磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构研究进展_赵艳
引种到青藏高原大田的玉米叶片中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的日变化

引种到青藏高原大田的玉米叶片中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的日变化杨甲定【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2003(29)3【摘要】In the day course of photosynthesis of maize introduced into Tibetan Plateau, during its jointing stage, the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) activity in photosynthetic leaves undulated more gently and was always higher than the net photosynthetic rate(Pn) at every time point. By studying the variation of difference between Pn and PEPC activity throughout the day, the influence of environmental factors(e.g. light intensity and ambient temperature) and stomatal status on photosynthesis was analysed.%引种到青藏高原大田的玉米,其拔节期的全天光合进程中,叶片中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性总是大于相应时间点的净光合速率(Pn),且全天变化幅度较Pn缓和.通过研究PEPC活性和Pn之间差异的全天变化,分析了环境因子(如光强、气温)和气孔状态对光合作用的影响.【总页数】4页(P349-352)【作者】杨甲定【作者单位】中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,甘肃兰州,730000【正文语种】中文【中图分类】Q945.11【相关文献】1.玉米叶片中次生代谢物丁布含量和苯丙氨酸解氨酶活性的关系研究 [J], 李晓辉;黄京华;王艳;刘青;莫建光2.青藏高原大田青稞叶片的净光合速率日变化 [J], 刘志民;杨甲定3.引种于青藏高原的大田玉米研究: 光合作用日变化的特点 [J], 杨甲定;刘志民4.小麦叶片中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的初步研究 [J], 刘永明;刘贞琦;等5.玉米叶片中光合作用的昼夜变化——Ⅲ、伸长叶片组织中叶片的延长速度与碳水化合物和蔗糖代谢酶活性的关系 [J], Willy;Kalt-Torres;Steven;C.Huber;苗青因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建

河南农业科学,2018,47 (5):16-23Journal of Henan Agricultural Sciences d〇i:10. 15933/ki. 1004-3268.2018.05.004玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建曹路遥\周岩14,魏琦超\陈燕绘\陈亚东1!2,蔺一帆\田瑞婷1(1.河南科技学院生命科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心,河南新乡453003;2.河南省华隆生物技术有限公司,河南新乡453003)摘要:为了克隆磷酸晞醇式丙酮酸羧化酶(P E PC ae)的编码基因以用于表达载体的构建,本研究根据已公开的序列信息设计特异性引物,以玉米自交系ZD410的叶片D C A为模板,通过P C R技术成功克隆了 D D基因的全长序列。
生物信息学分析发现,该基因完整0P F长度为2 913 bp,编码蛋白质分子质量约为108. 179 ku,等电点(PI)为5.73;对其氨基酸序列进行同源性检索分析显示,该蛋白质与其他C4植物的P E P C蛋白具有极高的同源性;利用Gateway技术构建含D D目的基因的表达载体,并通过农杆菌介导的花序浸染法将该基因导入野生型拟南芥。
关键词:玉米;磷酸晞醇式丙酮酸羧化酶基因;基因克隆;载体构建;拟南芥'遗传转化中图分类号:S513 文献标志码:A文章编号% 1004 -3268(2018)05 -0016 -08Cloning 〇0 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene from Maize andConstruction of Its Expression VectorCAO Luyao1,ZH0U Yan1*,WEI Qichao1,CHEN Yanhui1,CHEN Yadong1,2,LIN Yifan1,T IT A N Ruiting1(1.School of Life Science and Technology,H enan In stitute of Science an d Technology/H enan Province CollaborativeIn novation Center of M od ern Biological Breeding,Xinxiang453003,China;2.H enan H ualong Biological Technology Co.,Ltd.,Xianxiang453003,China)Abstract%I n o nier to clone the encoding gene of phosjDhoenoljDyruvate carlDoxylase for use in the construction of expression vectors,specific primers were designed b ased on the publislied seque tion,and the leaf DNA of maize inbred line ZD410 was used as a template to succe length sequence of D D gene by PCR.Bioinformatics analysis showed that the length of the complete ORFwas 2 913 b p,the molecular weight of the encoded protein was about 108. 179 k u,and the isoelectricpoint was5. 73. The amino aci(d sequence coded of the gene was homologously showed that the protein was related to the PEPC of o tiier C4plants.Gateway technology wa struct an expression vector containing the target gene_p e$c,and the gene was introduced abidopsis through Agrobacterium tumefaciens-mediated inflorescence dip method.Key words%Maize;pepc gene;Gene cloning;Vector construction;Arabidopsis thaliana;Genetic transformation光合作用是地球碳-氧平衡的重要媒介,是植 物赖以生存的基础,也是决定作物产量高低的重要因素之一。
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展

2021年 2月 Journal of Science of Teachers′ College and University Feb. 2021文章编号:1007-9831(2021)02-0054-07植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展于济1,2,沙伟1,2,张梅娟1,2,马天意1,2(齐齐哈尔大学 1. 生命科学与农林学院,2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室,黑龙江 齐齐哈尔 161006)摘要:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)是广泛存在的一种细胞质酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO3-生成草酰乙酸.PEPC作用的产物在植物的生长发育过程和植物应对环境胁迫反应中起到调控的作用,因而被广泛关注.介绍了植物PEPC的种类、结构特征、不同物种中PEPC基因的克隆与分离、在植物逆境反应中的应用、植物PEPC 的活性调节,为深入研究PEPC基因提供理论依据.关键词:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;植物;植物逆境胁迫中图分类号:Q945 文献标识码:A doi:10.3969/j.issn.1007-9831.2021.02.011Research progress of plant phosphoenolpyruvate carboxylaseYU Ji1,2,SHA Wei1,2,ZHANG Meijuan1,2,MA Tianyi1,2(1. School of Life Sciences,Agriculture and Forestry,2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering andProtection of Biodiversity in Cold Areas,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)Abstract:Plant phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC,EC 4.1.1.31)is a ubiquitous cytoplasmic enzyme that catalyzes the production of Oxaloacetate by phosphoenolpyruvate and HCO3-.The products of PEPC play important roles in the growth and development of plants and the responses of plants to environmental stresses,so that the PEPC is widely concerned.Introduced the types,structural characteristics,the cloning and isolation of PEPC genes in different species,the applications in plant stress responses,and the researches of plant PEPC activity regulation,which provides a theoretical basis for further studiesof PEPC genes.Key words:phosphoenolpyruvate carboxylase;plant;plant stress responses磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)是一种胞质酶,在HCO3-存在的情况下,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)的β-羧化反应,以Mg2+为辅因子生成草酰乙酸(Oxobutanedioic acid,OAA)和无机磷酸[1]70,此反应为不可逆反应.PEPC存在于所有植物中,如绿藻、蓝细菌、大多数古细菌、非光合细菌中,但在动物和真菌中不存在[2]15. PEPC以其在C4和景天酸代谢(Crassulacean acid metabolism,CAM)光合作用中的作用而闻名,在此过程中,其初步固定了大气中的CO2[3]274.然而,PEPC在C3植物的非光合和光合组织中也发挥着广泛的作用,它可以通过补充C4-二羧酸进行能量和生物合成代谢,主要起抗衰老作用[4-5].在C3植物叶片和非光合收稿日期:2020-11-15基金项目:齐齐哈尔大学大学生创新创业训练计划项目(202010232817);黑龙江省省属高等学校基本科研业务费青年创新人才项目(135309364);黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目植物性食品加工技术特色学科专项(YSTSXK201876);黑龙江省人力资源和社会保障厅2018年省级留学回国人员择优资助项目作者简介:于济(1997-),女,吉林松原人,在读硕士研究生,从事植物逆境分子遗传学研究.E-mail:*****************通信作者:马天意(1989-),男,黑龙江齐齐哈尔人,讲师,博士,从事植物逆境分子遗传学研究.E-mail:********************组织中,PEPC的主要作用是在三羧酸循环中补充中间体,以及后面的氮同化和各种生物合成途径[3]274.此外,PEPC还参与了广泛的生理和发育过程,包括种子萌发和发育、果实成熟、豆科植物根瘤固氮等,在气孔保卫细胞中提供苹果酸以及增强了对渗透压和生物胁迫的耐受性[2,6-9].正是因为PEPC在植物中发挥着非常重要的作用,因此被人们广泛关注.为了更好地了解植物体中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的作用机制,本文概括分析了植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分类、功能、分离与克隆、活性调节以及在植物抵抗逆境过程中的作用等方面的研究结果,介绍了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在基因工程方面的应用,也为进一步研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因提供了理论基础.1 PEPC的基本结构1984年,首先从大肠杆菌(Escherichia coli)克隆的PEPC基因推导了PEPC的一级结构[10].目前,已经分别在植物和细菌中发现了许多PEPC序列,包括同一生物体中的同工型,并且大约500个部分序列已经记录在GenBank中,主要用于系统发育重建[11-12].系统进化树显示,这些PEPC是从相同的祖先进化而来的[3,13].PEPC多肽的大小随生物体的种类而异:细菌、维管束植物、蓝细菌、原生动物(如疟疾病原体)的氨基酸残基数量大约为870(100 kDa),970(110 kDa),1010(116 kDa)或1150(134 kDa)[1]71.尽管已知古细菌的亚基大小非常小(约60 kDa),并且没有常见的变构调节子,但尚无来自古细菌的PEPC 序列数据[14-15].此外,还寻找了藻类PEPC的序列数据,因为硒的纯化亚型之一是由3种不同的亚基组成的[16],这种新的PEPC类型也在发育中的蓖麻(Ricinus communis)种子中被发现[17].在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列中确定了另一种新的进入高等植物PEPC的第4种亚型[18],在分子大小上与蓝细菌的PEPC相似,并且缺少N端磷酸化位点,这是植物PEPC的标志.在植物和微生物界的多样性和广泛分布使得PEPC成为系统发育分析中最有趣的目标之一.对PEPC序列的比对表明,大约100个残基始终是保守的(相同的),另外100个残基是保守的具有相似的氨基酸残基的,对于成对的陆地植物酶,其识别率超过71%,因为C末端是高度保守的,所以长度的任何差异似乎是由于在N末端或内部区域(大约10个基因位点)处添加或插入了额外的序列而引起的.所制备的重组PEPCs的数量和特征仍是有限的,所涉及的物种目前不超过15个[1]71,因此有必要做进一步的工作.2 植物PEPC的分类及生理生化功能PEPC基因已大致分为2个亚家族,分为植物型PEPC(PTPC)和细菌型PEPC(BTPC)[19]11.PTPC表现出高度的遗传保守性,并在其100~110 kDa蛋白质中包含高度保守的N末端丝氨酸磷酸化基序和关键的C末端四肽QNTG[1,20].相比较而言,116~118 kDa的BTPC蛋白质显示低序列相似性并包含1个类似原核的C端(R/K)NTG四肽基序[17,21].PTPC典型地存在于同型四聚体-1类PEPCs中,而BTPCs作为调节和催化亚基存在于超常的异质配合物中(2类PEPCs)[2]26.PTPC又可以分为C4,C3和根特异亚型[21-22],它们在植物细胞中发挥着不同的功能.植物中PEPC的C3,C4类型至少在3个关键方面不同[23]:(1)C4型的PEPC通过吸收C4和CAM物种中的大气CO2参与了CO2浓缩机制的第1步,C3型PEPC存在于所有植物中,它参与多种生理功能,如三羧酸循环中中间体的补给,OAA的合成以及随后的苹果酸及其衍生物的合成[2]15.(2)C4型PEPC存在于叶肉细胞中,其表达方式对实现C4光合循环具有重要意义[24],而C3型的PEPC分布在C3和/或C4植物的不同组织中,起到管家的作用[22]865.(3)C4型PEPC的底物(PEP)饱和常数(Km)高于C3型,并且显示更多对苹果酸的耐受性,但是在一些植物物种中(如南美白菊科(Chenopodiaceae)植物和异子蓬(Suaedaaralocaspica))尚未将不同的PEPC区分为C3或C4类型,仅命名为ppc-1,ppc-2[25],它们的功能需要进一步验证.3 植物PEPC基因的分离与克隆1953年,植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶从菠菜(Spinacia oleracea)叶中首次被分离出来.目前,PEPC基因已在多种植物中被鉴定和研究,拟南芥和水稻(Oryzasativa)中分别报道4,6个PEPC家族成员[18,26],在大豆(Glycine max)中共鉴定到10个PEPC基因(GmPEPC1~10),其中GmPEPC6,GmPEPC8,GmPEPC9被铝毒、寒害、盐害等非生物胁迫诱导表达[27].花生(Arachis hypogaea)基因组报道5个PEPC 基因(AhPEPC1~5)[28],涂嘉琦[29]等从蔓花生(Arachis duranensis)基因组中鉴定到9个PEPC基因.马海洋[30]等从菠萝(Ananas comosus)基因组中鉴定出3个PEPC基因.邵姁[31]等从蓝莓(Vaccinium corymbosum)果实中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因VcPEPC,该基因开放阅读框全长为2 907 bp,可编码968个氨基酸,分子量为110.59 kD.赵晋锋[32]等从谷子(Setariaitalica)基因组中鉴定出1个SiPEPC基因,进一步研究表明,SiPEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测SiPEPC基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其它逆境胁迫信号途径中起关键作用.4 植物PEPC基因在植物逆境反应中的作用非生物胁迫(如盐度、干旱、高温)通常会对植物的光合作用产生负面影响[33]901.PEPC已被建议用于支持主要的生理代谢途径(即三羧酸循环中中间体的补给等),以帮助植物和微生物避免和/或耐受极端的环境胁迫[7,34].在水分胁迫下,PEPC介导PEP的羧基化为OAA,随后合成苹果酸和渗透活性化合物(糖、氨基酸、糖醇)以帮助植物耐受水分胁迫[34-35].铝的积累、磷和铁的缺乏导致PEPC的上调,从而增加了包括苹果酸和柠檬酸在内的有机酸合成[36-38].有机酸向土壤中的排泄不仅可以增加磷和铁的可溶性形态并为植物所利用,还可以与Al3+形成稳定的配合物,从而降低毒性[39].生物应激(如病毒感染)也可以诱导PEPC的高活性,推测PEPC可以在防御作用中增强植物抗毒素、氨基酸、蛋白质的合成[40-41].也有研究表明,番茄(Lycopersicon esculentum)PEPC基因在盐、冷、植物激素胁迫下均有不同表达[19]15.可以推测PEPC 对植物的生长发育和抗逆性起一定作用.5 PEPC基因的应用目前,已经在多种植物物种中使用了不同PEPC基因作为改善作物的手段.如在水稻中,C4-PEPC使转基因水稻具有耐旱性,但叶绿体定位的PEPC对铵同化至关重要[42].玉米(Zea mays)C4型PEPC基因在小麦(Triticum aestivum)受体内实现了正确的转录和准确的剪接,也证明了玉米C4型PEPC基因在小麦中表现了一定的光合生理效应[43].以转甘蔗(Saccharum officinarum)PEPC基因的籼稻植株和非转基因的植株为研究材料,发现在光合效率和产量相关性状方面,转甘蔗PEPC基因植株都有较大提高,可以实现增产目的[44].张桂芳[45]等首次将含有稗草(Echinochloacrusgalli)根型的PEPC基因对水稻进行遗传转化,研究结果表明,转基因水稻的PEPC活性最高,为对照的5.85倍,植株叶片的净光合速率(Pn)较对照相比提高了20.0%.尹吴[46]等发现,与对照相比,转玉米PEPC基因的杨树表现出较强的光利用能力,其羧化能力和酶活性与对照相比最高可分别增加62.3%,38.6%.最近有研究表明,许多PEPC基因在增强对各种非生物和生物胁迫的耐受性中起调节作用.在干旱和盐胁迫下,PEPC的过度表达增强了耐受性[8]1513,但抑制导致转基因植物对渗透胁迫的敏感性增加[47].同样,拟南芥AtPPC4也可能在干旱胁迫中发挥作用[33]906.然而,表达PEPC的马铃薯(Solanum tuberosum)转基因植株表现出整体有机氮含量的增加,但淀粉和可溶性糖含量有所损失[48].6 植物组织中PEPC的活性调节PEPC通常由4个相同的亚基组成,相对分子质量约为95~110 kDa.大多数PEPC是变构酶,具有多种变构效应物,具体取决于生物的种类[1]70.此外,维管植物PEPCs通过位于N末端附近的保守丝氨酸处的可逆磷酸化来调节[49].目前解析了来自大肠杆菌和玉米的PEPC三维结构[50-51],这种结构信息以及通过定点诱变获得的信息为长期以来一直深入研究的催化和变构调节的分子机理提供了启示. 大多数PEPC都受变构调节,维管植物的效应仅限于一组效应类型,双子叶植物的PEPCs被葡萄糖6-磷酸(G6P)激活,并被L-苹果酸或天冬氨酸抑制,而单子叶植物的PEPC被甘氨酸或丙氨酸进一步激活[52]154.相反,大肠杆菌PEPC受更复杂的方式调节,被乙酰辅酶A、果糖1,6-双磷酸、长链脂肪酸、鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸激活,并被天冬氨酸或L-苹果酸抑制[53].此外,细菌PEPC中不存在的调节性磷酸化是植物PEPC中固有的[1]73.调节性磷酸化后,PEP的半饱和浓度略有降低,而抑制剂的半饱和浓度在包含底物和Mg2+生理浓度的反应混合物中增加了约2.7倍[52]155.Tovar-Mendez[52,54-55]等采用目前可用的最明确的玉米C4-PEPC制剂进行了全面的动力学分析,从生理条件下的动力学测量清楚地表明了变构效应子和磷酸化的重要性.S形PEP饱和度曲线归因于附加的PEP与G6P位点的结合[1]73,这些研究成功地应用了变构调控的协调过渡模型来描述玉米C4-PEPC的动力学行为,并且通过快速动力学分析观察到伴随变构过渡的构象变化[56].PEPC的活性在多个层次上受到调节.变构控制由调节PEPC活性(尤其是在细胞质pH值下)的正(葡萄糖6-P,甘氨酸)、负(L-苹果酸,天冬氨酸)效应子施加[3]280.此外,C4-PEPC通过光依赖性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase,PEPCK)进行调节性磷酸化[57].PEPC的磷酸化形式与去磷酸化形式的动力学性质不同,如更高的最大反应速率对PEP的亲和力更高,对变构效应子的敏感性有所改变,从而减轻了苹果酸对其抑制作用,并增强了其对葡萄糖-6-P和甘氨酸的活化作用[58-59].高粱(Sorghum bicolor)中所有PTPC(SbPPC1-5)均含有带有保守丝氨酸的N末端磷酸化结构域,BTPC (SbPPC6)中不存在此域,PEPCK基因家族包括3个基因(SbPPCK1~3)[60],在叶肉细胞中,SbPPCK1的表达是由光触发的,其转录本在叶肉中比束鞘细胞更为丰富,由于这些原因,它被认为是光合异构体,其中SbPPCK2和SbPPCK3的功能未知[61].另一种可能调控PEPC活性的翻译后修饰(Post-translational modification,PTM)是保守的赖氨酸残基的单泛素化作用,使该酶对苹果酸和天冬氨酸更加敏感[62-64].据报道,该PTM(仅针对C3型PEPCs)存在于蓖麻种子[62]、Hakea prostata种子[63]、高粱种子[64-65]、拟南芥叶片[65-66]中.此外,在不同的植物组织(叶片、保卫细胞、根、果实)[67-70]以及大麦(Hordeum vulgare)、小麦、高粱种子[71-74]中还报道了2条免疫反应性PTPC条带,表明上部条带是下部条带的单泛素化形式.PEPC改变了该酶的动力学特性,从而干扰了其与PEP结合的能力,并增强了其对大多数代谢物效应子的敏感性[62]29656.7 展望植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作为C4型光合途径的关键酶,对其结构特点、代谢途径已有较为深入的研究[75].现在PEPC基因已经在越来越多的植物中被发现,并对其功能进行研究探索.在C4和CAM植物中,PEPC的作用以及其基因表征信息比较详细,但在C3植物中PEPC表达的细节报道很少,仍需进一步探索.转PEPC基因植物也在不同方面表达出PEPC基因对植物的调控功能,PEPC作为植物中广泛存在的酶,其在植物应对环境胁迫过程中的作用逐渐被发现,尤其是CAM植物中的大多数物种具有较高抗逆性,而这之中PEPC的相关功能机制还有待进一步挖掘,因此有必要进一步对PEPC基因在植物抗逆性研究中的作用进行详细探索.参考文献:[1] Izui K,Matsumura H,Furumoto T,et al.Phosphoenolpyruvate carboxylase:a new era of structural biology[J].Annual reviewof plant biology,2004,55:69-84[2] O′Leary B,Park J,Plaxton W C.The remarkable diversity of plant PEPC(phosphoenolpyruvate carboxylase):recent insightsinto the physiological functions and post-translational controls of non-photosynthetic PEPCs[J].The biochemical 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植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展

摘 要 :磷 酸 烯 醇 式 丙 酮酸 羧 化 酶 ( P h o s p h o e n o l p y r u v a t e
c a r b o x y l a s e , P E P C) , 是一 个广泛存在 于细菌 、 古细 菌、 蓝 藻细胞 、
绿 藻、 原 生动 物 和 维 管植 物 中的 细 胞 质 酶 。P E P C在 植 物 种 子 萌
发、 种子的形成、 调节有机酸类的代谢 、 抗生物和非生物胁迫 中有
重要 的作 用 。本 研 究主 要 介 绍 了植 物 P E P C种类、 结构、 P E P C 在
植 物 中的作 用, 及其在基 因工程 方面的研 究。 关 键词 : P E P C; 特征 ; 功 能 基 因 工程
f u c t i o ng s o f PEPC i n p l a n t an d t he p r o g r e s s i n g e n e t i c e n g i n e e r i n g o fPEPC. Key wor  ̄ :Ph o s pho en o l py mv a t e c a r bo x yl a s e;
国 土 与 自 然 资 源 研 RI TORY & NATURAL RES O URCES ST UDY
2 01 7 No . 5
文章编 号 : 1 0 0 3 — 7 8 5 3 ( 2 0 1 7 ) 0 5 — 0 0 8 6 — 0 4
包括 : 种子萌发和形成【 、 调 节 保卫 细胞 [ 4 ] 、 促 进 苹 果 酸
血清学诊断中结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶的应用

血清学诊断中结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶的应用柏雪莲;魏庆宽;李瑾;李桂萍【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2008(48)10【摘要】[目的]在原核系统中表达结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car-boxykinase PEPCK),并研究该蛋白在诊断结核病人血清抗体中的应用价值.[方法]应用基因重组技术表达重组蛋白结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶,经亲和层析法纯化表达产物.用表达的重组蛋白免疫小鼠,研究其免疫学特性.间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测结核病人血清中特异性IgG抗体,并与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒检测结果对比.[结果]试验表明转化入大肠杆菌中的重组质粒能够表达并纯化出相对分子量为72 kDa的重组蛋白;Western blot证实重组蛋白能够与小鼠抗BCG血清发生特异性反应;重组蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中的抗体滴度可达1∶1280以上;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测病人血清阳性率为17.3%(30/173),其中排菌病人的阳性率为32.5%(13/42),不排菌病人的阳性率为12.9%.该方法结果与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒的检测结果相比,敏感性为51.0%,特异性为96.7%.[结论]结核杆菌PEPCK具有较好的免疫原性和抗原性,有可能作为结核病血清学诊断的一组抗原之一.【总页数】4页(P1383-1386)【作者】柏雪莲;魏庆宽;李瑾;李桂萍【作者单位】山东省滨州医学院病原生物学教研室,滨州,256603;山东省寄生虫病防治研究所,济宁,272033;山东省寄生虫病防治研究所,济宁,272033;山东省寄生虫病防治研究所,济宁,272033【正文语种】中文【中图分类】Q93-3【相关文献】1.葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA在梗阻性黄疸及胆道再通大鼠中的表达及意义 [J], 温暖;邬善敏;陈辰;蔡杰;卢超2.共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和烟酸转磷酸核糖激酶提高重组大肠杆菌发酵木糖产丁二酸 [J], 陈旭;梁丽亚;刘嵘明;万青;吴明科;姜岷3.小檗碱对2型糖尿病中国地鼠肝脏葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA表达的影响 [J], 刘栩晗;李国生;朱华;黄澜;刘亚莉;马春梅;秦川4.Microbulbifer sp.A4B-17菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶与烯醇化酶研究 [J], 刘曹彤;陆依琳;徐慧;彭学5.脂联素对大鼠肝细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性影响的研究 [J], 龚明;李超林;肖谦;黄昶荃因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及序列分析

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及序列分析王重;樊哲儒;张跃强;李剑峰;高新【摘要】Objective] To clone the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene obtained from Zea mays and analyze it by bioinformatics. [ Method] Primarily, the cDNA clone was constructed by RT-PCR amplified with the gene specific primers, then positive clones were se-quenced and analyzed by bioinformatics.[ Result] The electrophoresis showed that the coding sequence( CDS) of PEPC gene in Zea mays was 2 913 bp and the polypeptide chains coded by PEPC included 926 amino acids, which were hydrophobic amino acids consists of-helix (61.44%), random coil (34.43%) and extended strand (4.12%), with located in the cytoplasm.There was no transmembrane domain. The 175-970 amino acid composition the functional domains of phosphoenolpyruvate carboxylase, in 173-184;597-609 bits had two phos-phoenolpyruvate carboxylase active site with pyruvate orthophosphate dikinase basing on amino acids sequences comparison.[ Conclusion] The PEPC gene in Zea mays has been obtained and the amino acids sequence coded by the gene was conserved and contained active catalyst central site of PEPC.%[目的]获得玉米的PEPC基因,并对其生物信息学进行分析。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在c4途径中的作用

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在c4途径中的作用
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)是C4途径中非常重要的酶之一。
C4途径是一种植物的光合作用运作方式,主要用于增加CO2浓度,提高光合作用效率。
PEPCK与此过程密
切相关,它可先将光合作用的产物三羧酸循环酸(TCA)循环中的草酰乙酰辅酶A(CoA)转化成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP), 然后PEP进入C4途径之后,就能在小细胞光合体中被羧
化为草酸(OAA),以便在大细胞中再次被羧化为PEP, 从而为二氧化碳固定和尤其是碳同化提供“CO2泵”的作用。
PEPCK作用机理的主要是利用PEPCK磷酸酯化活力。
磷酸酯化是将能否转移磷酸的基
团特定加入到分子中的化学反应。
PEPCK能够通过将磷酸基元从ATP中转移,并将其与磷
酸烯醇式丙酮酸结合,从而生成草酸的过程中,驱动C4途径的整个过程,该过程还需要羧化酶以及其他辅助分子的帮助。
PEPCK的代谢途径非常复杂,但是其核心思想是将PEPCK磷酸酯化活力和其能够转化
在不同代谢途径中的小分子相结合,从而从代谢中提取能源和/或产生新的代谢中间产物。
PEPCK所涉及的代谢途径包括糖原分解,葡萄糖合成,乳酸脱氢酶活性,磷酸肌酸途径和
碳酸酐途径等等,它们在代谢途径中的平衡状态受到一系列内外部信号的调节。
总体来说,PEPCK在C4途径中的作用就是促进了草酸的产生,草酸在C4途径中的后续轮回中可以不断的进行反复羧化和去羧化反应,将CO2转移至大细胞进行碳同化反应,提
高植物的光合作用效率,增加CO2利用效率。
同时,PEPCK也参与了很多其他的代谢途径,其作用机理在以上所述的途径中有所不同,但它的作用对于整个代谢系统非常重要。
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究李艳;许为钢;胡琳;张磊;齐学礼;张庆琛;王根松【期刊名称】《麦类作物学报》【年(卷),期】2009(29)5【摘要】为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR 方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数。
PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPCcDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株。
初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料。
【总页数】6页(P741-746)【关键词】小麦;玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);高效表达载体;转基因;拷贝数【作者】李艳;许为钢;胡琳;张磊;齐学礼;张庆琛;王根松【作者单位】河南农业大学农学院;河南省农业科学院小麦研究中心【正文语种】中文【中图分类】S512.1;S336【相关文献】1.小麦导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的初步研究 [J], 张彬;马建军;贾栋;石云鹭;高志强;丁在松2.小麦导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的初步研究 [J], 张彬;马建军;贾栋3.玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建 [J], 曹路遥;周岩;魏琦超;陈燕绘;陈亚东;蔺一帆;田瑞婷4.香格里拉水韭磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的克隆及其表达载体构建 [J], 鲁维维;刘星5.香格里拉水韭磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的克隆及其表达载体构建 [J], 鲁维维;刘星因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
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Abs tra ct: Phosphoenolpyruvate carboxylase( PEPC) is widespread in higher plants, algae and many kinds of bacteria. It catalyzes the first step of CO2 fixation in C4 photosynthesis.R emarkable advances were achieved in the studies on its primary structure in the past ten years.R ecently, the three dimensional structures of E.coli PEPC and maize C4- form PEPC was revealed by X- ray crystallographic analysis.This review describes the exciting progresses for PEPC.
Ke y words : Phosphoenolpyruvate carboxylase E.coli PEPC Maize C4- form PEPC Molecular structure
PEPC ( EC 4.1.1.31) 以 Mg2+或 Mn2+为 辅 助 因 子 , 催 化 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 ( PEP) 和 HCO3- 生 成 草 酰 乙 酸 ( OAA) 和 无 机 磷 酸 的 不 可 逆 性 反 应 。 PEPC 广 泛 存 在 于 光 合 生 物 , 如 植 物 、藻 类 、蓝 细 菌 和 光 合 细菌中, 还存在于很多非光合细菌和原生动物中。 PEPC 催 化 的 反 应 为 细 胞 各 种 组 分 的 生 物 合 成 提 供 四碳二羧酸, 参与维持柠檬酸循环, 在初级代谢中 有 重 要 的 补 给 作 用 , 在 C4 植 物 和 CAM 植 物 的 光 合 作 用 中 催 化 大 气 中 CO2 固 定 的 第 一 步 反 应 , 是 C4 光 合 作 用 途 径 中 最 重 要 的 酶 之 一[1]。
3 PEPC 蛋 白 质 晶 体 的 特 征
要 详 细 了 解 PEPC 的 分 子 结 构 , 需 要 获 得 高 分 辨 率 的 蛋 白 质 晶 体 。通 过 对 PEPC 分 子 特 性 的 深 入 研 究 , Izui[5]的 实 验 室 建 立 了 一 种 从 E.coli 中 制 备 大 量 高 纯 度 PEPC 的 快 速 而 又 简 单 的 方 法 , 他 们 用 hexyl-spharose 做 疏 水 性 层 析 柱 并 用 变 构 抑 制 剂 L- Asp 特 异 性 洗 脱 纯 化 到 均 匀 一 致 的 EcPEPC 蛋 白 。 之后他们又用一种改进的方法, 从玉米叶子中纯 化 到 ZmPEPC[6]。此 后 Izui 和 Kai 的 实 验 室 合 作 开 展 PEPC 蛋 白 质 晶 体 的 X-射 线 衍 射 研 究 , 他 们 发 现 低 分 子 量 的 PEG 是 PEPC 结 晶 化 过 程 的 一 个 非 常 好 的 沉 淀 剂[4]。1999 年 利 用 从 大 肠 杆 菌 中 纯 化 出 来 的 PEPC 与 它 的 变 构 抑 制 剂 Asp 形 成 的 复 合 物 制 成 EcPEPC 蛋 白 质 晶 体 , 这 种 高 质 量 的 蛋 白 质 晶 体 可 用 于 X-射 线 衍 射 分 析 , 分 辨 率 达 到 2.8A, 因 为 在 这 个 晶 体 中 PEPC 与 变 构 抑 制 剂 Asp 结 合 , 因 此 酶 处 于 无 活 性 状 态 ( T 状 态 ) [7]。 最 近 他 们 又 发 表 了 从 玉 米 叶 片 中 纯 化 到 的 ZmPEPC 蛋 白 质 晶 体 的 结 构 , 分 辨 率 达 3A[4], 这 是 首 次 报 道 的 植 物 PEPC 的 三 维 结 构 。 在 ZmPEPC 的 结 晶 溶 液 中 含 有 5mM 苹 果 酸 和 高 浓 度 的 乙 二 醇 ( 20%) , 据 报 道 高 浓 度 的 乙 二 醇 有 如 ZmPEPC 变 构 激 活 剂 一 样 的 动 力 学 行 为 , 它 的 存 在 使 5mM 的 抑 制 剂 苹 果 酸 对 ZmPEPC 的 催 化 活 性 没 有 影 响 [17], 因 此 在 ZmPEPC 晶 体 中 酶 处 于 活 性 状 态 ( R 状 态 ) 。对 高 质 量 的 ZmPEPC 与 EcPEPC 蛋 白 质 晶 体 进 行 X-射 线 衍 射 分 析 阐 明 了 PEPC 分 子 的 三维结构。
人培养费; 昆明理工大学人才培养费联合资助 作者简介: 赵艳( 1982-) , 女, 云南昆明人, 在读硕士研究生, E-mail: zhaoyankm@126.com 通讯作者: 陈丽梅, 女, 教授, 硕士生导师
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2007 年第 5 期
用 效 率 , 是 目 前 植 物 基 因 工 程 的 一 个 研 究 热 点 [3]。 研 究 结 果 发 现 在 转 基 因 植 物 中 PEPC 的 活 性 也 如 同 在 C4 植 物 中 一 样 , 受 代 谢 产 物 如 苹 果 酸 , 6-磷 酸 葡 萄 糖 ( Gluc6-P) 和 可 逆 性 磷 酸 化 的 共 价 修 饰 调 控 [4]。 由 于 PEPC 的 变 构 调 控 方 式 和 机 理 很 复 杂 , 使 PEPC 的 转 基 因 操 作 得 不 到 预 期 的 结 果 , 为 此 PEPC 的分子特性需要通过基因工程改造使之更适合转 基 因 操 作 的 要 求 。对 PEPC 分 子 结 构 的 研 究 可 以 为 基 因 工 程 改 造 PEPC 的 分 子 特 性 提 供 理 论 依 据 、为 提 高 C3 光 合 作 用 固 定 CO2 的 效 率 和 作 物 的 产 量 提 供有益的启示。
差异似乎是在 N 末端或内部区域中添加或缺失额 外 的 序 列 引 起 的 。有 几 个 高 度 保 守 的 残 基 和 基 序 可 能与酶的活性位点和调控有关, 磷酸化基序在 N 末 端 附 近 ( E/DR/KxxSIDAQL/MR) , 包 含 有 Ser 靶 点 和 5 个 半 光 氨 酸 , 这 是 植 物 PEPC 中 特 有 的 结 构[16]。 C 末端区域包含了许多据推测与活性位点有关的基 序 , 在 所 有 的 PEPC 中 都 保 持 不 变 的 基 序 ( TAHPT, VMxGYSDSxKDxG, FHGRGxxxxRGxxP) 含 与 酶 活 性 有 关 的 特 异 性 His, Lys 和 Arg 残 基[16]。但 是 对 PEPC 进化过程中调控特性多样性结构基础的深入了解 仍是个令人向往并还需要继续探索的问题。
所 有 已 知 的 PEPC 均 是 四 聚 体 , 四 个 相 同 亚 基 的 分 子 量 大 约 为 95 ̄110kDa。 大 多 数 PEPC 是 变 构 酶, 其活性调控方式为变构作用。不同种类生物的 PEPC 有 多 种 变 构 效 应 物[2]。 把 C4 光 合 作 用 特 异 性 的 PEPC 基 因 导 入 C3 植 物 中 , 以 期 提 高 C3 光 合 作
由 于 PEPC 在 生 理 学 上 的 重 要 性 , 对 PEPC 酶 学 特 性 的 研 究 很 多 , 在 过 去 的 10 年 里 关 于 PEPC 的一级结构和调控特性方面的研究已取得极显著 的 进 展 , 最 近 由 于 PEPC 蛋 白 质 晶 体 制 备 技 术 的 改
收稿日期: 2007-03-16 基金项目: 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目( 2005- 55) ; 云南省自然科学基金 项目( 2004C0006R) ; 云南省中青年学术与技术带头
把 已 知 所 有 的 PEPC 氨 基 酸 序 列 进 行 同 源 性 比 较 , 发 现 有 100 个 氨 基 酸 总 是 保 守 不 变 的 [14]。 陆 生 植 物 PEPC 的 相 同 性 超 过 了 71% [15], ZmPEPC 和 EcPEPC 有 40%的 同 源 性 , 除 了 N 末 端 有 调 节 磷 酸 化 的 位 点 外 , 大 肠 杆 菌 和 植 物 的 PEPC 非 常 相 似 [4]。 因 为 C 末 端 的 高 度 保 守 , 来 源 不 同 的 PEPC 长 度 的
关键词: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 大肠杆菌 PEPC 玉米 C4 型 PEPC 分子结构
Resear ch Pr ogr esses on the Molecular Str uctur e of Phosphoenolpyr uvate Car boxylase
Zhao Yan Chen Limei Li Kunzhi
2 PEPC 分 子 的 一 级 结 构
1984 年 , 首 次 从 已 克 隆 到 的 大 肠 杆 菌 ppc 基 因 推 测 出 PEPC 的 一 级 结 构 [10], 目 前 大 约 有 50 ̄60 种 来 自 植 物 和 细 菌 PEPC 的 全 长 序 列 被 推 测 出 来 。来 自 不 同 生 物 的 PEPC 多 肽 的 大 小 很 不 一 样 : 细 菌 为 870 个 氨 基 酸 ( 100kDa) , 高 等 植 物 为 970 个 氨 基 酸 ( 110kDa) , 蓝 色 细 菌 为 1 010 个 氨 基 酸 ( 116kDa) , 原 生 动 物 为 1 150 个 氨 基 酸 ( 134kDa) 。 [11 ̄13] 早 期 对 大 肠 杆 菌 和 蓝 藻 PEPC 的 氨 基 酸 序 列 进 行 了 同 源 性 比 较 , 结 果 发 现 PEPC 分 子 由 两 个 不 同 的 区 域 构 成, 一个保守区域(C 末端区) 和一个可变区域(N 末端区) 。