基因工程实验(答案)

——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程（实验题目的总结）
答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。

2.如何正确使用微量移液器（自己写的）
答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。

3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么
答：loading Buffer。

主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。

溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。

4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。

（题目有歧义）
答：①取琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。

5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响（实验书P75）
答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否；
6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么（实验书P31）
答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。

7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用
答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。

8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA
答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为～L 的NaCl
9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。

答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。

10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA
聚合酶）。

答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，经高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤合成特异DNA片段。

（2）Mg2+：TaqDNA聚合酶的活性需要；dNTP：作为底物；引物：作为延伸的出发点；DNA：模板；缓冲液：维持反应环境的PH值；TaqDNA聚合酶：催化DNA的合成。

11.PCR循环次数是否越多越好，为什么
答：否。

因为PCR产物的积累存在平台效应。

12.降低退火温度，延长变性时间对PCR结果有什么影响
答：前者会使非特异性产物增多；后者会导致酶的活性降低。

13.如果检测的PCR结果中出现很多非特异性条带，可能有哪些原因导致
答：①引物特异性不强；②Mg2+浓度过高；③引物二聚体形成；④退火温度过低；⑤循环次数过多。

14.简述DNA片段回收纯化的原理。

（）
答：各DNA片段的大小不同，则经琼脂糖凝胶电泳后得到了分离，收集含有DNA的凝胶部位通过溶解凝胶、使DNA与硅胶柱结合、再通过洗涤杂质、最后DNA洗脱，通过新的EP 管收集等，最终得到纯化的目的。

15.为什么DNA体外连接反应反应要设在16℃
答：因为此温度下能最大限度的发挥连接酶的活性，同时有助于维持短暂配对结构的稳定。

16.简述TA克隆试剂盒进行体外连接的原理。

（实验书P149）
答：经DNA聚合酶得到的PCR产物——双链DNA片段的末端具有一个突出“A”碱基，而T载体每条链的3’端带有一个突出“T”碱基，则其两端可以与PCR产物的两端进行正确的T--A配对，再在连接酶的催化下，即可将目的片段连接到载体上，形成重组载体。

17.简述氯化钙制备感受态细胞的原理。

（实验书P153）
答：经低温预处理的低渗CaCl2溶液处理受体细胞后，则可使细胞的通透性增大，从而极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。

18.重组质粒的转化方法有哪些
答：CaCl2法，电击法，农杆菌转染法；花粉管通道法，基因枪法等。

19.当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB 培养基上培养1h
答：使感受态细胞复苏，同时让重组质粒在感受态细胞中适应并富集，以便于表达产物，使受体细胞具抗性能力。

20.什么情况下转化平板上会出现卫星菌落，为什么会出现卫星菌落
答：涂布后的培养基培养时间过长。

因为载体上的抗性基因的表达产物由于培养时间过长而得到积累，使加入的抗生素失
效，从而让不含质粒的空菌落的一大量生长，故出现卫星菌落。

21.碱裂解细胞抽提质粒的基本原理是什么
答：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解后，DNA和蛋白都发生变性。

当加入中和液后，由于构象上的区别，质粒DNA能较快的复性呈溶解状态，离心时留在上清液中，而染色体DNA 不能复性，从而形成缠绕的网状结构并与蛋白凝聚，因离心沉淀。

22.电泳检测提取的质粒是会看到三条带，这三条带分别代表了什么
答：最前端为超螺旋，中间为开环DNA，最后为复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。

23.质粒抽提中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么
答：溶液Ⅰ——使沉淀重新悬浮；溶液Ⅱ——让染色体DNA和质粒DNA变性；溶液Ⅲ——中和碱，使质粒DNA复性。

24.什么是限制性内切酶的星号活性
答：在某些条件下，一种特异性识别序列的限制酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性。

25.细菌产生的限制性内切酶，为什么不对自己的DNA进行切割
答：因为细菌能通过甲基化酶的甲基化作用保护自身的DNA不被相应的限制酶降解。

26.影响限制性内切酶的因素有哪些使用工具酶时应注意什么
答：（1）DNA样品中的污染物，如有机溶剂等；缓冲体系；温度；样品量。

（2）①酶量使用少，确认样品是否加入反应体系；②吸取各试剂时使用不同枪头，避免交叉污染；③控制反应体系中甘油量在10%以下，以防止星号活性；④保证取酶的操作在冰浴条件下进行。

操作考试：
１.制胶
２.点样电泳
３.依照给定的ＰＣＲ参数，在ＰＣＲ仪上设置程序。

４.切胶
５.超净工作台接种（切记：最后封膜）。