和抗体作为识别分子用来检测毒素蓖麻蛋白的QcM传感器,发现与抗体相比,鞘糖脂检测蓖麻蛋白更灵敏,检测下限降低了5倍,达5弘g・IIll‘。。2.3光谱方法
2.3.1表面等离子体波共振
表面等离子体波共振(surfaceplasmonresonance,SPR)适于研究生物分子间的相互作用,其优点是响应快、免标记、可实时检测和获取相关动力学和热力学参数,如平衡常数K。和解离常数蚝。其原理是当光波从光密介质射向光疏介质,且入射角大于临界角时,入射光发生全反射。全反射时光波将透入到光疏介质很薄的一层,形成消失波。消失波引发金属膜自由电子产生表面等离子体,当消失波的频率与等离子体的振荡频率相当时,就引起表面等离子体共振波。此时入射光被金属表面电子所吸收,使反射光能量下降。下降到最小时的入射角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面通过液相的折射角的变化而变化,折射率的变化与金属表面结合的分子质量成正比。通过分析共振角的变化就可得到分子间相互作用的信息。
Matsuum等№1用SPR技术定量估算了sialosyllactosylceramide(GM3)单层膜与包含gangliotriaosylceramide(G93)的聚合物之间的相互作用,结果表明鲰3可选择性地结合到GM3单层膜中,结合常数约为106tool~・L。此外,他们旧1还研究了G93与多种神经节苷脂单层膜的相互作用,发现GM3与GS3的结合力最强,表观结合常数为2.5×106mol~・L,随着GM3结构的改变,结合力逐渐减小。这说明GM3和G93两种鞘糖脂间相互作用是基于很精确的分子识别。Whelan等旧1用一种微型表面等离子体共振传感器研究了ConA与抗生物素蛋白(avidin)的相互作用,得到解离常数虬为6.0±0.9“tool・L~。Smith等Ⅲ1也用SPR研究了糖.蛋白质的相互作用。他们利用聚二甲基硅氧烷微通道技术在金膜表面组装了甘露糖和半乳糖阵列,随后
用SPR成像技术监测到溶液中两种凝集素,木菠萝凝集素(Jacalin,选择性识别半乳糖)和ConA(选择性识别甘露糖),与糖阵列的结合,得出两种相互作用的吸附常数K一。分别为(2.24-0.8)×107和(5.64-1.7)×106tool~・L。Mislovi60v6等№1用SPR技术研究了两种天然糖蛋白酶(转化酶和葡萄糖淀粉酶)和两种合成的甘露糖基化酶与ConA的结合特性,得到两种合成酶与ConA的解离常数配分别为16±5和200士50且tool・L~。Critchley等帕71比较了两种合成糖脂与凝集素RCA.加的结合差异。Vomholt等旧1采用SPR系统表征了凝集素的糖识别结合域,以筛选天然凝集素。
2.3.2荧光光谱法
荧光光谱法(fluorescentspectrum)是研究生物大分子与小分子和离子相互作用的重要手段。人们常常利用蛋白质自身的内源荧光作为探针,借助荧光猝灭法可测定分子相互作用的结合常数及结合位点数,也可引入外源性荧光指示探针。Xue等旧’合成了连接有糖基的聚对亚苯聚合物,这种聚合物在磷酸缓冲溶液中有很强的荧光,当与ConA作用时,聚合物的荧光强度减小,荧光猝灭常数为4.5×107。Rusin等"叫合成了糖基取代的oligopyrrolic大环化合物,这种大环化合物在水相中会发生团聚而使荧光减弱,当加人凝集素ConA,糖与凝集素发生识别作用,大环化合物得以分散,荧光强度增大,再加入与ConA有强亲和作用的D-甘露糖,大环化合物从位点被释放,重聚使荧光猝灭(如图3)。
图3ConA与标记物相互作用及被单糖取代过程‘”1
Fig.3InteractionofConAwithalabelfollowedbydisplacementwithanaturalsubstrate【”】
2.3.3其他光谱方法
主要有紫外-可见吸收光谱(uV-visabsorptionspectroscopy),红外光谱(infrared
spectrometry,IR)和