磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构研究进展_赵艳

（ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４）
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ ＰＥＰＣ） ｉｓ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ， ａｌｇａｅ ａｎｄ ｍａｎｙ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｉｔ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ｏｆ ＣＯ２ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ４ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｒ ｅｍａｒｋａｂｌｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｉｔｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｔｅｎ ｙｅａｒｓ．Ｒ ｅｃｅｎｔｌｙ， ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＥＰＣ ａｎｄ ｍａｉｚｅ Ｃ４－ ｆｏｒｍ ＰＥＰＣ ｗａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｘ－ ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｔｈｅ ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ＰＥＰＣ．
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＥＰＣ Ｍａｉｚｅ Ｃ４－ ｆｏｒｍ ＰＥＰＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ＰＥＰＣ （ ＥＣ ４．１．１．３１） 以 Ｍｇ２＋或 Ｍｎ２＋为 辅 助 因 子 ， 催 化 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 （ ＰＥＰ） 和 ＨＣＯ３－ 生 成 草 酰 乙 酸 （ ＯＡＡ） 和 无 机 磷 酸 的 不 可 逆 性 反 应 。 ＰＥＰＣ 广 泛 存 在 于 光 合 生 物 ， 如 植 物 、藻 类 、蓝 细 菌 和 光 合 细菌中， 还存在于很多非光合细菌和原生动物中。 ＰＥＰＣ 催 化 的 反 应 为 细 胞 各 种 组 分 的 生 物 合 成 提 供 四碳二羧酸， 参与维持柠檬酸循环， 在初级代谢中 有 重 要 的 补 给 作 用 ， 在 Ｃ４ 植 物 和 ＣＡＭ 植 物 的 光 合 作 用 中 催 化 大 气 中 ＣＯ２ 固 定 的 第 一 步 反 应 ， 是 Ｃ４ 光 合 作 用 途 径 中 最 重 要 的 酶 之 一［１］。
３ ＰＥＰＣ 蛋 白 质 晶 体 的 特 征
要 详 细 了 解 ＰＥＰＣ 的 分 子 结 构 ， 需 要 获 得 高 分 辨 率 的 蛋 白 质 晶 体 。通 过 对 ＰＥＰＣ 分 子 特 性 的 深 入 研 究 ， Ｉｚｕｉ［５］的 实 验 室 建 立 了 一 种 从 Ｅ．ｃｏｌｉ 中 制 备 大 量 高 纯 度 ＰＥＰＣ 的 快 速 而 又 简 单 的 方 法 ， 他 们 用 ｈｅｘｙｌ－ｓｐｈａｒｏｓｅ 做 疏 水 性 层 析 柱 并 用 变 构 抑 制 剂 Ｌ－ Ａｓｐ 特 异 性 洗 脱 纯 化 到 均 匀 一 致 的 ＥｃＰＥＰＣ 蛋 白 。 之后他们又用一种改进的方法， 从玉米叶子中纯 化 到 ＺｍＰＥＰＣ［６］。此 后 Ｉｚｕｉ 和 Ｋａｉ 的 实 验 室 合 作 开 展 ＰＥＰＣ 蛋 白 质 晶 体 的 Ｘ－射 线 衍 射 研 究 ， 他 们 发 现 低 分 子 量 的 ＰＥＧ 是 ＰＥＰＣ 结 晶 化 过 程 的 一 个 非 常 好 的 沉 淀 剂［４］。１９９９ 年 利 用 从 大 肠 杆 菌 中 纯 化 出 来 的 ＰＥＰＣ 与 它 的 变 构 抑 制 剂 Ａｓｐ 形 成 的 复 合 物 制 成 ＥｃＰＥＰＣ 蛋 白 质 晶 体 ， 这 种 高 质 量 的 蛋 白 质 晶 体 可 用 于 Ｘ－射 线 衍 射 分 析 ， 分 辨 率 达 到 ２．８Ａ， 因 为 在 这 个 晶 体 中 ＰＥＰＣ 与 变 构 抑 制 剂 Ａｓｐ 结 合 ， 因 此 酶 处 于 无 活 性 状 态 （ Ｔ 状 态 ） ［７］。 最 近 他 们 又 发 表 了 从 玉 米 叶 片 中 纯 化 到 的 ＺｍＰＥＰＣ 蛋 白 质 晶 体 的 结 构 ， 分 辨 率 达 ３Ａ［４］， 这 是 首 次 报 道 的 植 物 ＰＥＰＣ 的 三 维 结 构 。 在 ＺｍＰＥＰＣ 的 结 晶 溶 液 中 含 有 ５ｍＭ 苹 果 酸 和 高 浓 度 的 乙 二 醇 （ ２０％） ， 据 报 道 高 浓 度 的 乙 二 醇 有 如 ＺｍＰＥＰＣ 变 构 激 活 剂 一 样 的 动 力 学 行 为 ， 它 的 存 在 使 ５ｍＭ 的 抑 制 剂 苹 果 酸 对 ＺｍＰＥＰＣ 的 催 化 活 性 没 有 影 响 ［１７］， 因 此 在 ＺｍＰＥＰＣ 晶 体 中 酶 处 于 活 性 状 态 （ Ｒ 状 态 ） 。对 高 质 量 的 ＺｍＰＥＰＣ 与 ＥｃＰＥＰＣ 蛋 白 质 晶 体 进 行 Ｘ－射 线 衍 射 分 析 阐 明 了 ＰＥＰＣ 分 子 的 三维结构。
人培养费； 昆明理工大学人才培养费联合资助 作者简介： 赵艳（ １９８２－） ， 女， 云南昆明人， 在读硕士研究生， Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｈａｏｙａｎｋｍ＠１２６．ｃｏｍ 通讯作者： 陈丽梅， 女， 教授， 硕士生导师
１０
生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００７ 年第 ５ 期
用 效 率 ， 是 目 前 植 物 基 因 工 程 的 一 个 研 究 热 点 ［３］。 研 究 结 果 发 现 在 转 基 因 植 物 中 ＰＥＰＣ 的 活 性 也 如 同 在 Ｃ４ 植 物 中 一 样 ， 受 代 谢 产 物 如 苹 果 酸 ， ６－磷 酸 葡 萄 糖 （ Ｇｌｕｃ６－Ｐ） 和 可 逆 性 磷 酸 化 的 共 价 修 饰 调 控 ［４］。 由 于 ＰＥＰＣ 的 变 构 调 控 方 式 和 机 理 很 复 杂 ， 使 ＰＥＰＣ 的 转 基 因 操 作 得 不 到 预 期 的 结 果 ， 为 此 ＰＥＰＣ 的分子特性需要通过基因工程改造使之更适合转 基 因 操 作 的 要 求 。对 ＰＥＰＣ 分 子 结 构 的 研 究 可 以 为 基 因 工 程 改 造 ＰＥＰＣ 的 分 子 特 性 提 供 理 论 依 据 、为 提 高 Ｃ３ 光 合 作 用 固 定 ＣＯ２ 的 效 率 和 作 物 的 产 量 提 供有益的启示。
差异似乎是在 Ｎ 末端或内部区域中添加或缺失额 外 的 序 列 引 起 的 。有 几 个 高 度 保 守 的 残 基 和 基 序 可 能与酶的活性位点和调控有关， 磷酸化基序在 Ｎ 末 端 附 近 （ Ｅ／ＤＲ／ＫｘｘＳＩＤＡＱＬ／ＭＲ） ， 包 含 有 Ｓｅｒ 靶 点 和 ５ 个 半 光 氨 酸 ， 这 是 植 物 ＰＥＰＣ 中 特 有 的 结 构［１６］。 Ｃ 末端区域包含了许多据推测与活性位点有关的基 序 ， 在 所 有 的 ＰＥＰＣ 中 都 保 持 不 变 的 基 序 （ ＴＡＨＰＴ， ＶＭｘＧＹＳＤＳｘＫＤｘＧ， ＦＨＧＲＧｘｘｘｘＲＧｘｘＰ） 含 与 酶 活 性 有 关 的 特 异 性 Ｈｉｓ， Ｌｙｓ 和 Ａｒｇ 残 基［１６］。但 是 对 ＰＥＰＣ 进化过程中调控特性多样性结构基础的深入了解 仍是个令人向往并还需要继续探索的问题。
所 有 已 知 的 ＰＥＰＣ 均 是 四 聚 体 ， 四 个 相 同 亚 基 的 分 子 量 大 约 为 ９５￣１１０ｋＤａ。 大 多 数 ＰＥＰＣ 是 变 构 酶， 其活性调控方式为变构作用。不同种类生物的 ＰＥＰＣ 有 多 种 变 构 效 应 物［２］。 把 Ｃ４ 光 合 作 用 特 异 性 的 ＰＥＰＣ 基 因 导 入 Ｃ３ 植 物 中 ， 以 期 提 高 Ｃ３ 光 合 作
由 于 ＰＥＰＣ 在 生 理 学 上 的 重 要 性 ， 对 ＰＥＰＣ 酶 学 特 性 的 研 究 很 多 ， 在 过 去 的 １０ 年 里 关 于 ＰＥＰＣ 的一级结构和调控特性方面的研究已取得极显著 的 进 展 ， 最 近 由 于 ＰＥＰＣ 蛋 白 质 晶 体 制 备 技 术 的 改
收稿日期： ２００７－０３－１６ 基金项目： 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目（ ２００５－ ５５） ； 云南省自然科学基金 项目（ ２００４Ｃ０００６Ｒ） ； 云南省中青年学术与技术带头
把 已 知 所 有 的 ＰＥＰＣ 氨 基 酸 序 列 进 行 同 源 性 比 较 ， 发 现 有 １００ 个 氨 基 酸 总 是 保 守 不 变 的 ［１４］。 陆 生 植 物 ＰＥＰＣ 的 相 同 性 超 过 了 ７１％ ［１５］， ＺｍＰＥＰＣ 和 ＥｃＰＥＰＣ 有 ４０％的 同 源 性 ， 除 了 Ｎ 末 端 有 调 节 磷 酸 化 的 位 点 外 ， 大 肠 杆 菌 和 植 物 的 ＰＥＰＣ 非 常 相 似 ［４］。 因 为 Ｃ 末 端 的 高 度 保 守 ， 来 源 不 同 的 ＰＥＰＣ 长 度 的
关键词： 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 大肠杆菌 ＰＥＰＣ 玉米 Ｃ４ 型 ＰＥＰＣ 分子结构
Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｐｒ ｏｇｒ ｅｓｓｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒ ｕｃｔｕｒ ｅ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒ ｕｖａｔｅ Ｃａｒ ｂｏｘｙｌａｓｅ
Ｚｈａｏ Ｙａｎ Ｃｈｅｎ Ｌｉｍｅｉ Ｌｉ Ｋｕｎｚｈｉ
２ ＰＥＰＣ 分 子 的 一 级 结 构
１９８４ 年 ， 首 次 从 已 克 隆 到 的 大 肠 杆 菌 ｐｐｃ 基 因 推 测 出 ＰＥＰＣ 的 一 级 结 构 ［１０］， 目 前 大 约 有 ５０￣６０ 种 来 自 植 物 和 细 菌 ＰＥＰＣ 的 全 长 序 列 被 推 测 出 来 。来 自 不 同 生 物 的 ＰＥＰＣ 多 肽 的 大 小 很 不 一 样 ： 细 菌 为 ８７０ 个 氨 基 酸 （ １００ｋＤａ） ， 高 等 植 物 为 ９７０ 个 氨 基 酸 （ １１０ｋＤａ） ， 蓝 色 细 菌 为 １ ０１０ 个 氨 基 酸 （ １１６ｋＤａ） ， 原 生 动 物 为 １ １５０ 个 氨 基 酸 （ １３４ｋＤａ） 。 ［１１￣１３］ 早 期 对 大 肠 杆 菌 和 蓝 藻 ＰＥＰＣ 的 氨 基 酸 序 列 进 行 了 同 源 性 比 较 ， 结 果 发 现 ＰＥＰＣ 分 子 由 两 个 不 同 的 区 域 构 成， 一个保守区域（Ｃ 末端区） 和一个可变区域（Ｎ 末端区） 。